動物源性食品中托曲珠利砜殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(試行)

托曲珠利砜殘留檢測方法標(biāo)準(zhǔn)（試行）動物源性食品中托曲珠利砜殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（試行）1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物組織中托曲珠利砜殘留檢測的制樣和液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛、豬、雞的肌肉、脂肪（脂肪 +皮膚）、肝臟和腎臟中托曲珠利砜殘留量的檢測。規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T1.1-2000標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。3原理試料中殘留的托曲珠利砜用含內(nèi)標(biāo)的 0.1%甲酸乙腈提取，離心，上清液過濾膜后，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定，內(nèi)標(biāo)法定量。

-試劑和材料以下所用的試劑，除特別注外均為分析純試劑；水為符合GB/T6682規(guī)定的一級水。4.1甲醇：色譜純。4.2乙腈：色譜純。4.3甲酸：色譜純。4.4甲酸銨。4.550%乙腈溶液：取500mL乙腈和500mL水，混合均勻。4.60.1%甲酸乙腈：準(zhǔn)確量取 1.0mL甲酸，轉(zhuǎn)移入1000mL容量瓶，用乙腈定容至刻度， 混合均勻。4.7含甲酸的10mmol/L甲酸銨水溶液：準(zhǔn)確稱取0.63g甲酸銨，溶于水中，轉(zhuǎn)移到1000mL容量瓶，加0.12mL甲酸，用水定容至刻度，混合均勻。4.8含甲酸的10mmol/L甲酸銨甲醇溶液：準(zhǔn)確稱取0.63g甲酸銨，溶于甲醇中，轉(zhuǎn)移到1000mL容量瓶，加入0.12mL甲酸，加甲醇定容至刻度，混合均勻。4.9托曲珠利砜（CAS69004-04-2）對照品：純度≥98.0%。4.10托曲珠利砜（N-甲基-d3）同位素（CAS1346602-48-9）內(nèi)標(biāo)對照品：純度≥98.0%。4.111mg/mL托曲珠利砜標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取相當(dāng)于10.0mg托曲珠利砜的對照品，用乙腈溶解并定容至10mL量瓶中。在7℃或更低溫度條件下保存，有效期3個月。4.121mg/mL托曲珠利砜（N-甲基-d3）內(nèi)標(biāo)儲備液：精密稱取經(jīng)折算相當(dāng)于10.0mg托曲珠利砜（N-甲基-d3）的對照品，用乙腈溶解并定容至10mL量瓶中。4.13托曲珠利砜標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取1mL托曲珠利砜標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈稀釋并定容至100mL量瓶中。根據(jù)檢測需要移取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈逐級稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在7℃或更低溫度條件下保存，有效期3個月。4.14托曲珠利砜（N-甲基-d3）內(nèi)標(biāo)溶液：取1mL托曲珠利砜（N-甲基-d3）內(nèi)標(biāo)儲備液，用50%乙腈溶液稀釋并定容至100mL量瓶中。根據(jù)檢測需要移取一定體積的內(nèi)標(biāo)儲備液用50%乙腈逐級稀釋成適當(dāng)濃度的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在7℃或更低溫度條件下保存，有效期3個月。4.150.1mg/L托曲珠利砜（N-甲基-d3）內(nèi)標(biāo)提取液：準(zhǔn)確量取適量托曲珠利砜（N-甲基-d3）內(nèi)標(biāo)溶液，用0.1%甲酸乙腈配制成濃度為0.1mg/L的內(nèi)標(biāo)提取液。儀器和設(shè)備5.1高效液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源。5.2分析天平：感量0.00001g。5.3天平：感量0.01g。5.4渦旋混合器。5.5高速冷凍離心機(jī)。5.6組織勻漿機(jī)。5.7搖床。5.8超聲波清洗機(jī)。5.9微孔濾膜：孔徑0.2μm。5.10移液器：容量10μL、20～200μL、100～1000μL、1000～5000μL。試料的制備與保存6.1試料的制備取適量新鮮或解凍的空白或供試組織，絞碎并使均質(zhì)?！【|(zhì)后的供試樣品，作為供試試料。——取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試料?！【|(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試料。6.2試料的保存-18℃以下保存。測定步驟7.1樣品前處理稱量試樣2（±0.01）g，置于50mL離心管中，加入20mL0.1mg/L托曲珠利砜（N-甲基-d3）內(nèi)標(biāo)提取液，渦旋，劇烈震蕩15s，超聲浴5min，40r/min搖床振蕩30min，于5℃、4000r/min離心15min。取上清液經(jīng) 0.2μm微孔濾膜后，供液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜測定。7.2基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備在提取后的空白動物組織基質(zhì)匹配液中，添加不同量的托曲珠利砜標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，繪制托曲珠利砜的標(biāo)準(zhǔn)曲線。牛肝臟基質(zhì)匹配液中托曲珠利砜濃度為 10、25、50、75、100、150μg/L，牛腎臟基質(zhì)匹配液中托曲珠利砜濃度為 5、10、12.5、25、50、70μg/L，牛肌肉基質(zhì)匹配液中托曲珠利砜濃度為 2、5、10、20、50、100μg/L，牛脂肪基質(zhì)匹配液中托曲珠利砜濃度為 2、5、10、15、30、50μg/L。豬肝臟基質(zhì)匹配液中托曲珠利砜濃度為 10、25、50、75、100、120μg/L，豬腎臟基質(zhì)匹配液中托曲珠利砜濃度為 5、10、12.5、25、50、70μg/L，豬肌肉基質(zhì)匹配液中托曲珠利砜濃度為 3、5、10、15、20、30μg/L，豬皮膚+脂肪基質(zhì)匹配液中托曲珠利砜濃度為 5、7.5、10、15、30、50μg/L。雞肝臟基質(zhì)匹配液中托曲珠利砜濃度為 15、30、60、75、120、150μg/L，雞腎臟基質(zhì)匹配液中托曲珠利砜濃度為 15、20、40、60、80、100μg/L，雞肌肉基質(zhì)匹配液中托曲珠利砜濃度為 3、5、7.5、10、15、20、30μg/L，雞皮膚+脂肪基質(zhì)匹配液中托曲珠利砜濃度為 7.5、10、15、20、40、50μg/L。上述基質(zhì)匹配液中，內(nèi)標(biāo)托曲珠利砜（N-甲基-d3）濃度均為100μg/L。采用內(nèi)標(biāo)法計算，以測得的托曲珠利砜及內(nèi)標(biāo)托曲珠利砜（N-甲基-d3）的定量離子質(zhì)量色譜峰面積之比為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的托曲珠利砜濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。7.3測定7.3.1液相色譜參考條件色譜柱：C18（4.6×150mm，5μm），或相當(dāng)者；流動相：A相為含甲酸的10mmol/L甲酸銨水溶液；B相為含甲酸的10mmol/L甲酸銨甲醇溶液；流速：0.5mL/min；柱溫：60℃；進(jìn)樣量：5μL；梯度洗脫：梯度程序見表1；表1梯度洗脫程序時間（min）流速（mL/min）流動相A（%）流動相B（%）00.590101.00.590105.50.55959.00.5901013.00.590107.3.2質(zhì)譜參考條件離子源：電噴霧離子源掃描方式：負(fù)離子掃描檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測電離電壓：4.0KV霧化溫度：300℃霧化氣流速：8L/min測試藥物定性、定量離子對及對應(yīng)的裂解電壓、碰撞能量見表2。表2托曲珠利砜及其內(nèi)標(biāo)的定性、定量離子對及裂解電壓、碰撞能量化合物名稱離子對（m/z）裂解電壓（V）碰撞能量（eV）托曲珠利砜456.0/399.012010456.0/42.2a12024托曲珠利砜（N-甲基12020-d3）459.0/42.2（a定量離子對）注：以上參數(shù)為AgilentTechnologies6470測定托曲珠利砜的最適參數(shù)。對于不同儀器，參數(shù)可能存在差異，測定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。另外，應(yīng)對上述參數(shù)定期檢查，如有必要，應(yīng)相應(yīng)調(diào)整。測定法取試樣溶液和相應(yīng)的基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，作單點或多點校準(zhǔn)，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比計算。對照溶液及試樣溶液中托曲珠利砜和托曲珠利砜 （N-甲基-d3）的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。試樣溶液中的離子相對豐度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對豐度比符合表 3的要求。標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白組織添加試樣溶液的各特征離子的質(zhì)量色譜圖見附錄 B。表3 試樣溶液中離子相對豐度的允許偏差范圍相對離子豐度

50%

20%至

50%

10%至

20%

≤10%允許的相對偏差

±20%

±25%

±30%

±50%7.4空白試驗取空白試料，采用完全相同的步驟進(jìn)行平行操作。8結(jié)果計算與表述單點校準(zhǔn)：CAA'isCsCis（1）AisAsC'is或標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)：由AsaCsA'isb求得a和b，則C'isCis(ACb)（2）Ais試料中托曲珠利砜殘留量按式（ 3）計算：CV（3）m式中：C——試樣溶液中托曲珠利砜的濃度， ng/mL；Cis——試樣溶液中托曲珠利砜（ N-甲基-d3）的濃度，ng/mL；Cs——標(biāo)準(zhǔn)溶液中托曲珠利砜的濃度， ng/mL；C’is——標(biāo)準(zhǔn)溶液中托曲珠利砜（ N-甲基-d3）的濃度， ng/mL；——試樣溶液中托曲珠利砜的峰面積；Ais——試樣溶液中托曲珠利砜（ N-甲基-d3）的峰面積；As——標(biāo)準(zhǔn)溶液中托曲珠利砜的峰面積；A’is——標(biāo)準(zhǔn)溶液中托曲珠利砜（ N-甲基-d3）的峰面積；X——試料中托曲珠利砜殘留量， μg/kg；V——提取物的最終體積， mL；m——組織樣品的質(zhì)量， g。注：計算結(jié)果需扣除空白值，測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度9.1靈敏度本方法在豬、牛和雞的肝臟、腎臟、肌肉、脂肪的檢測限均為20μg/kg，牛和豬的肝臟、腎臟、肌肉、脂肪定量限分別為250、125、50、75μg/kg，雞肝臟、腎臟、肌肉、皮膚+脂肪定量限分別為300、200、50、100μg/kg。9.2準(zhǔn)確度本方法托曲珠利砜在牛肌肉 50μg/kg～200μg/kg、牛肝臟250μg/kg～1000μg/kg、牛腎臟125μg/kg～500μg/kg、牛脂肪75μg/kg～300μg/kg；豬肌肉50μg/kg～200μg/kg、豬肝臟250μg/kg～1000μg/kg、豬腎臟125μg/kg～500μg/kg、豬皮脂75μg/kg～300μg/kg、雞肌肉50μg/kg～200μg/kg、雞肝臟300μg/kg～1200μg/kg、雞腎臟200μg/kg～800μg/kg、雞皮脂100μg/kg～400μg/kg的添加濃度水平上，回收率均為 70%～110%。9.3精密度本方法的批內(nèi)變異系數(shù) ≤20%，批間變異系數(shù) ≤20%。附錄A（資料性附錄）托曲珠利砜及托曲珠利砜 （N-甲基-d3）內(nèi)標(biāo)對照品信息名稱托曲珠利砜托曲珠利砜（N-甲基-d3）分子式C181433618311336HFNOSCDHFNOS分子量457.38460.40純度≥98.0%≥98.0%結(jié)構(gòu)式x10210.80.60.40.20x10210.80.60.40.20

11

附錄B（資料性附錄）托曲珠利砜特征離子質(zhì)量色譜圖8.6478.651

11123456789101112Counts(%)vs.AcquisitionTime(min)圖B.1托曲珠利砜及內(nèi)標(biāo)托曲珠利砜-d3標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子質(zhì)量色譜圖（上圖托曲珠利砜-d3：50μg/L；下圖托曲珠利砜：50μg/L）x1021 110.80.60.40.20x1021 110.80.60.40.20123456789101112Counts(%)vs.AcquisitionTime(min)圖B.2 空白牛肝臟特征離子質(zhì)量色譜圖圖B.3 牛肝臟基質(zhì)添加托曲珠利砜及內(nèi)標(biāo)特征離子質(zhì)量 圖B.4 牛肝臟中添加托曲珠利砜及內(nèi)標(biāo)特征離子質(zhì)量色色譜圖 譜圖（上圖托曲珠利砜 -d3：100μg/L；下圖托曲珠利砜： 10μg/L） （上圖托曲珠利砜 -d3：100μg/L；下圖托曲珠利砜： 250μg/kg）x1021 110.80.60.40.20x1021 110.80.60.40.20123456789101112Counts(%)vs.AcquisitionTime(min)圖B.5 空白豬肝臟特征離子質(zhì)量色譜圖圖B.6 豬肝臟基質(zhì)添加托曲珠利砜及內(nèi)標(biāo)特征離子質(zhì)量 圖B.7 豬肝臟中添加托曲珠利砜及內(nèi)標(biāo)特征離子質(zhì)量色色譜圖 譜圖（上圖托曲珠利砜 -d3：100μg/L；下圖托曲珠利砜： 10μg/L） （上圖托曲珠利砜 -