血站核酸檢測(cè)課件

血站核酸檢測(cè)甘肅省紅十字血液中心血站核酸檢測(cè)的意義核酸檢測(cè)（NAT）可以有效地縮短病毒特異抗原和抗體免疫測(cè)定的“窗口期”，從而減少輸血風(fēng)險(xiǎn)，提高輸血安全。乙型肝炎病毒（HBV）感染檢測(cè)中，NAT除可縮短HBV感染檢測(cè)的窗口期外，還可以減少HBV急性感染恢復(fù)期、慢性隱匿性HBV感染以及變異病毒株感染的漏檢。丙型肝炎病毒（HCV）感染檢測(cè)中，可將HCV感染檢測(cè)的窗口期縮短，減少免疫靜默感染的漏檢。人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）感染檢測(cè)中，可將HIV感染檢測(cè)的窗口期縮短。核酸研究的歷史

1869米舍爾（FriedrichMiescher）從膿球分離出細(xì)胞核，不受蛋白酶分解，磷含量高，命名為“核素”(nuclein)。1944美國(guó)微生物學(xué)家埃弗里（O.T.Avery）等的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。1953沃森和克里克（WATSON，CRICK）-DNA雙螺旋FrancisCrick

核酸研究的歷史

1960年代中期桑格(Sanger)的DNA測(cè)序法1972伯格(PaulBerg)–重組DNA技術(shù)引起人腫瘤的猴病毒基因與噬菌體lambda的重組1973博耶（HerbertBoyer）和科恩（StanleyCohen）-使用重組DNA技術(shù)首次得到了重組DNA微生物(基因工程技術(shù))1983穆利斯（KaryMullis)–PCR技術(shù)核酸的種類(lèi)DEOXYRIBONUCLEICACID（DNA）RIBONUCLEICACID（RNA）——ribosomeRNA(rRNA)transferRNA(tRNA)messengerRNA(mRNA)核酸的理化性質(zhì)核酸分子具有強(qiáng)烈的紫外吸收DNA變性是雙鏈解離為單鏈的過(guò)程DNA的增色效應(yīng)Tm值變性的核酸可以復(fù)性或形成雜交雙鏈復(fù)性退火核酸檢測(cè)基本原理核酸檢測(cè)：一系列直接檢測(cè)病原體核酸的技術(shù)的總稱(chēng)，對(duì)靶核酸直接擴(kuò)增或?qū)ζ涓綆У男盘?hào)擴(kuò)增，使看不見(jiàn)的極微量的核酸變成直觀的光電或可視信號(hào)。NAT檢測(cè)技術(shù)方法PCR擴(kuò)增技術(shù)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增方法（TMA、NASBA）其它NAT技術(shù)（bDNA、LAMP、LCR、SDA等）PCR原理DNADNATMA的原理Transcription-MediatedAmplification轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)模擬DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的自然過(guò)程DNA模板在反應(yīng)中作為中介利用2個(gè)引物和2種酶(RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶）RNA聚合酶與DNA模板的啟動(dòng)子序列結(jié)合等溫?cái)U(kuò)增（41.5℃）轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄理想的核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)A核酸擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的一般原則各區(qū)獨(dú)立注意風(fēng)向因地制宜方便工作關(guān)于“區(qū)域”合并如使用擴(kuò)增和產(chǎn)物分析同時(shí)完成的實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)，擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可以合并。如使用核酸提取、擴(kuò)增及產(chǎn)物分析等均在一臺(tái)儀器上完成的全自動(dòng)核酸檢測(cè)分析儀，標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可合并。核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的工作流程試劑準(zhǔn)備區(qū)

標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)及擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)試劑貯存準(zhǔn)備區(qū)核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室中最為“潔凈”的區(qū)域，不應(yīng)有任何核酸的存在，包括試劑中所帶的標(biāo)準(zhǔn)品和陽(yáng)性對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)用潔凈物品如離心管、吸頭等的存放和準(zhǔn)備處。商品試劑盒自制試劑：一次較大量配制，然后分裝成小瓶保存，每次檢測(cè)時(shí)，取出一小瓶使用，未用完的即棄掉，不再使用。儀器設(shè)備主要有加樣器、天平、離心機(jī)和冰箱等，最好配備超凈工作臺(tái)。標(biāo)本制備區(qū)儀器設(shè)備主要有混樣設(shè)備、核酸提取儀、生物安全柜、加樣器、高速臺(tái)式（冷凍）離心機(jī)、加熱模塊或水浴箱、冰箱等。生物安全柜不應(yīng)放在實(shí)驗(yàn)室門(mén)口等易受人員走動(dòng)影響的地方，也不應(yīng)直對(duì)分體式空調(diào)。主要是用于血液樣本的混樣、核酸樣本的提取。加樣器吸頭必須帶濾芯。使用加熱模塊時(shí)，如在模塊孔中填入二氧化硅細(xì)砂，然后將標(biāo)本管置于細(xì)砂中溫育，可得到較為一致的溫育溫度。擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)熱循環(huán)儀的電源應(yīng)專(zhuān)用，并配備一個(gè)不間斷電源（UPS）或穩(wěn)壓電源。每次擴(kuò)增后，可使用可移動(dòng)紫外燈對(duì)擴(kuò)增熱循環(huán)儀進(jìn)行照射。擴(kuò)增儀應(yīng)定期進(jìn)行校準(zhǔn)。工作流程關(guān)注采集、保存、運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵點(diǎn)留樣方式、采血管采血后什么時(shí)間離心采血后保存溫度、時(shí)間離心后保存溫度、時(shí)間（運(yùn)輸）檢測(cè)前的保存溫度、時(shí)間長(zhǎng)期保存的樣本第一步：標(biāo)本的采集-采血管無(wú)菌真空采血管一、血清管普通血清管帶分離膠的血清管二、抗凝管EDTA2K或3K抗凝管EDTA2K抗凝間分離膠（PPT)枸櫞酸鈉抗凝管……第一步：標(biāo)本的采集-留樣方式最佳方式：旁袋1管5ml用于核酸檢測(cè)2管5ml用于酶免疫測(cè)定等3管用于長(zhǎng)期保存留樣旁路采樣1管5ml用于核酸檢測(cè)2管5ml用于酶免疫測(cè)定等3管用于長(zhǎng)期保存留樣小辮留樣(不可取)1管5ml用于核酸檢測(cè)2管5ml用于酶免疫測(cè)定等第二步：標(biāo)本的采集-離心離心條件800-1600g20min離心時(shí)間4小時(shí)以?xún)?nèi)以免RNA的降解第三步：標(biāo)本的運(yùn)送應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本溫度2-8°C符合生物安全標(biāo)準(zhǔn)第四步：標(biāo)本的接收保存確認(rèn)標(biāo)本數(shù)量運(yùn)輸狀態(tài)標(biāo)本狀態(tài)：溶血、脂血保存：用于檢測(cè)的樣本管：檢測(cè)前保存4小時(shí)內(nèi)離心，離心后2天內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可存放2-8°C。用于留樣備查的樣本：3個(gè)月以?xún)?nèi)存放于-20°C以下，3個(gè)月以上置于-70°C以下。樣本匯集在Star上進(jìn)行準(zhǔn)備工作：將采血管開(kāi)蓋后裝載到專(zhuān)用32孔樣品架上。采血管上條形碼一律面向條碼掃描器，以方便掃描條碼。按照要求，將TIP頭、PCR板、24深孔板、洗脫管、磁套、廢棄管放置于平臺(tái)相應(yīng)位置。樣本匯集樣本匯集樣本匯集核酸提取同樣在Star核酸提取儀上進(jìn)行，緊跟Pooling之后，利用自動(dòng)移液配置裂解液、結(jié)合液、洗液、洗脫液等，利用磁性分離功能自動(dòng)完成核酸樣本的裂解、提取、純化、PCR試劑配制、PCR上樣等實(shí)驗(yàn)操作。核酸擴(kuò)增結(jié)果確認(rèn)

陰性反應(yīng)：進(jìn)入合格血液的放行程序。陽(yáng)性反應(yīng)：?jiǎn)螜z分項(xiàng)目檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)單檢混合項(xiàng)目檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)混樣分項(xiàng)目檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)混樣混合項(xiàng)目檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)混樣分項(xiàng)目檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行雙孔拆分檢測(cè)檢出陽(yáng)性標(biāo)本陽(yáng)性反應(yīng)標(biāo)本陰性反應(yīng)標(biāo)本進(jìn)入血液的隔離程序，填寫(xiě)相關(guān)報(bào)表，將標(biāo)本及血液篩查檢測(cè)報(bào)告送衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心進(jìn)入合格血液的放行程序全部標(biāo)本為陰性反應(yīng)進(jìn)入合格血液的放行程序，實(shí)驗(yàn)室需查找原因并完成分析報(bào)告質(zhì)量控制室內(nèi)質(zhì)量控制室間質(zhì)量評(píng)價(jià)遼寧省血液中心實(shí)驗(yàn)室工作調(diào)整工作模式:早8晚4標(biāo)本接收--采血當(dāng)天EIA檢測(cè)--采集后第2天,當(dāng)天出最終結(jié)論報(bào)告.核酸檢測(cè):全血EIA(合格)→NAT(第3天)血小板:EIA與NAT平行檢測(cè)(第2天)采用依據(jù):快篩、陽(yáng)性率低確保報(bào)告時(shí)限血小板30小時(shí)全血54小時(shí)7+1檢測(cè)模式標(biāo)本質(zhì)量的控制采血管選擇采樣方式旁袋采樣（理想）血袋導(dǎo)管采樣(被稀釋的可能、規(guī)定順序-風(fēng)險(xiǎn)降到最低)標(biāo)本正確標(biāo)識(shí)措施：動(dòng)作連續(xù)不能中斷清場(chǎng)計(jì)算機(jī)控制（PDA實(shí)物核查、及時(shí)傳輸采集信息）離心時(shí)間4小時(shí)內(nèi)計(jì)算機(jī)控制—保證標(biāo)本、血液同源標(biāo)本采集人員采用PDA對(duì)血袋、標(biāo)本管等實(shí)物進(jìn)行核查離心處理一、標(biāo)本采集后離心離心處理二、標(biāo)本接收后實(shí)驗(yàn)室再離心江蘇省血液中心

核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置－應(yīng)關(guān)注的細(xì)節(jié)各實(shí)驗(yàn)區(qū)可以移動(dòng)的物品最好用不同顏色進(jìn)行標(biāo)記。以防各區(qū)混用。樣品制備室最好多配備一臺(tái)4℃樣品冰箱，用于混樣后樣品的臨時(shí)保存；陰陽(yáng)性對(duì)照試劑盒的保存。樣品制備室最好配備開(kāi)蓋機(jī)，用于真空采血管的去帽。在樣品制備室，實(shí)驗(yàn)耗材、試劑準(zhǔn)備區(qū)域和樣品處理區(qū)域最好分開(kāi)。核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置－應(yīng)關(guān)注的細(xì)節(jié)各區(qū)還需配備：無(wú)粉手套，專(zhuān)用工作服，一次性鞋套、口罩，一次性吸水紙，紗布?jí)K。5～5.5g/100ml的次氯酸鈉溶液，７０％的乙醇溶液等。在樣本制備區(qū)，生物安全柜不應(yīng)放在實(shí)驗(yàn)室門(mén)口等易受人員走動(dòng)影響的地方，也不應(yīng)直對(duì)分體式空調(diào)?；鞓觾x的加樣吸頭必須帶濾芯。樣品制備區(qū)和核酸檢測(cè)區(qū)的儀器還應(yīng)配備ＵＰＳ電源。核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置－江蘇省血液中心核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)介實(shí)驗(yàn)分區(qū)：分4個(gè)室(區(qū))：試劑準(zhǔn)備室(區(qū))，為藍(lán)色標(biāo)記；標(biāo)本制備室(區(qū))，為綠色標(biāo)記；核酸擴(kuò)增檢測(cè)室(區(qū))，為黃色標(biāo)記；全自動(dòng)核酸檢測(cè)室(區(qū))，為灰色標(biāo)記。采用的檢測(cè)系統(tǒng)：科華和羅氏兩套檢測(cè)系統(tǒng),兩者共用試劑準(zhǔn)備室(區(qū))和標(biāo)本制備室(區(qū))，核酸擴(kuò)增檢測(cè)分別在各自的擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。核酸檢測(cè)樣品的質(zhì)量保證－應(yīng)注意的細(xì)節(jié)首先要制定樣品采集手冊(cè)，并對(duì)采血人員進(jìn)行全員培訓(xùn)。采血管的選擇：最好選擇EDTA2K或3K抗凝帶分離膠的抗凝管。注意樣品采集后的充分混勻，一般顛倒５次以上。樣品離心：應(yīng)采用大容量低溫離心機(jī)，離心要充分，離心條件最好１６００g、２０分鐘。樣品的開(kāi)蓋：應(yīng)在離心后，放４℃冰箱靜置３０min后，再開(kāi)蓋。應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行?；鞓又敛鸱謾z測(cè)其間,將樣品放４℃冰箱臨時(shí)保存。核酸檢測(cè)樣品的質(zhì)量保證標(biāo)本的采集:采用無(wú)DNA酶、無(wú)RNA酶、帶分離膠、EDTA-K2抗凝、無(wú)菌真空采血管(B