分析培訓(xùn)-rna-seq experimental pipeline信息

諾禾致Samplesof

生物學(xué)問生物學(xué)問題

cDNAfragmentation,sizeselection,linkerligationCondition(normal

Condition(colon

MaptoGenome

100sofmillionsof10sofbillionsbaseDownstream RNA-seq兩大部HighGoodHighGoodGoodScientificandysismethodRNA-seq實(shí)驗(yàn)流樣樣樣品檢文庫構(gòu)文庫庫上FromWeihuaZeng&AliMortazaviNatureimmunology程RNA-seq實(shí)驗(yàn)程樣樣品檢文庫構(gòu)文庫庫上FromWeihuaZeng&AliMortazaviNatureimmunology樣 含內(nèi)外

注意事諾禾致源部分提取方RIN蟲、蜂、蚊、棉鈴蟲、蝗蟲、螨等RIN藻體（大葉藻、鼠尾藻等RINRINCTAB法RINRNA-seq實(shí)驗(yàn)流樣樣樣樣品檢文文庫構(gòu)文文庫庫上上FromWeihuaZeng&AliNature樣品檢

四種方法全面評

雜質(zhì)污染/

降解程度／污 精確定 28S/18S比值和integritynumber(RIN)真實(shí)反饋樣品總量和完整度信原核生物中主要有5S、16S、23S真核生物中主要有5S、5.8S、18S、28SrRNA(植物25S） 蛋白殘 Qubit2.0原理：特異性結(jié)合的優(yōu)勢：排除其他物質(zhì)吸光度干擾，總量不8濃度體積總量Agilent2100Agilent2100 準(zhǔn)確評估樣品完整性，真實(shí)反 表達(dá)情況情況

植物情況

動物高等動 動 微生物 細(xì) 樣品完整性不理想的影響實(shí)驗(yàn)方建庫中間產(chǎn)物濃度不足，建庫失文庫濃度無法達(dá)到上機(jī)數(shù)據(jù)方無參項目：低表達(dá) ，可拼接不有參項目：低表達(dá) ，無法定RNA-seq實(shí)驗(yàn)流樣樣樣品檢文文庫構(gòu)文文庫庫上FromWeihuaZeng&AliMortazaviNatureimmunology

DGE（數(shù) 表達(dá)譜，DigitalExpressionsmallnon-codingRNAnon-codingRNA

longnon-codingRNAmRNA---轉(zhuǎn)錄組和 普通轉(zhuǎn)錄組文 鏈特異性文mRNA mRNA mRNA andandReverseSecondStrandcDNAEndAddA

ReversetranscriptionwithSecondStrandcDNASynthesiswithdTTP→dUTPEndAddAandPCR

DigestdUTPsecondStrand,PCRenri mRNA純mRNA的富真核生

原核生rRNA去真核mRNA的純鏈霉親合素包被磁珠+

mRNA的純化主要通過磁珠與物素吸附原理從而分離純化是mRNA的3′的polyA與磁珠在bindingbuffer的作用下相結(jié)合。除原核生物mRNA的純化---rRNA除原核mRNA的純LNA扣鎖型探原核生物rRNA去mRNA---轉(zhuǎn)錄組和 普通轉(zhuǎn)錄組文 鏈特異性文 mRNAmRNAmRNAandand andReverseSecondStrandcDNAEndAddA

ReversetranscriptionwithSecondStrandcDNASynthesiswithdTTP→dUTPEndAddAandPCR

DigestdUTPsecondStrand,PCRenri FirstfragmentandsecondRTorfirstRTandsecondfragment???（RNAfragmentandDNAfragment？）a

INNOVATIOeouonayooloranpomsZhongWag,arkGersteinandM打斷消除RNAismorebiasedtowardsthe3′endoftheprovidesmoreevencoveragealongthegenebodybutisrelativelydepletedforboththe5′and3′ends.RNAshatterimprovestheuniformityofIlluminareadcoverage

3AliMortazavi,BrianAWilliams,Kenneth3b|Aspecificyeastgene,SES1(seryl-tRNAsynthetase),is

LorianSchaffer&BarbaramRNA---轉(zhuǎn)錄組和 普通轉(zhuǎn)錄組文 鏈特異性文mRNA and

mRNAenri and

ReverseReversetranscriptionReverseReversetranscriptionwithSecondStrandcDNASecondStrandcDNAwithdTTP→EndAddAEndAddAand

DigestdUTPsecondStrand,PCRenri RNAlibrarypreparationYmRNA---轉(zhuǎn)錄組和 普通轉(zhuǎn)錄組文 鏈特異性文mRNA and

mRNAenri and

PCRPCRDigestdUTPsecondPCR SecondStrandcDNAEndAddA

ReversetranscriptionwithSecondStrandcDNASynthesiswithdTTP→dUTPEndAddAandnon-codingRNA---SmallRNA文庫構(gòu)建流諾禾建庫方

四步10μg-30μg10μg-30μgtotal切膠回收smallRNA5'端adaptor連接3'端adaptor切膠純化回收3‘端adaptornon-codingRNA---longnon-codingRNARemoveandReverseSecondStrandcDNAEnd PCR 文庫檢測---流程及標(biāo)Agilent2100—檢測insert SmallRNA文 片段進(jìn)行準(zhǔn)確定根據(jù)QPCR測定的有效濃度和目標(biāo)數(shù)據(jù)量pooling上RNA-seq實(shí)驗(yàn)流樣樣樣品檢文庫構(gòu)文庫庫上上FromWeihuaZeng&AliNature上HiSeq --- 段雜交和固Flow FlowCell

--- 段擴(kuò)增成簇（橋式 1st

1st

1st

2nd總

2nd

2nd基于 技基