DNA重組技術(shù)的基本工具一教學(xué)課件

§1-1DNA重組技術(shù)的基本工具南昌市第二中學(xué)付曉華

§1-1DNA重組技術(shù)的基本工具南昌市第二中學(xué)付曉華w1基因工程專題1基因工程專題12煙草

據(jù)WTO調(diào)查：2004年全世界因狂犬病致死人數(shù)約5.5萬(wàn)人中國(guó)衛(wèi)生部通報(bào)：2004年７月，狂犬病列法定報(bào)告?zhèn)魅静∷劳鰯?shù)之首。發(fā)病死亡率近100%

能產(chǎn)生狂犬病抗體蛋白的轉(zhuǎn)基因

煙草據(jù)WTO調(diào)查：2004年全世界因狂犬病致死人數(shù)約5.53每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。

1979年，美國(guó)將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌生產(chǎn)胰島素，大大降低了生產(chǎn)成本。治療糖尿病特效藥——據(jù)WTO調(diào)查：

2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國(guó)約6000萬(wàn)。胰島素思考：轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)了一種生物的某些性狀在另一種生物中表達(dá)。這些性狀的表達(dá)與我們學(xué)過的基因的什么過程有關(guān)？密碼子在生物界是的！DNA(基因)

mRNA蛋白質(zhì)(性狀)轉(zhuǎn)錄翻譯通用

每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。1979年4定向基因改造設(shè)想

設(shè)想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？能否讓細(xì)菌“吐出”蠶絲？設(shè)想二能否讓微生物產(chǎn)生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？設(shè)想三

定向基因改造設(shè)想設(shè)想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的5基因工程的產(chǎn)物

基因工程的產(chǎn)物www.jx6什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重組技術(shù)。是指按照人們的愿望，在DNA分子水平上進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?；蚬こ痰母拍?/p>

什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重組技術(shù)7基因工程的概念基因工程的別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過程結(jié)果DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的新生物類型和產(chǎn)品剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)

基因工程的概念基因工程的別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過程8基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論達(dá)爾文提出生物進(jìn)化論

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論達(dá)爾9基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論孟德爾提出基因的分離定律和自由組合定律

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論孟德10基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論

摩爾根證明基因在染色體上，并提出基因的連鎖互換定律。

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論11基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體。

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論12基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論13基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復(fù)制

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論梅塞14基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論克里15基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實(shí)驗(yàn)加以證明。

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論16基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路1)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2)工具酶的發(fā)現(xiàn)3)DNA合成和測(cè)序技術(shù)的發(fā)明4)DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)5)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功6)第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問世7)PCR技術(shù)的發(fā)明

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路1)基因轉(zhuǎn)移載體17問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。

想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉

問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。18基因工程培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程：在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點(diǎn)是什么？普通棉花(無(wú)抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因通過運(yùn)載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因棉花含抗蟲基因轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生伴胞晶體轉(zhuǎn)基因棉花有抗蟲特性

基因工程培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程：在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點(diǎn)是什19基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞

基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽20解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子縫合針”——DNA連接酶“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體

解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀”——限21第1節(jié)DNA重組技術(shù)的基本工具第1節(jié)DNA重組技術(shù)的基本工具22一、“分子手術(shù)刀”二、“分子縫合針”三、“分子運(yùn)輸車”Goon轉(zhuǎn)基因

一、“分子手術(shù)刀”Goon轉(zhuǎn)基因www.jxjyzy.c23思考：⒈自然界是否存在一種生物的DNA進(jìn)入另一生物的情況？⒉動(dòng)物容易讓外來(lái)DNA侵入自身而得以遺傳嗎？為什么？植物呢？⒊單細(xì)胞生物，容易遭到入侵嗎？⒋單細(xì)胞生物并沒有在進(jìn)化中滅絕，而是產(chǎn)生了一些特殊的酶來(lái)防范。這些酶應(yīng)該有什么特點(diǎn)？可能酶能識(shí)別外來(lái)侵入的DNA并將其分解，而對(duì)自身的DNA不能起作用。“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶

思考：⒈自然界是否存在一種生物的DNA進(jìn)入另一生物的情況？24一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”⒈主要來(lái)源：⒉種類與命名：⒊作用特點(diǎn)：⒋作用結(jié)果：原核生物閱讀“分子的手術(shù)刀”1min

一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”⒈主要來(lái)源：原核生物閱25一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”⒈主要來(lái)源：⒉種類與命名：⒊作用特點(diǎn)：4.限制酶識(shí)別序列5.作用結(jié)果：識(shí)別特定核苷酸序列原核生物產(chǎn)生黏性末端或平末端Goon,切斷磷酸二酯鍵具有特異性。一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成少數(shù)的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成

一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”⒈主要來(lái)源：識(shí)別特定核26⒉種類與命名：現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內(nèi)切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratiamarcesens）大腸桿菌（EscherichiacoliR）Goback練習(xí)：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ

⒉種類與命名：現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分27

T磷酸二酯鍵1234512345

A

T磷酸二酯鍵1234512345Awww.jxjyz28Goback

Gowww.j29限制酶的識(shí)別序列：Goback

限制酶的識(shí)別序列：Go30SmaⅠ平末端平末端

SmaⅠ平末端平末端31

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Gobackwww.32

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback重復(fù)演示

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback重復(fù)演示33限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線（如圖），中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向、對(duì)稱、重復(fù)排列的。想一想限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？

限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿34尋根問底你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。

尋根問底你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？35要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來(lái)，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考?

要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾36Goback……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來(lái)源的DNA片段混合將不同種來(lái)源的DNA片段連接起來(lái)生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G…………G

AATTC…………CTTAA

G……酶切

Goback……GAATTC…………GAATTC……Ec37例1：科學(xué)家們經(jīng)過多年的努力，創(chuàng)立了一種新興生物技術(shù)——基因工程，實(shí)施該工程的最終目的是A.定向提取生物體的DNA分子B.定向地對(duì)DNA分子進(jìn)行人工“剪切”C.在生物體外對(duì)DNA分子進(jìn)行改造D.定向地改造生物的遺傳性狀D隨堂反饋

例1：科學(xué)家們經(jīng)過多年的努力，創(chuàng)立了D隨堂反饋www.jxj38例2.下列有關(guān)基因工程中限制酶的描述，錯(cuò)誤的是A.一種限制酶只能識(shí)別一種特定的脫氧苷酸序列B.限制酶的活性受溫度的影響C.限制酶能識(shí)別和切割RNAD.限制酶可從原核生物中提取C

例2.下列有關(guān)基因工程中限制酶的描述，錯(cuò)誤的是A.一種限制39例3：同一種限制酶切割成的黏性末端是A.①②B.①③C.①④D.②③A

例3：同一種限制酶切割成的黏性末端是A.①②40基因工程還需要哪些工具？一、“分子手術(shù)刀”二、“分子縫合針”三、“分子運(yùn)輸車”

基因工程還需要哪些工具？一、“分子手術(shù)刀”www.jxjyz41謝謝大家！

謝謝大家！42§1-1DNA重組技術(shù)的基本工具南昌市第二中學(xué)付曉華

§1-1DNA重組技術(shù)的基本工具南昌市第二中學(xué)付曉華w43第1節(jié)DNA重組技術(shù)的基本工具第1節(jié)DNA重組技術(shù)的基本工具44一、“分子手術(shù)刀”二、“分子縫合針”三、“分子運(yùn)輸車”Goon轉(zhuǎn)基因

一、“分子手術(shù)刀”Goon轉(zhuǎn)基因www.jxjyzy.c45一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”⒈主要來(lái)源：⒉種類與命名：⒊作用特點(diǎn)：⒋作用結(jié)果：復(fù)習(xí)

一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”⒈主要來(lái)源：復(fù)習(xí)www46二、“分子縫合針”——DNA連接酶①作用:把切下來(lái)的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來(lái).②作用原理：催化磷酸二酯鍵形成

二、“分子縫合針”——DNA連接酶①作用:47可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，E·co48

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率較低T4DNA連接酶

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效49③類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別（二）“分子縫合針”——DNA連接酶

③類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能50DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點(diǎn)尋根問底DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)，不需要模板Goon

DNA聚合酶DNA連接酶相同點(diǎn)尋根問底DNA連接酶與DNA51模擬制作：用剪刀在特定部位對(duì)棉花DNA進(jìn)行模擬切割，并將模擬毒蛋白基因取出，再用膠紙模擬基因種間連接。棉花的

一段DNA

含毒蛋白基因的細(xì)菌DNA片段Goback

模擬制作：用剪刀在特定部位對(duì)棉花DNA進(jìn)行模擬切割，并52三、“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體⒈載體需要的條件：⑴有1~多個(gè)限制酶切點(diǎn)⑵對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害⑶導(dǎo)入基因能在受體細(xì)胞中復(fù)制、表達(dá)⑷有某些標(biāo)記基因，便于篩選⒉常用運(yùn)載體：⑴細(xì)菌的質(zhì)粒⑵噬菌體或某些動(dòng)植物病毒⑶假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制或不能轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基因生物能有預(yù)想的效果嗎？⑴作為分子運(yùn)輸車——載體，如果沒有切割位點(diǎn)將會(huì)怎樣？⑵霍亂菌的質(zhì)粒多個(gè)限制酶切點(diǎn)，你會(huì)用它來(lái)做分子運(yùn)輸車嗎？

⑷目的基因有沒有進(jìn)入受體細(xì)胞，如何去發(fā)現(xiàn)？

三、“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體⒈載體需要的條53常用的載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別

常用的載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)54Goon

Gowww.jxd5527483615Goback

27483615Go56思考與探究P71、為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？通過長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。

思考與探究P71、為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？572、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒（plasmid），即獨(dú)立于細(xì)菌擬核染色體DNA之外的一種可以自我復(fù)制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？不是，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：思考與探究P7

2、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示581）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。3）載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。4）載體DNA必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。

1）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基593、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？

迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來(lái)會(huì)發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。思考與探究P7

3、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？迄今為60已知標(biāo)記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素的基因，現(xiàn)探討某細(xì)菌的質(zhì)粒中有無(wú)標(biāo)記基因或標(biāo)記基因是什么？請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并得出相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。對(duì)照組：不添加抗生素實(shí)驗(yàn)組1：添加一定濃度的四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組2：添加一定濃度的氨芐青霉素實(shí)驗(yàn)組3：添加一定濃度的四環(huán)素和氨芐青霉素隨堂練習(xí)

已知標(biāo)記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素的基因，61對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2實(shí)驗(yàn)組3結(jié)論預(yù)期一＋＋＋＋預(yù)期二＋＋－－預(yù)期三＋－＋－預(yù)期四＋－－－對(duì)照組：不添加抗生素實(shí)驗(yàn)組1：添加一定濃度的四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組2：添加一定濃度的氨芐青霉素實(shí)驗(yàn)組3：添加一定濃度的四環(huán)素和氨芐青霉素既含有抗四環(huán)素基因也含有抗氨芐青霉素基因只含有抗四環(huán)素基因只含有抗氨芐青霉素基因既不含有抗四環(huán)素基因也不含有抗氨芐青霉素基因

對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2實(shí)驗(yàn)組3結(jié)論預(yù)期一＋＋＋＋預(yù)期二＋＋62使用下列工具，如何進(jìn)行操作？一、“分子手術(shù)刀”二、“分子縫合針”三、“分子運(yùn)輸車”

使用下列工具，如何進(jìn)行操作？一、“分子手術(shù)刀”www.jxj63謝謝大家！

謝謝大家！64§1-1DNA重組技術(shù)的基本工具南昌市第二中學(xué)付曉華

§1-1DNA重組技術(shù)的基本工具南昌市第二中學(xué)付曉華w65基因工程專題1基因工程專題166煙草

據(jù)WTO調(diào)查：2004年全世界因狂犬病致死人數(shù)約5.5萬(wàn)人中國(guó)衛(wèi)生部通報(bào)：2004年７月，狂犬病列法定報(bào)告?zhèn)魅静∷劳鰯?shù)之首。發(fā)病死亡率近100%

能產(chǎn)生狂犬病抗體蛋白的轉(zhuǎn)基因

煙草據(jù)WTO調(diào)查：2004年全世界因狂犬病致死人數(shù)約5.567每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。

1979年，美國(guó)將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌生產(chǎn)胰島素，大大降低了生產(chǎn)成本。治療糖尿病特效藥——據(jù)WTO調(diào)查：

2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國(guó)約6000萬(wàn)。胰島素思考：轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)了一種生物的某些性狀在另一種生物中表達(dá)。這些性狀的表達(dá)與我們學(xué)過的基因的什么過程有關(guān)？密碼子在生物界是的！DNA(基因)

mRNA蛋白質(zhì)(性狀)轉(zhuǎn)錄翻譯通用

每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。1979年68定向基因改造設(shè)想

設(shè)想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？能否讓細(xì)菌“吐出”蠶絲？設(shè)想二能否讓微生物產(chǎn)生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？設(shè)想三

定向基因改造設(shè)想設(shè)想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的69基因工程的產(chǎn)物

基因工程的產(chǎn)物www.jx70什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重組技術(shù)。是指按照人們的愿望，在DNA分子水平上進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。基因工程的概念

什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重組技術(shù)71基因工程的概念基因工程的別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過程結(jié)果DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的新生物類型和產(chǎn)品剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)

基因工程的概念基因工程的別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過程72基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論達(dá)爾文提出生物進(jìn)化論

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論達(dá)爾73基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論孟德爾提出基因的分離定律和自由組合定律

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論孟德74基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論

摩爾根證明基因在染色體上，并提出基因的連鎖互換定律。

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論75基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體。

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論76基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論77基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復(fù)制

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論梅塞78基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論克里79基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實(shí)驗(yàn)加以證明。

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論80基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路1)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2)工具酶的發(fā)現(xiàn)3)DNA合成和測(cè)序技術(shù)的發(fā)明4)DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)5)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功6)第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問世7)PCR技術(shù)的發(fā)明

基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路1)基因轉(zhuǎn)移載體81問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。

想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉

問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。82基因工程培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程：在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點(diǎn)是什么？普通棉花(無(wú)抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因通過運(yùn)載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因棉花含抗蟲基因轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生伴胞晶體轉(zhuǎn)基因棉花有抗蟲特性

基因工程培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程：在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點(diǎn)是什83基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞

基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽84解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子縫合針”——DNA連接酶“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體

解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀”——限85第1節(jié)DNA重組技術(shù)的基本工具第1節(jié)DNA重組技術(shù)的基本工具86一、“分子手術(shù)刀”二、“分子縫合針”三、“分子運(yùn)輸車”Goon轉(zhuǎn)基因

一、“分子手術(shù)刀”Goon轉(zhuǎn)基因www.jxjyzy.c87思考：⒈自然界是否存在一種生物的DNA進(jìn)入另一生物的情況？⒉動(dòng)物容易讓外來(lái)DNA侵入自身而得以遺傳嗎？為什么？植物呢？⒊單細(xì)胞生物，容易遭到入侵嗎？⒋單細(xì)胞生物并沒有在進(jìn)化中滅絕，而是產(chǎn)生了一些特殊的酶來(lái)防范。這些酶應(yīng)該有什么特點(diǎn)？可能酶能識(shí)別外來(lái)侵入的DNA并將其分解，而對(duì)自身的DNA不能起作用。“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶

思考：⒈自然界是否存在一種生物的DNA進(jìn)入另一生物的情況？88一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”⒈主要來(lái)源：⒉種類與命名：⒊作用特點(diǎn)：⒋作用結(jié)果：原核生物閱讀“分子的手術(shù)刀”1min

一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”⒈主要來(lái)源：原核生物閱89一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”⒈主要來(lái)源：⒉種類與命名：⒊作用特點(diǎn)：4.限制酶識(shí)別序列5.作用結(jié)果：識(shí)別特定核苷酸序列原核生物產(chǎn)生黏性末端或平末端Goon,切斷磷酸二酯鍵具有特異性。一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成少數(shù)的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成

一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”⒈主要來(lái)源：識(shí)別特定核90⒉種類與命名：現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內(nèi)切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratiamarcesens）大腸桿菌（EscherichiacoliR）Goback練習(xí)：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ

⒉種類與命名：現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分91

T磷酸二酯鍵1234512345

A

T磷酸二酯鍵1234512345Awww.jxjyz92Goback

Gowww.j93限制酶的識(shí)別序列：Goback

限制酶的識(shí)別序列：Go94SmaⅠ平末端平末端

SmaⅠ平末端平末端95

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Gobackwww.96

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback重復(fù)演示

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback重復(fù)演示97限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線（如圖），中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向、對(duì)稱、重復(fù)排列的。想一想限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？

限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿98尋根問底你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。

尋根問底你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？99要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來(lái)，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考?

要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾100Goback……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來(lái)源的DNA片段混合將不同種來(lái)源的DNA片段連接起來(lái)生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G…………G

AATTC…………CTTAA

G……酶切

Goback……GAATTC…………GAATTC……Ec101例1：科學(xué)家們經(jīng)過多年的努力，創(chuàng)立了一種新興生物技術(shù)——基因工程，實(shí)施該工程的最終目的是A.定向提取生物體的DNA分子B.定向地對(duì)DNA分子進(jìn)行人工“剪切”C.在生物體外對(duì)DNA分子進(jìn)行改造D.定向地改造生物的遺傳性狀D隨堂反饋

例1：科學(xué)家們經(jīng)過多年的努力，創(chuàng)立了D隨堂反饋www.jxj102例2.下列有關(guān)基因工程中限制酶的描述，錯(cuò)誤的是A.一種限制酶只能識(shí)別一種特定的脫氧苷酸序列B.限制酶的活性受溫度的影響C.限制酶能識(shí)別和切割RNAD.限制酶可從原核生物中提取C

例2.下列有關(guān)基因工程中限制酶的描述，錯(cuò)誤的是A.一種限制103例3：同一種限制酶切割成的黏性末端是A.①②B.①③C.①④D.②③A

例3：同一種限制酶切割成的黏性末端是A.①②104基因工程還需要哪些工具？一、“分子手術(shù)刀”二、“分子縫合針”三、“分子運(yùn)輸車”

基因工程還需要哪些工具？一、“分子手術(shù)刀”www.jxjyz105謝謝大家！

謝謝大家！106§1-1DNA重組技術(shù)的基本工具南昌市第二中學(xué)付曉華

§1-1DNA重組技術(shù)的基本工具南昌市第二中學(xué)付曉華w107第1節(jié)DNA重組技術(shù)的基本工具第1節(jié)DNA重組技術(shù)的基本工具108一、“分子手術(shù)刀”二、“分子縫合針”三、“分子運(yùn)輸車”Goon轉(zhuǎn)基因

一、“分子手術(shù)刀”Goon轉(zhuǎn)基因www.jxjyzy.c109一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”⒈主要來(lái)源：⒉種類與命名：⒊作用特點(diǎn)：⒋作用結(jié)果：復(fù)習(xí)

一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”⒈主要來(lái)源：復(fù)習(xí)www110二、“分子縫合針”——DNA連接酶①作用:把切下來(lái)的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來(lái).②作用原理：催化磷酸二酯鍵形成

二、“分子縫合針”——DNA連接酶①作用:111可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，E·co112

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率較低T4DNA連接酶

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效113③類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別（二）“分子縫合針”——DNA連接酶

③類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能114DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點(diǎn)尋根問底DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)，不需要模板Goon

DNA聚合酶DNA連接酶相同點(diǎn)尋根問底DNA連接酶與DNA115模擬制作：用剪刀在特定部位對(duì)棉花DNA進(jìn)行模擬切割，并將模擬毒蛋白基因取出，再用膠紙模擬基因種間連接。棉花的

一段DNA

含毒蛋白基因的細(xì)菌DNA片段Goback

模擬制作：用剪刀在特定部位對(duì)棉花DNA進(jìn)行模擬切割，并116三、“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體⒈載體需要的條件：⑴有1~多個(gè)限制酶切點(diǎn)⑵對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害⑶導(dǎo)入基因能在受體細(xì)胞中復(fù)制、表達(dá)⑷有某些標(biāo)記基因，便于篩選⒉常用運(yùn)載體：⑴細(xì)菌的質(zhì)粒⑵噬菌體或某些動(dòng)植物病毒⑶假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制或不能轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基因生物能有預(yù)想的效果嗎？⑴作為分子運(yùn)輸車——載體，如果沒有切割位點(diǎn)將會(huì)怎樣？⑵霍亂菌的質(zhì)粒多個(gè)限制酶切點(diǎn)，你會(huì)用它來(lái)做分子運(yùn)輸車嗎？

⑷目的基因有沒有進(jìn)入受體細(xì)胞，如何去發(fā)現(xiàn)？

三、“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體⒈載體需要的條117常用的載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入