哺乳動(dòng)物DNA的快速分離與PCR擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)二、哺乳動(dòng)物組織DNA的快速分離與基因的PCR擴(kuò)增主講教師：周建林、劉如石、韓梅哺乳動(dòng)物DNA的快速分離與PCR擴(kuò)增共14頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁(yè)!一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解真核細(xì)胞中基因組結(jié)構(gòu)與組成的復(fù)雜性；學(xué)會(huì)并掌握從哺乳動(dòng)物組織中提取基因組總DNA的原理與技術(shù)，為PCR分析，RFLP分析，基因文庫(kù)的構(gòu)建，基因探測(cè)等的研究打下基礎(chǔ)；2、學(xué)習(xí)與掌握PCR擴(kuò)增基因的原理和操作方法，了解PCR基因擴(kuò)增技術(shù)在分子克隆，目的基礎(chǔ)檢測(cè)，遺傳病的基因診斷，法醫(yī)學(xué)，考古學(xué)等方面的應(yīng)用。哺乳動(dòng)物DNA的快速分離與PCR擴(kuò)增共14頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁(yè)!二、實(shí)驗(yàn)原理1、哺乳動(dòng)物組織DNA的提取：在EDTA（鰲合二價(jià)陽(yáng)離子以抑制DNase）存在的情況下，用蛋白酶K消化真核細(xì)胞或組織，用去垢劑如SDS溶解細(xì)胞膜并使蛋白質(zhì)變性。核酸通過(guò)有機(jī)溶劑進(jìn)行抽提純化。污染的RNA通過(guò)RNase消化去除。根據(jù)本方法制備的哺乳動(dòng)物DNA約20～50kb，適于作PCR反應(yīng)的模板。DNA產(chǎn)量在0.5～3.0μg/mg組織之間。2、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)簡(jiǎn)稱ＰＣＲ技術(shù)：ＰＣＲ技術(shù)實(shí)際上是在模板ＤＮＡ，引物和４種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反應(yīng)，ＰＣＲ技術(shù)的特異性取決于引物和模板ＤＮＡ結(jié)合的特異性。反應(yīng)分三步：①變性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension），反應(yīng)過(guò)程見(jiàn)圖。哺乳動(dòng)物DNA的快速分離與PCR擴(kuò)增共14頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁(yè)!模板DNA在94℃條件下變性形成單鏈；在55℃條件下根據(jù)目的基因兩側(cè)序列設(shè)計(jì)的引物分別與其同源序列結(jié)合；70℃下在耐熱性DNA聚合酶Taq酶催化下，在４種dNTP存在條件下延伸形成雙鏈。完成一次循環(huán)。接著又以新合成的DNA為模板進(jìn)行同樣反應(yīng)，如次往復(fù)循環(huán)30次，由于每次循環(huán)目標(biāo)DNA都以２n次冪擴(kuò)增，30次循環(huán)后目的DNA的量增加106～7倍。成功的PCR反應(yīng)要求反應(yīng)有很好的特異性，和相當(dāng)?shù)臄U(kuò)增效率。要達(dá)此目的PCR反應(yīng)要注意以下問(wèn)題：①、DNA反應(yīng)中DNA量在50ng～200ng左右。且DNA純度較高，以增加反應(yīng)特異性。②、dNTP:反應(yīng)體系中達(dá)100μM～200μM。哺乳動(dòng)物DNA的快速分離與PCR擴(kuò)增共14頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁(yè)!三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)儀器與材料：臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，恒溫水浴，真空泵，PCR儀，臺(tái)式冷凍離心機(jī)、滅菌的微量離心管、凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng)，冰箱、微量移液器、組織勻漿及，制冰機(jī)，一次性使用塑料手套和乳膠手套，豬肝組織。2、實(shí)驗(yàn)試劑：細(xì)胞裂解緩沖液：10mMTris-Cl(pH8.0),1mMEDTA(pH8.0),0.1%SDS，70%乙醇，異丙醇，醋酸鉀(pH=4.8)(60ml的5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O)，TE(pH8.0)或無(wú)菌水，無(wú)DNase的RNaseA(10mg/ml)，蛋白酶K(20mg/ml)；

TaKaRaTaq(5U/l)，10×PCRBuffer(Mg2+Plus)，dNTPMixture(each2.5mM)，豬肝基因組DNA，引物（ForwardprimerandReverseprimer)。哺乳動(dòng)物DNA的快速分離與PCR擴(kuò)增共14頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁(yè)!6、將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新離心管中，加0.6ml異丙醇。充分混勻，12000rpm離心5分鐘（4℃）。7、去掉上清，加入0.6ml70%乙醇。顛倒離心管數(shù)次，12000rpm離心1分鐘（4℃）。8、去掉上清，空氣中干燥DNA沉淀15分鐘。9、將DNA沉淀溶解于100μlTE或水中。10、濃度和純度測(cè)定：OD260/OD280=1.8-2.0；1OD260=50μg/ml（二）、PCR擴(kuò)增基因片斷：哺乳動(dòng)物DNA的快速分離與PCR擴(kuò)增共14頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁(yè)!2、在0.5ml薄壁管中，依次加入以下各成分：

ddH2O:

19.9l10×buffer:2.5ldNTPs(2.5mM)

0.5l

Forwardprimer(10M)

:0.5lReverseprimer(10M)

:0.5lTaqDNA酶(5U/l)

:0.1l

TemplateDNA(20ng/l):1.0l總體積25l哺乳動(dòng)物DNA的快速分離與PCR擴(kuò)增共14頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁(yè)!六、思考題：1、為了獲得較為完整的基因組DNA，在實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意什么問(wèn)題？2、簡(jiǎn)述PCR基本原理；3、進(jìn)行一次成功的PCR反應(yīng)順注意哪些問(wèn)題？哺乳動(dòng)物DNA的快速分離與PCR擴(kuò)增共14頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁(yè)!哺乳動(dòng)物DNA的快速分離與PCR擴(kuò)增共14頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁(yè)!③、Mg2+：Mg2+是Taq酶的輔基濃度在2.0mM左右，濃度太低Taq酶活力降低；太高反應(yīng)特異性降低；④、引物：根據(jù)目的基因兩側(cè)特定序列設(shè)計(jì)。引物約20堿基左右，Ｇ＋Ｃ含量在40％－70％之間，引物內(nèi)部不能有回文序列，引物３’端不能互補(bǔ)；⑤、Taq酶：它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性ＤＮＡ聚合酶，在95℃時(shí)30min還有50％活力；⑥、變性溫度：在93～95℃之間使模板充分變性。⑦、復(fù)性溫度：55℃左右，此溫度選擇是根據(jù)模板和引物配對(duì)結(jié)合強(qiáng)弱而定，它是反應(yīng)特異性的決定因素。⑧、延伸溫度：70～72℃左右，為Taq酶最適反應(yīng)溫度。哺乳動(dòng)物DNA的快速分離與PCR擴(kuò)增共14頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁(yè)!四、實(shí)驗(yàn)操作步驟（一）、豬肝組織DNA的抽提1、切下10-20mg組織，在液氮中碾磨成粉末。2、將粉末轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，加0.6ml細(xì)胞裂解緩沖液和3μl蛋白酶K，混勻，置于55℃水浴中3h以上,但不要超過(guò)16h。3、消化液降至室溫，然后加入2μl無(wú)DNase的RNaseA，混勻。37℃水浴中放置0.5h。4、將樣品降至室溫，加入200μl醋酸鉀溶液，劇烈震蕩20s使其充分混合。冰上放置5分鐘。5、12000rpm離心5分鐘（4℃）。哺乳動(dòng)物DNA的快速分離與PCR擴(kuò)增共14頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁(yè)!1、設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)程序

94℃預(yù)變性2min后開始以下循環(huán)94℃30sec49℃30sec20cycles

72℃30sec72℃5min；

4℃冷卻恒定。哺乳動(dòng)物DNA的快速分離與PCR擴(kuò)增共14頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁(yè)!3、混勻后，離心2-3秒，將PCR薄壁管放入PCR儀的樣品槽中，選擇預(yù)先設(shè)定的程序，按START鍵啟動(dòng)PCR儀。4、采用1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的量、引物擴(kuò)增的特異性。五、