生化分析技術綜合課件

05十二月20221生化分析技術綜合05十二月20222生化分析的范疇有效成分的提取和純化有效成分性質的分析有效成分組成及結構的分析有效成分的功能分析05十二月20223第一章生命大分子物質的制備生命大分子物質的特點：1、生命大分子是動物、植物和微生物在進行新陳代謝時所產生的活性物質2、生命大分子的特殊性和復雜性3、生命大分子都是由簡單的小分子構成的物4、具有特殊的結構和功能5、生命大分子不穩(wěn)定05十二月20225選材原則：①含有效成分豐富、穩(wěn)定性好；②來源豐富、保持新鮮；③材料適合加工提??；④具有經濟利用價值。組織差異性時間差異性生理狀態(tài)差異性研究對象的選擇05十二月20226生物材料選定后，最好及時使用。如不能及時使用時，應做好材料的處理工作以免有效成分的破壞。二、材料的處理動物臟器冰凍干燥植物組織微生物05十二月20227第二節(jié)確立測定方法尋找哪些生物材料中含有有效成分監(jiān)測有效成分提純程度光譜法吸收光譜熒光光譜濁度分析電化學法生物活性檢測法免疫分析法05十二月20228吸收光譜根據有效成分的顏色、對紫外吸收能力進行測定；利用有效成分與生色基團所進行的特殊的呈色反應進行測定。熒光法：利用有效成分所進行的特殊的化學反應并偶聯NAD＋或NADP＋的還原反應產生NADH或NADPH。還原型尼克酰胺發(fā)熒光。也可利用NAD和NADP的光譜變化進行測定05十二月202210比色法葡萄糖＋O2

＋H2O葡萄糖酸＋H2O2葡萄糖氧化酶H2O2＋酚＋4－AAP醌亞胺＋H2O濁度法：測定懸浮液在不被吸收的波長下表觀的消光值。電化學法：測定反應過程中H＋的濃度變化從而計算出有效成分含量。生物活性檢測免疫分析法05十二月202212機械破碎法搗碎法研磨法勻漿法物理破碎法溫度差破碎法壓力差破碎法超聲破碎法化學破碎法利用化學滲透的方法，通過有機溶劑、抗生素、表面活性劑、金屬熬合劑、變性劑等，使細胞膜破碎的方法。酶促破碎法利用酶的活性破壞細胞膜的化學結構使細胞膜破碎的方法。05十二月2022144、溫度5、攪拌6、氧化7、金屬離子8、抽提液與抽提物的比例第五節(jié)濃縮沉淀法吸附法超過濾法透析法減壓蒸餾法冰凍干燥法05十二月20221505十二月20221605十二月20221705十二月20221805十二月202220純化方案的設計純化方案是由幾種分離方法組成的，因此，設計純化方案時，首先要選擇分離方法。選擇分離方法的依據主要根據有效成分與雜質間的理化性質的差異選擇分離方法。05十二月202221根據溶解度的差異進行的分離根據分子大小的差異進行的分離根據分子極性的差異進行的分離根據分子所帶電荷的差異進行的分離根據生物分子間特異結合性質進行的分離等第六節(jié)純化方案的設計與評價05十二月202223純化方案的評價：是對組成純化方案的每一種分離方法的評價。有效成分的含量測定比活力測定()活力單位數毫克蛋白純化倍數()每步的比活力粗提液比活力收得率(×100％)每步的總活力粗提液總活力評價指標05十二月202224L－門冬酰胺酶的純化

步驟總蛋白/g總活力/U比活力/(U/mg)純化倍數回收率/%1粗提液30g210000.711002氧化錳處理7.64g150172.02.8723冰凍融解5.58g148722.73.8714DEAE-纖維素層析0.113g502544.563.5245硫酸銨鹽析0.048g336771.7102176羥基磷灰石0.016g3133200286157聚丙烯酰胺凝電泳0.012g31002553651505十二月202226非膜過濾膜過濾粗濾微濾(微孔過濾)常壓過濾加壓過濾減壓過濾超濾反滲透電滲析05十二月202227利用過濾介質而使不同大小、不同形狀的物質彼此分離的方法稱過濾。05十二月202228正膠束的結構05十二月202230二、制備蛋白質(一)鹽析法鹽溶：在低鹽濃度條件下，蛋白質的溶解度隨鹽濃度的升高而增加的現象稱鹽溶。鹽析：在高濃度鹽溶液中，蛋白質的溶解度隨鹽濃度的升高而降低的現象稱鹽析。05十二月202231蛋白質的荷電性發(fā)生了變化蛋白質表面的水化膜發(fā)生了變化鹽的存在之所以能使蛋白質進行鹽溶或鹽析是因為鹽改變了溶液的離子強度。在離子的作用下，蛋白質發(fā)生了如下的變化：05十二月202232蛋白質在溶液中的溶解度與溶液的離子強度的關系為：lg=-KsISS0在溫度和pH一定的條件下，S0為一常數。上式可改為：lgS=lgS0-KsI=β-KsI1、鹽析的原理05十二月202233Ks為鹽析系數，主要決定于鹽的性質。其大小與離子價數成正比、與離子半徑和溶液的介電常數成反比。β主要決定于蛋白質的性質，也與溫度和pH有關。在溫度和pH一定時，β為一常數。(1)鹽分級沉淀鹽的選擇05十二月202234鹽的選擇在鹽析過程中選擇鹽時一般遵循以下的原則：①在水溶液中的溶解度大，能提供足夠的離子強度；②鹽的溫度系數要小，溫度對溶解度的影響??；③價格要便宜，減少生產成本。最常用的鹽是硫酸銨，此外硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等也有使用。硫酸銨濃度的調整方法飽和度是溶液中加入的飽和硫酸銨溶液的體積與混合溶液總體積之比值。05十二月202235鹽析時的注意事項硫酸銨的純度要高在進行分段鹽析時，要從低濃度到高濃度在鹽析條件相同的情況下，蛋白質的濃度越高越容易沉淀，但也容易出現共沉淀，鹽析時要盡量避免共沉淀的發(fā)生鹽析產生的蛋白質沉淀中含有大量的鹽，鹽析后必需將鹽除去05十二月202236A、固體法：適用于粗提液體積比較大時蛋白質的提取。向粗提液中直接加入硫酸銨固體顆粒，使硫酸銨達到一定濃度，而使蛋白質沉淀的方法。硫酸銨鹽析g=533(S2-S1)100-0.3S2g=541(S2-S1)100-0.3S2（20℃）（25℃）05十二月20223705十二月202238B、飽和溶液法：利用不同飽和度硫酸銨溶液配制各種飽和度硫酸銨溶液的方法。V＝V0S2－S1S3－S2飽和硫酸銨的配制在一定量的水中加入過量的硫酸銨，加熱到50～60℃保溫數分鐘，趁熱過濾，再在0℃或25℃平衡1～2天，有固體析出時即達100％飽和。05十二月20223905十二月202240C、透析法：將盛有蛋白質溶液的透析袋放入一定濃度的大體積鹽溶液中，通過透析作用來改變蛋白質溶液中的鹽濃度，使蛋白質沉淀的方法。優(yōu)點：鹽濃度是以連續(xù)狀態(tài)變化，避免鹽濃度局部升高產生的不良影響缺點：a.透析袋容積小，處理樣品量小b.速度慢05十二月202241(2)鹽析曲線制作05十二月20224205十二月202243分段鹽析：利用不同的離子強度和溶液的性質使不同的蛋白質分離的方法稱分段鹽析。按性質可將分段鹽析分為：Ks分段鹽析：溫度和pH保持不變，通過改變溶液的離子強度而使不同的蛋白質分離的方法。β分段鹽析：溶液的離子強度保持不變，通過改變溶液的溫度或pH值而使不同的蛋白質分離的方法。I=1/2∑MiZi205十二月202244(3)鹽析的影響因子①鹽析常數(Ks)lgS=lgS0-KsM=β-KsMKs表示有效成分在特定條件下的恒定值，表示有效成分的溶解度降低的速率與鹽濃度的關系。Ks與蛋白質本身的性質有關，也受溶液的pH、溫度鹽的種類等因素的影響。05十二月202245②鹽分級范圍的差異性：當分離兩種以上蛋白質時，若每一種蛋白質的Ks值都很大，而且鹽析范圍(鹽離子強度)差異明顯，則分離效果好；若Ks值很大，但鹽析范圍差異較小，則分離效果差。05十二月202246在pH7.0溶液中幾種蛋白質的β和Ks常數項目兔肌醛兔肌丙酮兔肌甘油醛兔肌乳酸兔肌磷酸甘牛血清縮酶酸激酶磷酸脫氫酶脫氫酶油醛變位酶白蛋白β常數6.3010.28.68.09.859.2Ks常數2.844.342.483.974.263.26(NH4)2SO4

濃度2.202.343.342.022.322.8405十二月202247沉淀量／mg硫酸銨飽和度／％ABC05十二月202248③pH和鹽濃度④蛋白質的純度和濃度(4)脫鹽2、有機溶劑沉淀法有機溶劑是強脫水劑有機溶劑是的介電常數小有機溶劑的用量V=V0×S2–S1S100-S205十二月202249有機溶劑沉淀法的注意事項(1)低溫下操作：由于有機溶劑加入水溶液時產生放熱反應會引起蛋白質變性，因此必須把所用的有機溶劑預冷至－10℃，而且整個操作要在低溫下進行。(2)中性鹽作用：加入適量的中性鹽能增加蛋白質在有機溶劑中的溶解度，可降低有機溶劑對蛋白質的變性作用，同時還可提高分級效果。但加入的量過多，則可引起蛋白質析出，影響有機溶劑的分級作用。中性鹽的離子強度可控制在<0.05。05十二月202250(3)多價陽離子作用：有些蛋白質和多價陽離子能結合形成復合物，致使蛋白質在有機溶劑中的溶解度降低。對在高濃度溶劑中才能沉淀的蛋白質特別有益。05十二月2022513、等電點沉淀法：通過調節(jié)溶液的pH值至某種溶質的等電點，使其溶解度降低沉淀析出的方法。4、復合沉淀法：在溶液中加入某些物質，使它與蛋白質等形成復合物而沉淀下來的方法稱為復合沉淀法。常用的復合沉淀劑有單寧、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。05十二月2022525、金屬鹽沉淀法：利用溶液中某種溶質與某些金屬離了反應，生成金屬鹽沉淀，而與其他組分分離的方法，稱為金屬鹽沉淀法。6、選擇性沉淀法：利用不同蛋白質對不同物理化學因素的穩(wěn)定性不同而實現對有效成分從雜質中分離的方法。05十二月202253脫鹽05十二月20225405十二月202255三、制備核酸核酸在生物體內往往是與蛋白質一起形成DNP或RNP復合物，制備核酸時首先使復合物解聚，除去復合物中蛋白質的方法有：(1)去污劑常用的去污劑有十二烷基硫酸鈉、十二烷基肌氨酸鈉、脫氧膽酸鈉、Triton-100、吐溫-40等。05十二月20225605十二月202257(2)有機溶劑很多有機溶劑是蛋白質變性劑，使蛋白質變性后與核酸分開，從而提取出核酸。常用的有機溶劑變性劑有氯仿和水飽和酚。(3)蛋白水解酶：用蛋白酶處理DNP/RNP復合物中蛋白質組分的方法比較溫和，并可避免剪切和破壞核酸。常用的蛋白酶有溶菌酶、蛋白酶K和蛋白酶E等。05十二月2022582、多糖等雜質的消除(1)多糖：采用動物材料提取核酸時，宰殺前饑餓12h；植物作材料提取核酸時，置暗室培養(yǎng)數天，其體內的糖原和淀粉可被消耗掉，有利于核酸