細胞培養(yǎng)工程 02A 相關細胞生物學課件

11生物加工常用動物細胞來源

種屬細胞類型

組織來源WI-38MRC-5FS-4HEK293VeroMDCKNS/SP2/0CHOBHK人人人人猴狗小鼠中國倉鼠敘利亞倉鼠成纖維細胞成纖維細胞成纖維細胞上皮細胞上皮細胞上皮細胞淋巴樣細胞上皮細胞上皮細胞

肺肺包皮腎腎腎骨髓瘤卵巢腎Wei-ShouHu：CellCultureBioprocessing22盡管脊椎動物約有200種不同細胞類型，用于生物藥物生產的主要有兩類，即上皮細胞和成纖維細胞；目前用于重組蛋白質表達生產的細胞株主要是上皮細胞（如CHO）和淋巴細胞（如NS0）；成纖維細胞和上皮細胞常用于病毒疫苗生產（病毒制備）；上皮細胞：位于皮膚或腔道表皮，隨所在器官有所不同，形成組織邊界；易受損，需要不斷更新，因此生長活躍；成纖維細胞：疏松結蹄組織的主要細胞成分，由胚胎時期的間充質細胞分化而來；通常處于休眠狀態(tài)，在刺激因素下才會遷移至受損部位并開始增殖；淋巴細胞：已分化淋巴細胞具有較短的生命周期。生物加工常用動物細胞來源33動物細胞的尺度

細胞類型

體積

(m3)

直徑

(m)雜交瘤內皮細胞中國倉鼠卵巢細胞(CHO,懸浮)

中國倉鼠卵巢細胞(CHO,貼壁）人包皮成纖維細胞(FS-4)1400-25001200-18001300-1800700012-2017約1455物理化學現(xiàn)象（雙層脂質體）磷脂親水頭部向外，脂肪酸疏水尾端排列緊致，組裝形成能夠阻止物質自由進出的屏障，隔離細胞內、外水溶性環(huán)境，并進一步將細胞器與胞漿隔離；呈流體狀態(tài)，受不飽和脂肪酸含量影響，隨著溫度降低可以變?yōu)槟z狀（液晶）；飽和脂肪酸使疏水屏障更致密，不飽和脂肪酸雙鍵降低疏水屏障的致密度、提高膜的流動性；MolecularCellBiology(5thEd.)byLodishetal.細胞膜–磷脂雙分子層膽固醇與磷脂相互作用，起到穩(wěn)定雙分子層親水區(qū)域的作用，提高磷脂雙分子層對小分子物質的滲透性，但降低流動性；膽固醇主要存在于細胞膜，在亞細胞結構中含量非常低。66膜蛋白質膜蛋白是細胞膜的重要組成部分，其生物學功能包括接受外界信號分子的受體蛋白、負責跨膜轉運的載體蛋白、通道蛋白以及催化各種化學反應的酶蛋白等；膜蛋白質含量典型細胞膜：約50%，脂類與蛋白分子數量約為50比1線粒體膜：約75%；消耗ATP，Na+/K+ATPase泵出三個Na+，泵入兩個K+細胞膜跨膜電壓為-80mV；線粒體膜跨膜電壓為-140mV；內質網內部為氧化環(huán)境，外部（胞漿）為還原環(huán)境細胞內外各種跨膜化學勢、電勢（電壓）、氧化還原電勢的維持有賴于膜蛋白的功能，也是細胞生物力能學的基礎。7細胞膜的通透性8膜蛋白轉運機制:離子與多數物質1010真核細胞胞內功能區(qū)域界定真核細胞：核膜內質網：胞內生理化學反應高度空間區(qū)域化和組織化細胞器：細胞核、線粒體、高爾基體等轉運：囊泡（vesicles）意義：提供大量表面積提高跨膜物質轉運效率化學加工場所經濟效益MolecularCellBiology(5thEd.)byLodishetal.12細胞內四種基本分子遺傳過程1414真核細胞胞內功能區(qū)域界定胞內游離分子的擴散布朗運動Einstein’sEquation：

x=(2Dt)1/2x游離分子位移尺度t擴散時間D游離分子在特定介質中的擴散系數1515細胞生長周期(1)MolecularCellBiology(5thEd.)byLodishetal.1616細胞周期G1SG2M周期蛋白（Cyclin）調節(jié)周期蛋白依賴性激酶周期性出現(xiàn)與消失周期蛋白依賴性激酶（CDK）決定進入休眠（G0）或S然后細胞接受外源生長刺激細胞生長周期(2)1717細胞特征

大小、表面粗糙度、表面抗原細胞分離與克隆細胞生長周期(3)18環(huán)境滲透壓對細胞的影響2020細胞貼壁培養(yǎng)細胞獲?。旱鞍酌福ㄒ鹊鞍酌?，膠原酶/Ca2+）豬胰蛋白酶，重組胰蛋白酶胰蛋白酶抑制劑：血清/抑肽酶貼壁細胞主要類型：成纖維細胞上皮細胞游走型細胞主要問題：血清成本蛋白質成分生物污染

2121細胞培養(yǎng)物（1）原代培養(yǎng)物建立原代細胞培養(yǎng)是將取自動物組織的細胞直接接種于生長培養(yǎng)基里。在無菌條件下，用鑷子和剪刀將切下的組織碎成小塊，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶處理，使組織解離成單個細胞，放入培養(yǎng)容器中無菌培養(yǎng)。皮膚、雞胚、淋巴、鼠腦等都是常用的原代培養(yǎng)物，用于研究、治療和生產疫苗等。這種原代培養(yǎng)物中含有各種不同分化的細胞類型，它們的生長速率各不相同，成纖維細胞最易生長，常會在此后的傳代培養(yǎng)中占據優(yōu)勢。仔細控制培養(yǎng)基的成分，可以選擇性地支持某些細胞類型的生長。23細胞培養(yǎng)物（2）正常細胞正常的原代培養(yǎng)物進行傳代形成繼代培養(yǎng)物，在一定代數范圍內保持正常細胞特征二倍體染色體互補沒有明顯基因改變有限的壽命反映了細胞的生長調節(jié)細胞無惡性，表現(xiàn)在將該細胞注入免疫抑制動物不能形成腫瘤貼壁依賴和密度抑制表明其增殖受到控制，當細胞在介質表面生長至匯合單層時增殖就停止正常細胞系（如WI-38等）安全而被廣泛用于人用疫苗的生產增殖能力是有限的，最多只可傳代培養(yǎng)50代左右細胞的壽命是有儲存記憶功能的，如人胚組織的細胞在增殖2代時儲存于液氮，當重新復蘇培養(yǎng)后，它只能再增殖30代左右24細胞培養(yǎng)物（3）轉化細胞正常細胞在培養(yǎng)中經過轉化過程，喪失了對生長控制的敏感性，獲得無限增殖的能力，成為連續(xù)細胞系。細胞轉化伴隨著染色體模式的改變，二倍體變成異倍體。貼壁依賴性細胞對貼壁的依賴及細胞密度的抑制發(fā)生改變，雖然也許細胞仍須貼壁生長，但可能生長到不止單層。應當注意的是，并非所有轉化細胞都是惡性的。細胞轉化的四種主要途徑：自發(fā)轉化：易發(fā)生于嚙齒動物細胞，可能由內源性病毒引起；化學轉化：某些致癌化學物會增加轉化頻率，如甲基膽蒽；病毒轉化：許多病毒（如腫瘤相關病毒）會增加轉化頻率；致瘤因子轉化：腫瘤細胞分泌，引起細胞染色體變化。主要生物制品生產工具：轉化細胞由于有無限壽命，在培養(yǎng)中更易生長，被廣泛用來生產生物制品，如重組蛋白質藥物、病毒疫苗等。2626主要細胞系CHO（中國倉鼠狼瘡細胞）：1957年建株，轉化細胞，上皮細胞型，一般需貼壁生長，但并不嚴格，可以懸浮培養(yǎng)，Kl亞克隆廣泛使用。其四氫葉酸還原酶缺陷型（DG44）是用得最多的基因工程宿主細胞，表達EPO、tPA、HBsAg、抗體藥物等許多種重組蛋白質。

NS0：小鼠雜交瘤細胞，無抗體分泌，其NS0-GS細胞株是目前抗體藥物商業(yè)化生產的主要工具細胞之一。HEK293：人胚腎細胞，含有Ad5El區(qū)，經5型腺病毒75株系轉化，由McMaster大學F.L.Graham與J.S.Miley于1976年用DNA轉染技術構建而成。貼壁依賴性上皮型細胞，表現(xiàn)出典型的腺病毒轉化細胞的表型，細胞允許Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。HEK293細胞為人亞三倍體細胞系。

Vero：1962年建株，來自非洲綠猴腎，轉化細胞，貼壁依賴性的成纖維細胞型。較易持續(xù)培養(yǎng)，可支持多種病毒的增殖，用于生產人畜疫苗，是目前唯一一株獲準生產人用疫苗的轉化細胞。BHK