藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證

第四章藥物的含量測(cè)定方法與驗(yàn)證2022/12/7第一頁(yè)，共八十一頁(yè)。定量分析方法的分類與特點(diǎn)

1樣品分析的前處理方法2藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證32022/12/7第二頁(yè)，共八十一頁(yè)。第一節(jié)

定量分析方法的分類與特點(diǎn)

一、容量分析法二、光譜分析法三、色譜分析法2022/12/7第三頁(yè)，共八十一頁(yè)。一、容量分析法(一)特點(diǎn)與適用范圍(1)方法簡(jiǎn)便易行(2)方法耐用性高(3)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確(4)方法專屬性差適用于原料藥含量測(cè)定(二)有關(guān)計(jì)算:1.滴定度與滴定度計(jì)算2.含量計(jì)算

(1)直接滴定法

(2)間接滴定法生成物滴定法剩余量滴定法

將已知濃度滴定液滴加至被測(cè)藥物溶液中,至滴定終點(diǎn),根據(jù)滴定液的濃度,體積和滴定度,計(jì)算含量.2022/12/7第四頁(yè)，共八十一頁(yè)。結(jié)果計(jì)算1、滴定度的計(jì)算aA+bB=cC+dD;cC+eE=fF+gG;

滴定反應(yīng)fF+hH=iI+lLaAhH

m:滴定劑摩爾濃度；M被測(cè)物摩爾質(zhì)量；a/h:反應(yīng)摩爾比2022/12/7第五頁(yè)，共八十一頁(yè)。2.含量測(cè)定直接滴定法

生成物滴定法剩余量滴定法(1)(2)(3)2022/12/7第六頁(yè)，共八十一頁(yè)。(1)直接滴定法注意掌握滴定反應(yīng)的原理,藥物與滴定劑在反應(yīng)中的摩爾比正確計(jì)算滴定度和百分含量2022/12/7第七頁(yè)，共八十一頁(yè)。(2)生成物滴定法注意摩爾比的替換藥物與A作用生成B,用滴定液滴定B百分含量計(jì)算方法與直接滴定法相同2022/12/7第八頁(yè)，共八十一頁(yè)。（3）回滴定（剩余滴定）（a）不做空白試驗(yàn)時(shí)百分含量計(jì)算（b）做空白試驗(yàn)時(shí)百分含量計(jì)算

2022/12/7第九頁(yè)，共八十一頁(yè)。

司可巴比妥鈉含量測(cè)定:本品約0.1g,加水10ml溶解,精密加溴滴定液(0.05mol/L)25ml,再加鹽酸5ml,放置15分鐘,加碘化鉀試液10ml,用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定,滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正W=0.1022g;硫代硫酸鈉滴定液F=1.038;供試品消耗硫代硫酸鈉滴定液15.73ml;空白23.21ml2022/12/7第十頁(yè)，共八十一頁(yè)。滴定度司可巴比妥鈉M=260.27,與溴摩爾比為1:12022/12/7第十一頁(yè)，共八十一頁(yè)。二、光譜分析法定義分類

UV-Vis利用物質(zhì)的光譜進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析的方法——光譜分析法

IR

AA

FluorFP(flamephotometry)2022/12/7第十二頁(yè)，共八十一頁(yè)。三、色譜分析法特點(diǎn)與應(yīng)用分類

依據(jù)分離原理：(1)高靈敏度:ng-μg/ml(2)高專屬性:選擇性檢測(cè)(3)高效能與高速度吸附;分配;離子交換;分子排阻色譜法

復(fù)方制劑含量測(cè)定的首選方法依據(jù)分離方式：紙色譜;薄層色譜;柱色譜;氣相色譜;高效液相色譜法

2022/12/7第十三頁(yè)，共八十一頁(yè)。第二節(jié)樣品分析的前處理方法一、不經(jīng)有機(jī)破壞的前處理方法二、經(jīng)有機(jī)破壞的前處理方法(一)水解法;(二)還原法(一)干法破壞;(二)濕法破壞2022/12/7第十四頁(yè)，共八十一頁(yè)。

進(jìn)行藥物定量分析之前，一般都需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理。根據(jù)待測(cè)元素在藥物分子中結(jié)合的牢固程度，前處理方法各異。在分析含金屬或含鹵素、氮、硫、磷等元素的有機(jī)藥物前，需進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚怼?022/12/7第十五頁(yè)，共八十一頁(yè)。含鹵素有機(jī)藥物系指藥物分子結(jié)構(gòu)中所含鹵素直接與芳環(huán)或脂肪鏈相連者，而不包括某些有機(jī)藥物的鹵酸鹽或氫鹵酸鹽。2022/12/7第十六頁(yè)，共八十一頁(yè)。一、不經(jīng)有機(jī)破壞的方法

1.酸水解法水難溶性含金屬有機(jī)藥物與礦酸(鹽酸)共熱:

回流有機(jī)結(jié)合的待測(cè)元素原子離解,轉(zhuǎn)化為無機(jī)鹽(離子)2.堿水解法含鹵素有機(jī)藥物(脂肪碳鏈)與氫氧化鈉溶液回流:適用于:結(jié)合不牢固的含金屬或含鹵素有機(jī)藥物(一)水解法2022/12/7第十七頁(yè)，共八十一頁(yè)。碘他拉酸測(cè)定:氫氧化鈉試液與鋅粉回流后,用硝酸銀滴定回流堿性溶液中加鋅粉回流,使碳-碘鍵還原轉(zhuǎn)化為無機(jī)碘化物碘番酸膽影酸膽影葡胺注射液泛影酸泛影酸鈉泛影葡胺注射液

適用于:結(jié)合牢固的含碘有機(jī)藥物

(直接與芳環(huán)連接)

(二)還原法2022/12/7第十八頁(yè)，共八十一頁(yè)。常見的含鹵素有機(jī)藥物三氯叔丁醇六氯對(duì)二甲苯2022/12/7第十九頁(yè)，共八十一頁(yè)。泛影酸2022/12/7第二十頁(yè)，共八十一頁(yè)。膽影酸2022/12/7第二十一頁(yè)，共八十一頁(yè)。碘他拉酸2022/12/7第二十二頁(yè)，共八十一頁(yè)。碘番酸2022/12/7第二十三頁(yè)，共八十一頁(yè)。I碘苯酯鹽酸胺碘酮2022/12/7第二十四頁(yè)，共八十一頁(yè)。諾氟沙星2022/12/7第二十五頁(yè)，共八十一頁(yè)。醋酸氟輕松2022/12/7第二十六頁(yè)，共八十一頁(yè)?；卿逄c2022/12/7第二十七頁(yè)，共八十一頁(yè)。含鹵素有機(jī)藥物的分析直接回流后測(cè)定法堿性或酸性還原后測(cè)定法氧瓶燃燒分解后測(cè)定法2022/12/7第二十八頁(yè)，共八十一頁(yè)。

有機(jī)金屬藥物：金屬原子直接與碳原子以共價(jià)鍵相連，結(jié)合比較牢固如卡巴胂、醋酸苯汞、汞撒利2022/12/7第二十九頁(yè)，共八十一頁(yè)。酒石酸銻鉀2022/12/7第三十頁(yè)，共八十一頁(yè)。硬脂酸鎂富馬酸亞鐵2022/12/7第三十一頁(yè)，共八十一頁(yè)。葡萄糖酸銻鈉2022/12/7第三十二頁(yè)，共八十一頁(yè)?？ò碗洗姿岜焦?022/12/7第三十三頁(yè)，共八十一頁(yè)。汞撒利2022/12/7第三十四頁(yè)，共八十一頁(yè)。二、經(jīng)有機(jī)破壞的方法(一)濕法破壞

適用于含氮有機(jī)藥物分析的前處理

硫酸作為分解劑,氧化劑(硝酸,高氯酸)輔助分解劑

凱氏定氮法

(二)干法破壞高溫?zé)胱品ㄓ糜诤u素藥物的鑒別無水碳酸鈉,硝酸鎂,氫氧化鈣,氧化鋅等輔助灰化

2.氧瓶燃燒法適用于:

含金屬,鹵素,氮,硫,磷等有機(jī)藥物

(待測(cè)原子與碳原子結(jié)合牢固者)2022/12/7第三十五頁(yè)，共八十一頁(yè)。1.高溫?zé)胱品ǜ邷刈茻一糜诤u素藥物的鑒別2.氧瓶燃燒法2022/12/7第三十六頁(yè)，共八十一頁(yè)。

（1）

氧瓶燃燒法原理

氧瓶燃燒法：將有機(jī)藥物放入充滿氧氣的密閉燃燒瓶中進(jìn)行燃燒，并將燃燒所產(chǎn)生的欲測(cè)物質(zhì)吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐?，然后根?jù)欲測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)，采用適宜的分析方法進(jìn)行鑒別、檢查或含量測(cè)定。2022/12/7第三十七頁(yè)，共八十一頁(yè)。適用于含鹵素、硫、氮、硒等有機(jī)藥物的分析。本法特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速、破壞完全，尤其適用于微量樣品的分析。2022/12/7第三十八頁(yè)，共八十一頁(yè)。（2）儀器與材料

①儀器裝置

燃燒瓶為500、1000或2000ml無色、磨口、厚壁、硬質(zhì)玻璃錐型瓶；瓶塞空心，底部熔封鉑絲一根，下端呈螺旋狀或網(wǎng)狀2022/12/7第三十九頁(yè)，共八十一頁(yè)。②稱樣用材料及稱樣A.固體樣品無灰濾紙B.液體樣品紙袋C.軟膏類樣品：將適量樣品置不含被測(cè)成分的蠟油紙中包裹嚴(yán)密，外層再用無灰濾紙包裹2022/12/7第四十頁(yè)，共八十一頁(yè)。③氧氣④吸收液A.作用：吸收液的作用是將樣品經(jīng)燃燒分解所產(chǎn)生的各種價(jià)態(tài)的鹵素、硫、氮、硒等，定量地吸收并轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢ǖ谋阌跍y(cè)定的價(jià)態(tài)2022/12/7第四十一頁(yè)，共八十一頁(yè)。B.吸收液的選擇氟水氯

NaOH溶液溴

H2O2-NaOHNaOH-硫酸肼飽和溶液碘

NaOH－硫酸肼飽和溶液硫

NaOH或H2O2

硒硝酸溶液2022/12/7第四十二頁(yè)，共八十一頁(yè)。（3）操作方法①燃燒瓶燃燒前的準(zhǔn)備用洗液洗凈后，按各藥品項(xiàng)下的規(guī)定加入吸收液，將瓶口用水濕潤(rùn)，小心急速地通入氧氣1min，立即用表面皿覆蓋瓶口。②樣品的準(zhǔn)備取樣品適量，精密稱定后按規(guī)定方法包裹，固定于鉑絲下端的網(wǎng)內(nèi)或螺旋處。2022/12/7第四十三頁(yè)，共八十一頁(yè)。③樣品的燃燒點(diǎn)燃包有供試品的濾紙尾部，迅速放入燃燒瓶中，按緊瓶塞，加水少量封閉瓶口，待燃燒完畢（應(yīng)無黑色碎片），充分振搖，使生成的煙霧完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量沖洗瓶塞及鉑絲，合并洗液及吸收液，同法另做空白試驗(yàn)。然后按各藥品項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行鑒別、檢查或含量測(cè)定。2022/12/7第四十四頁(yè)，共八十一頁(yè)。①根據(jù)被燃燒分解的樣品量選用適宜大小的燃燒瓶。ChP（2005）規(guī)定的燃燒瓶體積為500、1000或2000ml三種，采用常量或半微量分析注意事項(xiàng)：2022/12/7第四十五頁(yè)，共八十一頁(yè)。待分解樣品量燃燒瓶的體積

3~5mg（微量分析）

150~250ml

20~30mg（半微量分析）

300~500ml

50~60mg

1000ml

0.6~0.7g或更多

2000ml或特殊結(jié)構(gòu)的燃燒瓶2022/12/7第四十六頁(yè)，共八十一頁(yè)。

正確選用燃燒瓶的目的在于：樣品能在足夠的氧氣中燃燒分解完全；有利于將燃燒分解產(chǎn)物較快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。2022/12/7第四十七頁(yè)，共八十一頁(yè)。②測(cè)定含氟有機(jī)藥物時(shí)，用石英制燃燒瓶③鉑絲燃燒時(shí)起催化作用④應(yīng)同時(shí)做空白試驗(yàn)⑤燃燒時(shí)要注意防爆⑥燃燒要完全⑦燃燒產(chǎn)生的煙霧完全被吸收2022/12/7第四十八頁(yè)，共八十一頁(yè)。應(yīng)用例磺溴酞鈉的含量測(cè)定ChP(2005)2022/12/7第四十九頁(yè)，共八十一頁(yè)。燃燒分解O2HBr+S2-+SO4+…

HBr+S2-NaBr+Na2SO4

+H2O

NaOH,H2O22022/12/7第五十頁(yè)，共八十一頁(yè)。含金屬的有機(jī)藥物：金屬原子不與碳原子直接相連，通常為有機(jī)酸及酚的金屬鹽或配位化合物如酒石酸銻鉀、葡萄糖酸銻鈉、富馬酸亞鐵2022/12/7第五十一頁(yè)，共八十一頁(yè)。需驗(yàn)證的項(xiàng)目驗(yàn)證的內(nèi)容準(zhǔn)確度定量限防腐劑溶出度,釋放度鑒別試驗(yàn)雜質(zhì)檢查含量測(cè)定第三節(jié)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證

精密度專屬性檢測(cè)限線性范圍耐用性重復(fù)性中間精密度重現(xiàn)性2022/12/7第五十二頁(yè)，共八十一頁(yè)。一、準(zhǔn)確度（accuracy）：測(cè)量值與真實(shí)值接近的程度表示:回收率測(cè)定方法：回收試驗(yàn)加樣回收試驗(yàn)2022/12/7第五十三頁(yè)，共八十一頁(yè)。（一）含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度1、原料藥回收試驗(yàn)：

空白+已知量A的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測(cè)定，測(cè)定值為M2022/12/7第五十四頁(yè)，共八十一頁(yè)。加樣回收試驗(yàn)：已準(zhǔn)確測(cè)定藥物含量P的真實(shí)樣品+已知量A的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測(cè)定，測(cè)定值為M。2022/12/7第五十五頁(yè)，共八十一頁(yè)。

原料藥

（1）可用已知純度的對(duì)照品或樣品進(jìn)行測(cè)定（2）用本法所得結(jié)果與已建立準(zhǔn)確度的另一方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。

2022/12/7第五十六頁(yè)，共八十一頁(yè)。

2、制劑（1）用含己知量被測(cè)物的各組分混合物進(jìn)行測(cè)定，即采用在空白輔料中加入原料藥對(duì)照品的方法。（2）如不能得到制劑的全部組分，可向制劑中加入已知量的被測(cè)物進(jìn)行測(cè)定。（3）另一個(gè)已建立準(zhǔn)確度的方法比較結(jié)果。2022/12/7第五十七頁(yè)，共八十一頁(yè)。2022/12/7第五十八頁(yè)，共八十一頁(yè)。

中藥

分析的準(zhǔn)確度一般用加樣回收試驗(yàn)衡量。中藥回收率一般要求在95～105%范圍內(nèi)，有些方法操作步驟繁多時(shí)，可要求在90～110%范圍內(nèi)。RSD一般在3%以內(nèi)。2022/12/7第五十九頁(yè)，共八十一頁(yè)。（二）雜質(zhì)定量測(cè)定的準(zhǔn)確度（1）可向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。（2）如果不能得到雜質(zhì)或降解產(chǎn)物，可用本法測(cè)定結(jié)果與另一成熟的方法進(jìn)行比較。2022/12/7第六十頁(yè)，共八十一頁(yè)。（三）數(shù)據(jù)要求規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測(cè)定結(jié)果評(píng)價(jià)，如制備三個(gè)不同濃度樣品各測(cè)三次。2022/12/7第六十一頁(yè)，共八十一頁(yè)。二、精密度1.重復(fù)性同一分析人員連續(xù)測(cè)定所得結(jié)果的精密度;也稱批內(nèi)精密度或日內(nèi)精密度2.中間精密度不同時(shí)間不同分析人員用不同設(shè)備測(cè)定結(jié)果之間的精密度批/日間精密度

3.重現(xiàn)性

在不同實(shí)驗(yàn)室不同人員測(cè)定結(jié)果之間的精密度

法定標(biāo)準(zhǔn)采用的分析方法進(jìn)行

同一均勻供試品多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度標(biāo)準(zhǔn)偏差(s,SD);相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)數(shù)據(jù)要求同“準(zhǔn)確度”定義2022/12/7第六十二頁(yè)，共八十一頁(yè)。偏差（d）：測(cè)量值與平均值之差標(biāo)準(zhǔn)（偏）差（SD或S）:2022/12/7第六十三頁(yè)，共八十一頁(yè)。三、專屬性（specificity）:指有其他成分（雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在情況下采用的方法能準(zhǔn)確測(cè)定出被測(cè)物的特性)。2022/12/7第六十四頁(yè)，共八十一頁(yè)。(一)鑒別反應(yīng)空白,結(jié)構(gòu)相似物或有關(guān)物質(zhì)呈負(fù)反應(yīng)(二)含量與雜質(zhì)測(cè)定含雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣中各峰能獲得分離在其他成分(雜質(zhì),降解產(chǎn)物,輔料等)可能存在下,方法能正確測(cè)定出被測(cè)物的特性鑒別,雜質(zhì)檢查和含量測(cè)定方法

定義與應(yīng)用2022/12/7第六十五頁(yè)，共八十一頁(yè)。四、檢測(cè)限（limitofdetection，LOD）：藥物能被檢出的最低濃度(μg/ml)

測(cè)定:信噪比法(S:N=3:1)2022/12/7第六十六頁(yè)，共八十一頁(yè)。適用于可用目視法直接評(píng)價(jià)結(jié)果的分析方法,非儀器分析法鑒別的顯色法;雜質(zhì)檢查的TLC適用于能直觀顯示信號(hào)與基線噪聲水平的分析方法,如HPLC法

信噪比S/N=3(2)時(shí)的相應(yīng)濃度或量適用于不能直觀比較信噪比的儀器分析方法,如UV-Vis法

常用方法

1.目視法

2.信噪比法

3.標(biāo)準(zhǔn)偏差法

2022/12/7第六十七頁(yè)，共八十一頁(yè)。五、定量限雜質(zhì)和降解產(chǎn)物用定量方法研究時(shí),應(yīng)確定LOQLOQ的測(cè)定方法與LOD相同相應(yīng)的系數(shù)(倍數(shù))不同,如信噪比S/N=10定量限(limitofquantitation,LOQ

)是指試樣中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量;2022/12/7第六十八頁(yè)，共八十一頁(yè)。六、線性范圍系指方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間在試驗(yàn)研究開始前確定驗(yàn)證的范圍和方法在范圍內(nèi)應(yīng)能達(dá)到一定精密度,準(zhǔn)確度和線性線性系指在設(shè)計(jì)的“范圍”內(nèi),響應(yīng)值(y)與被測(cè)物濃度(x)直接呈正比關(guān)系的程度y=ax+b系列(n≥5)供試樣品測(cè)定,以響應(yīng)信號(hào)作為被測(cè)物濃度的函數(shù)作圖用最小二乘法進(jìn)行線性回歸;或經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行線性回歸2022/12/7第六十九頁(yè)，共八十一頁(yè)。七、范圍原料藥/制劑含量測(cè)定:80%~120%制劑含量均勻度檢查:70%~130%溶出度或釋放度檢查:下限-20%~上限+20%特殊元素含量測(cè)定:下限-20%~上限+20%雜質(zhì)測(cè)定: 限度±20%

涉及定量測(cè)定的項(xiàng)目均需對(duì)范圍進(jìn)行驗(yàn)證 如:含量測(cè)定,含量均勻度,溶出度或釋放度,特殊元素或特殊雜質(zhì)的定量檢查2022/12/7第七十頁(yè)，共八十一頁(yè)。八、耐用性耐用性系指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí),測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度;體現(xiàn)測(cè)定條件的允許變動(dòng)范圍HPLC法典型因素有:流動(dòng)相的組成和pH值及流速,不同廠牌或不同批號(hào)的同類型色譜柱,柱溫等GC法典型因素有:不同廠牌或批號(hào)的色譜柱,固定相,不同類型的擔(dān)體,柱溫,進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度等2022/12/7第七十一頁(yè)，共八十一頁(yè)。九、驗(yàn)證內(nèi)容的選擇

驗(yàn)證內(nèi)容選擇的一般原則:非定量分析方法

如鑒別,雜質(zhì)的限度檢查法:

驗(yàn)證“專屬性”,“檢測(cè)限”和“耐用性”定量分析方法

如原料藥或制劑的含量測(cè)定及含量均勻度,溶出度或釋放度的測(cè)定方法:

除“檢測(cè)限”和“定量限”外,其余均驗(yàn)證微量定量分析方法

如雜質(zhì)的定量測(cè)定方法:

除“檢測(cè)限”視情況而定外,其余均驗(yàn)證2022/12/7第七十二頁(yè)，共八十一頁(yè)。檢驗(yàn)項(xiàng)目和驗(yàn)證內(nèi)容：項(xiàng)目?jī)?nèi)容鑒別雜質(zhì)測(cè)定含量測(cè)定及溶出量測(cè)定定量限度準(zhǔn)確度＋＋精密度－＋重復(fù)性＋＋中間精密度＋①＋①專屬性②＋＋＋＋檢測(cè)限－③＋－定量限＋－線性＋＋范圍＋＋耐用性＋＋＋①已有重現(xiàn)性驗(yàn)證，不需驗(yàn)證中間精密度②如一種方法不夠?qū)?，可用其他分析方法予以補(bǔ)充③視具體情況予以驗(yàn)證2022/12/7第七十三頁(yè)，共八十一頁(yè)。各種含量測(cè)定方法對(duì)效能指標(biāo)的要求

1.容量分析法：用原料藥精制品(含量>99.5％)或?qū)φ掌房疾旆椒ǖ木芏龋鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)差一般應(yīng)不大于0.2％；進(jìn)行回收率試驗(yàn)?；厥章室话阍?9.7～100.3％之間。

2022/12/7第七十四頁(yè)，共八十一頁(yè)。

2.UV法：用適當(dāng)濃度的精制品進(jìn)行測(cè)定，其RSD一般不大于1％。制劑的測(cè)定，回收率一般應(yīng)在98％～102％之間。2022/12/7第七十五頁(yè)，共八十一頁(yè)。線性：吸光度A一般在0.2～0.7，濃度點(diǎn)n＝5。用濃度c對(duì)A作線性回歸處理，得一直線方程，R應(yīng)大于0.999(n＝5)，方程的截距應(yīng)近于零。2022/12/7第七十六頁(yè)，共八十一頁(yè)。

3.HPLC法：要求RSD<2％，回收率98％～102％之間。線性范圍：用精制品配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度點(diǎn)n應(yīng)為5～7，用濃度c對(duì)峰高h(yuǎn)或被測(cè)物的響應(yīng)值之比進(jìn)行回歸處理，建立回歸方