四菌種保藏的原理和方法課件

第三節(jié)菌種保藏與復(fù)壯一、菌種保藏菌種保藏的重要意義：菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進(jìn)行有關(guān)生產(chǎn)，如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開(kāi)菌種。所以菌種保藏是進(jìn)行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務(wù)首先是使菌種不死亡，同時(shí)還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來(lái)而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。菌種是國(guó)家的重要資源，1980年我國(guó)成立了中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)。第三節(jié)菌種保藏與復(fù)壯一、菌種保藏1第四章菌種保藏的原理與方法第四章菌種保藏的原理與方法2一菌種保藏的原理：菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理、生化特性，人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)盡量降低，以減少其變異。保藏時(shí)，一般利用菌種的休眠體（孢子、芽孢等），創(chuàng)造最有利于休眠狀態(tài)的環(huán)境條件，如低溫、干燥、隔絕空氣或氧氣、缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，以降低菌種的代謝活動(dòng)，減少菌種變異，使菌種處于“休眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力，達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的。一個(gè)好的菌種保藏方法，應(yīng)能保持原菌種的優(yōu)良特性和較高的存活率，同時(shí)也應(yīng)考慮到方法本身的經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便。一菌種保藏的原理：3二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)：1.斜面低溫保藏法2．礦物油中浸沒(méi)保藏法3．固體曲保藏法4．砂土管保藏法5.普通冷凍保藏6．超低溫冷凍保藏法7.冷凍干燥法8.液氮冷凍保藏法9.

寄主保藏二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)：1.斜面低溫保藏法41.斜面低溫保藏本方法是利用低溫降低菌種的新陳代謝，使菌種的特性在短時(shí)期內(nèi)保持不變。將新鮮瓊脂培養(yǎng)基斜面上長(zhǎng)好的菌體或孢子，置于4℃冰箱中保存。一般的菌種均可用此方法保存1～3個(gè)月。保存期間要注意冰箱的溫度，不可波動(dòng)太大，不能在0℃以下保存，否則培養(yǎng)基會(huì)結(jié)冰脫水，造成菌種性能衰退或死亡。此法最為簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)，且不要求任何特殊的設(shè)備?？捎糜趯?shí)驗(yàn)室中若干菌種的保藏。1.斜面低溫保藏本方法是利用低溫降低菌種的新陳代謝，使菌種的5但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變因此要求在基本培養(yǎng)基上傳代為好，目的是能淘汰突變株；同時(shí)轉(zhuǎn)接菌量應(yīng)保持較低水平。斜面培養(yǎng)物應(yīng)在密閉容器中于5℃保藏，以防止培養(yǎng)基脫水并能降低代謝活性。此方法是一種短期、過(guò)渡的保藏方法此方法，一般不適宜作工業(yè)生產(chǎn)菌種的長(zhǎng)期保藏，一般保存時(shí)間為3~6個(gè)月。如放線(xiàn)菌于4~6℃保存，每3個(gè)月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6個(gè)月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6個(gè)月移接一次。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變6將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫或4℃冰箱保存，此方法簡(jiǎn)便有效。保存期約1年。可用于絲狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線(xiàn)菌的保藏。特別對(duì)難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。2.礦物油中浸沒(méi)保藏將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫或4℃冰箱保存，此方7浸沒(méi)保藏的操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，然后注入經(jīng)170℃下滅菌1-2h的礦物油(液體石蠟可采用蒸汽滅菌，滅菌后的石蠟在40℃烘箱中烘干備用)。礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜。以液體石蠟作為保藏方法時(shí)，應(yīng)對(duì)需保藏的菌株預(yù)先作試驗(yàn)。因?yàn)槟承┚暝谝后w石蠟下生長(zhǎng)還十分明顯，有些菌株如某些假絲酵母還會(huì)同化液體石蠟，也有的對(duì)液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏。為了預(yù)防不測(cè)，一般保藏株2～3年也應(yīng)做一次存活試驗(yàn)。浸沒(méi)保藏的操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，然83.固體曲保藏法這是根據(jù)我國(guó)傳統(tǒng)制曲原理加以改進(jìn)的一種方法，適用于產(chǎn)孢子的真菌。該法采用麩皮、大米、小米或麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為產(chǎn)孢子培養(yǎng)基，使菌種產(chǎn)生大量的休眠體（孢子）后加以保存。該法的要點(diǎn)是控制適當(dāng)?shù)乃帧?.固體曲保藏法這是根據(jù)我國(guó)傳統(tǒng)制曲原理加以改進(jìn)的一種方法94砂土管保藏法本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息。適用于產(chǎn)孢子的放線(xiàn)菌、霉菌以及產(chǎn)芽孢的細(xì)菌。砂土是砂和土的混合物，砂和土的比例一般為3：2或1：1，將黃砂和泥土分別洗凈，過(guò)篩，一般沙用80目過(guò)篩，土用80～100目過(guò)篩。按比例混合后，裝人小試管內(nèi)，裝料高度約為1cm左右，121℃間歇滅菌2～3次，滅菌后烘干，并作無(wú)菌檢查后備用。4砂土管保藏法本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息10將要保存的菌種斜面孢子刮下，直接與砂土混合；或用無(wú)菌水洗下孢子，制成懸浮液，再與砂土混合?；旌虾蟮纳巴凉芊旁谑⒂形逖趸谆驘o(wú)水氯化鈣的干燥器中，用真空泵抽氣干燥后，放在干燥低溫環(huán)境下保存。此法保存期可達(dá)1年以上。將要保存的菌種斜面孢子刮下，直接與砂土混合；或用無(wú)菌水洗下孢115.普通冷凍保藏由于該法的保藏溫度為－20℃，為了避免微生物受損傷致死，需要甘油作為保護(hù)劑。甘油的最終濃度為25%。具體操作如下：①配制濃度為50％的甘油溶液，121℃滅菌后備用；②制備菌懸液，一般菌懸液的濃度為108～1010個(gè)／mL；③將菌懸液和甘油溶液以等體積混合均勻后，置－20℃保藏。或者，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長(zhǎng)適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，同上置于冰箱中保存。5.普通冷凍保藏由于該法的保藏溫度為－20℃，為了避免微生物12用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。應(yīng)注意的是經(jīng)過(guò)一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來(lái)保藏。保藏過(guò)程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封。這一方法雖簡(jiǎn)便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長(zhǎng)期保藏。用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。136.超低溫冷凍保藏要求長(zhǎng)期保藏的微生物菌種，一般都要求在

-60～-80℃以下進(jìn)行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：1．離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期至后期的微生物細(xì)胞2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。

6.超低溫冷凍保藏要求長(zhǎng)期保藏的微生物菌種，一般都要求在14如果待保藏菌種生長(zhǎng)在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2℃／min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過(guò)此保藏方法保藏5年而活力不受影響。如果待保藏菌種生長(zhǎng)在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培157．冷凍干燥法其基本原理是在較低的溫度下（－18℃），快速地將細(xì)胞凍結(jié)，并且保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華。這樣菌種的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)處于極低水平，不易發(fā)生變異或死亡，因而能長(zhǎng)期保存，一般為5～10年。此法適用于各種微生物。具體的做法是先將微生物制成懸浮液，與保護(hù)劑（一般為蔗糖、脫脂牛奶或血清等）混合，放在安瓿管內(nèi)，用低溫酒精或干冰（－15℃以下）使之速凍，在低溫下用真空泵抽干，最后將安瓿管真空熔封，低溫保存?zhèn)溆?。?jīng)凍干后的菌株無(wú)需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸7．冷凍干燥法其基本原理是在較低的溫度下（－18℃），快速地16培養(yǎng)物的凍干過(guò)程抽真空最終菌株濃度一般要求在106CFU／mlCFU代表“colonyformingunits”。CFU/mL指的是每毫升樣品中含有的細(xì)菌群落總數(shù)。培養(yǎng)物的凍干過(guò)程抽真空最終菌株濃度一般要求在106CFU／17四菌種保藏的原理和方法課件18凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下保藏。較低的保藏溫度(-20～-70℃)對(duì)于培養(yǎng)物的長(zhǎng)期穩(wěn)定更好。2．復(fù)蘇：在安瓿中加入0.5～1ml營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復(fù)水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無(wú)菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有l(wèi)～2ml液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩5～l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基。凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下198.液氮冷凍保藏法液氮超低溫保藏法是近幾年才發(fā)展起來(lái)的，此法國(guó)外已較普遍采用，是適用范圍最廣的微生物保藏法。尤其是一些不產(chǎn)孢子的菌絲體，用其他保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最長(zhǎng)。我國(guó)國(guó)內(nèi)目前已有很多單位采用液氮法保存菌種。原理用液氮能長(zhǎng)期保存菌種。這是因?yàn)橐旱臏囟瓤蛇_(dá)－196℃，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其新陳代謝作用停止的溫度（－130℃），所以此時(shí)菌種的代謝活動(dòng)已基本停止，化學(xué)作用亦隨之消失。

8.液氮冷凍保藏法液氮超低溫保藏法是近幾年才發(fā)展起來(lái)的，此20

9.寄主保藏

適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的動(dòng)植物病原菌和病毒。

9.寄主保藏

適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的21菌種保藏的注意事項(xiàng)：1．菌種在保藏前所處的狀態(tài)一般以稍低于生長(zhǎng)最適溫度培養(yǎng)至孢子成熟的菌種進(jìn)行保存，效果較好。2．菌種保藏所用的基質(zhì)碳源、砂土、保護(hù)劑3．操作過(guò)程對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害凍結(jié)速度菌種保藏的注意事項(xiàng)：1．菌種在保藏前所處的狀態(tài)22基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子。質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷?xì)胞生長(zhǎng)非必需。一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時(shí)，生長(zhǎng)速度會(huì)加快當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí)，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長(zhǎng)選擇壓力。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)?；蚬こ叹谋２赜奢d體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不23建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中例如，質(zhì)粒pBR322。它除了能將外源DNA

輸入E．coli細(xì)胞外，還賦予E．coli細(xì)胞Ampr和Tetr。如果在培養(yǎng)基中加入Amp(氨芐青霉素)和Tet(四環(huán)素)，則培養(yǎng)時(shí)可選擇出含pBR322質(zhì)粒的細(xì)胞。

建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中24三.微生物活力和穩(wěn)定性測(cè)定

所有保藏菌種的方法都必須是長(zhǎng)期可靠地保持菌種的優(yōu)良性狀不變。在保藏時(shí)定期檢測(cè)菌種活力，以確定保藏培養(yǎng)物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及確定在實(shí)際保藏過(guò)程中出現(xiàn)的細(xì)胞死亡程度和遺傳穩(wěn)定性。對(duì)工業(yè)微生物生產(chǎn)菌種來(lái)說(shuō)，建議保藏菌種的形態(tài)學(xué)和生化特征(如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、酶活力、遺傳特征及生化指標(biāo))應(yīng)在保藏后加以檢測(cè)和確定。三.微生物活力和穩(wěn)定性測(cè)定所有保藏菌種的方法都必須是長(zhǎng)期25成功的菌種長(zhǎng)期保藏方法之有價(jià)值的指標(biāo)包括在保藏6個(gè)月、1年或更長(zhǎng)時(shí)間后存活百分率(或存活單位)。細(xì)胞群體的形態(tài)學(xué)特征或一些特別的生化特征應(yīng)在菌種保藏前后保持同一性，以及實(shí)驗(yàn)室中、中試車(chē)間中和生產(chǎn)發(fā)酵中產(chǎn)品滴度的穩(wěn)定性，后者極為重要。加速保藏試驗(yàn)可用于預(yù)測(cè)保藏過(guò)程中保藏培養(yǎng)物的穩(wěn)定性。在一給定溫度下通過(guò)對(duì)高溫下短期活力喪失程度檢測(cè)，可以用來(lái)預(yù)測(cè)嗜酸乳桿菌的穩(wěn)定性。成功的菌種長(zhǎng)期保藏方法之有價(jià)值的指標(biāo)包括在保藏6個(gè)月、1年或26四.菌種的復(fù)壯生產(chǎn)上使用的菌種，在使用和保藏過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)逐漸向不利于生產(chǎn)的方向發(fā)生變化，這種變化稱(chēng)之為菌種衰退

一般衰退菌種的復(fù)壯措施如下：純種分離淘汰衰退的個(gè)體選擇合適的培養(yǎng)條件四.菌種的復(fù)壯生產(chǎn)上使用的菌種，在使用和保藏過(guò)27五.國(guó)內(nèi)外主要菌種保藏機(jī)構(gòu)介紹（1）ATCCAmericanTypeCultureCollection。Rockvil1．Maryland.U.S.A.美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所，美國(guó)，馬里蘭州，羅克維爾市.（2）CSHColdSpringHarborLaboratory.U.S.A.冷泉港研究室，美國(guó).（3）IAMInstituteofAppliedMicrobiology.UniversityofTokyo，Japan.日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所，日本東京.（4）IFOInstituteforFermentation.Osaka，Japan.發(fā)酵研究所，日本大阪.（5）KCCKakenChemicalCompanyLtd．Tokyo，Japan.科研化學(xué)有限公司，日本東京.五.國(guó)內(nèi)外主要菌種保藏機(jī)構(gòu)介紹（1）ATCCAmeric28（6）NCTCNationalCollectionofTypeCulture.London，UnitedKingdom.國(guó)立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所，英國(guó)倫敦.（7）NIHNationalInstitutesofHealth.Bethesda，Maryland，U.S.A.國(guó)立衛(wèi)生研究所，美國(guó)，馬里蘭州，貝塞斯達(dá).（8）NRRLNorthernUtilizationResearchandDevelopmentDivision，U.S.DepartmentofArgiculture.Peoria，U.S.A.美國(guó)農(nóng)業(yè)部、北方開(kāi)發(fā)利用研究部，美國(guó)皮奧里亞市.（6）NCTCNationalCollectiono29第三節(jié)菌種保藏與復(fù)壯一、菌種保藏菌種保藏的重要意義：菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進(jìn)行有關(guān)生產(chǎn)，如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開(kāi)菌種。所以菌種保藏是進(jìn)行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務(wù)首先是使菌種不死亡，同時(shí)還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來(lái)而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。菌種是國(guó)家的重要資源，1980年我國(guó)成立了中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)。第三節(jié)菌種保藏與復(fù)壯一、菌種保藏30第四章菌種保藏的原理與方法第四章菌種保藏的原理與方法31一菌種保藏的原理：菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理、生化特性，人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)盡量降低，以減少其變異。保藏時(shí)，一般利用菌種的休眠體（孢子、芽孢等），創(chuàng)造最有利于休眠狀態(tài)的環(huán)境條件，如低溫、干燥、隔絕空氣或氧氣、缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，以降低菌種的代謝活動(dòng)，減少菌種變異，使菌種處于“休眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力，達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的。一個(gè)好的菌種保藏方法，應(yīng)能保持原菌種的優(yōu)良特性和較高的存活率，同時(shí)也應(yīng)考慮到方法本身的經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便。一菌種保藏的原理：32二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)：1.斜面低溫保藏法2．礦物油中浸沒(méi)保藏法3．固體曲保藏法4．砂土管保藏法5.普通冷凍保藏6．超低溫冷凍保藏法7.冷凍干燥法8.液氮冷凍保藏法9.

寄主保藏二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)：1.斜面低溫保藏法331.斜面低溫保藏本方法是利用低溫降低菌種的新陳代謝，使菌種的特性在短時(shí)期內(nèi)保持不變。將新鮮瓊脂培養(yǎng)基斜面上長(zhǎng)好的菌體或孢子，置于4℃冰箱中保存。一般的菌種均可用此方法保存1～3個(gè)月。保存期間要注意冰箱的溫度，不可波動(dòng)太大，不能在0℃以下保存，否則培養(yǎng)基會(huì)結(jié)冰脫水，造成菌種性能衰退或死亡。此法最為簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)，且不要求任何特殊的設(shè)備?？捎糜趯?shí)驗(yàn)室中若干菌種的保藏。1.斜面低溫保藏本方法是利用低溫降低菌種的新陳代謝，使菌種的34但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變因此要求在基本培養(yǎng)基上傳代為好，目的是能淘汰突變株；同時(shí)轉(zhuǎn)接菌量應(yīng)保持較低水平。斜面培養(yǎng)物應(yīng)在密閉容器中于5℃保藏，以防止培養(yǎng)基脫水并能降低代謝活性。此方法是一種短期、過(guò)渡的保藏方法此方法，一般不適宜作工業(yè)生產(chǎn)菌種的長(zhǎng)期保藏，一般保存時(shí)間為3~6個(gè)月。如放線(xiàn)菌于4~6℃保存，每3個(gè)月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6個(gè)月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6個(gè)月移接一次。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變35將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫或4℃冰箱保存，此方法簡(jiǎn)便有效。保存期約1年。可用于絲狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線(xiàn)菌的保藏。特別對(duì)難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。2.礦物油中浸沒(méi)保藏將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫或4℃冰箱保存，此方36浸沒(méi)保藏的操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，然后注入經(jīng)170℃下滅菌1-2h的礦物油(液體石蠟可采用蒸汽滅菌，滅菌后的石蠟在40℃烘箱中烘干備用)。礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜。以液體石蠟作為保藏方法時(shí)，應(yīng)對(duì)需保藏的菌株預(yù)先作試驗(yàn)。因?yàn)槟承┚暝谝后w石蠟下生長(zhǎng)還十分明顯，有些菌株如某些假絲酵母還會(huì)同化液體石蠟，也有的對(duì)液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏。為了預(yù)防不測(cè)，一般保藏株2～3年也應(yīng)做一次存活試驗(yàn)。浸沒(méi)保藏的操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，然373.固體曲保藏法這是根據(jù)我國(guó)傳統(tǒng)制曲原理加以改進(jìn)的一種方法，適用于產(chǎn)孢子的真菌。該法采用麩皮、大米、小米或麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為產(chǎn)孢子培養(yǎng)基，使菌種產(chǎn)生大量的休眠體（孢子）后加以保存。該法的要點(diǎn)是控制適當(dāng)?shù)乃帧?.固體曲保藏法這是根據(jù)我國(guó)傳統(tǒng)制曲原理加以改進(jìn)的一種方法384砂土管保藏法本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息。適用于產(chǎn)孢子的放線(xiàn)菌、霉菌以及產(chǎn)芽孢的細(xì)菌。砂土是砂和土的混合物，砂和土的比例一般為3：2或1：1，將黃砂和泥土分別洗凈，過(guò)篩，一般沙用80目過(guò)篩，土用80～100目過(guò)篩。按比例混合后，裝人小試管內(nèi)，裝料高度約為1cm左右，121℃間歇滅菌2～3次，滅菌后烘干，并作無(wú)菌檢查后備用。4砂土管保藏法本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息39將要保存的菌種斜面孢子刮下，直接與砂土混合；或用無(wú)菌水洗下孢子，制成懸浮液，再與砂土混合。混合后的砂土管放在盛有五氧化二磷或無(wú)水氯化鈣的干燥器中，用真空泵抽氣干燥后，放在干燥低溫環(huán)境下保存。此法保存期可達(dá)1年以上。將要保存的菌種斜面孢子刮下，直接與砂土混合；或用無(wú)菌水洗下孢405.普通冷凍保藏由于該法的保藏溫度為－20℃，為了避免微生物受損傷致死，需要甘油作為保護(hù)劑。甘油的最終濃度為25%。具體操作如下：①配制濃度為50％的甘油溶液，121℃滅菌后備用；②制備菌懸液，一般菌懸液的濃度為108～1010個(gè)／mL；③將菌懸液和甘油溶液以等體積混合均勻后，置－20℃保藏。或者，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長(zhǎng)適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，同上置于冰箱中保存。5.普通冷凍保藏由于該法的保藏溫度為－20℃，為了避免微生物41用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。應(yīng)注意的是經(jīng)過(guò)一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來(lái)保藏。保藏過(guò)程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封。這一方法雖簡(jiǎn)便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長(zhǎng)期保藏。用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。426.超低溫冷凍保藏要求長(zhǎng)期保藏的微生物菌種，一般都要求在

-60～-80℃以下進(jìn)行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：1．離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期至后期的微生物細(xì)胞2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。

6.超低溫冷凍保藏要求長(zhǎng)期保藏的微生物菌種，一般都要求在43如果待保藏菌種生長(zhǎng)在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2℃／min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過(guò)此保藏方法保藏5年而活力不受影響。如果待保藏菌種生長(zhǎng)在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培447．冷凍干燥法其基本原理是在較低的溫度下（－18℃），快速地將細(xì)胞凍結(jié)，并且保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華。這樣菌種的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)處于極低水平，不易發(fā)生變異或死亡，因而能長(zhǎng)期保存，一般為5～10年。此法適用于各種微生物。具體的做法是先將微生物制成懸浮液，與保護(hù)劑（一般為蔗糖、脫脂牛奶或血清等）混合，放在安瓿管內(nèi)，用低溫酒精或干冰（－15℃以下）使之速凍，在低溫下用真空泵抽干，最后將安瓿管真空熔封，低溫保存?zhèn)溆谩＝?jīng)凍干后的菌株無(wú)需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸7．冷凍干燥法其基本原理是在較低的溫度下（－18℃），快速地45培養(yǎng)物的凍干過(guò)程抽真空最終菌株濃度一般要求在106CFU／mlCFU代表“colonyformingunits”。CFU/mL指的是每毫升樣品中含有的細(xì)菌群落總數(shù)。培養(yǎng)物的凍干過(guò)程抽真空最終菌株濃度一般要求在106CFU／46四菌種保藏的原理和方法課件47凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下保藏。較低的保藏溫度(-20～-70℃)對(duì)于培養(yǎng)物的長(zhǎng)期穩(wěn)定更好。2．復(fù)蘇：在安瓿中加入0.5～1ml營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復(fù)水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無(wú)菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有l(wèi)～2ml液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩5～l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基。凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下488.液氮冷凍保藏法液氮超低溫保藏法是近幾年才發(fā)展起來(lái)的，此法國(guó)外已較普遍采用，是適用范圍最廣的微生物保藏法。尤其是一些不產(chǎn)孢子的菌絲體，用其他保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最長(zhǎng)。我國(guó)國(guó)內(nèi)目前已有很多單位采用液氮法保存菌種。原理用液氮能長(zhǎng)期保存菌種。這是因?yàn)橐旱臏囟瓤蛇_(dá)－196℃，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其新陳代謝作用停止的溫度（－130℃），所以此時(shí)菌種的代謝活動(dòng)已基本停止，化學(xué)作用亦隨之消失。

8.液氮冷凍保藏法液氮超低溫保藏法是近幾年才發(fā)展起來(lái)的，此49

9.寄主保藏

適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的動(dòng)植物病原菌和病毒。

9.寄主保藏

適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的50菌種保藏的注意事項(xiàng)：1．菌種在保藏前所處的狀態(tài)一般以稍低于生長(zhǎng)最適溫度培養(yǎng)至孢子成熟的菌種進(jìn)行保存，效果較好。2．菌種保藏所用的基質(zhì)碳源、砂土、保護(hù)劑3．操作過(guò)程對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害凍結(jié)速度菌種保藏的注意事項(xiàng)：1．菌種在保藏前所處的狀態(tài)51基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子。質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷?xì)胞生長(zhǎng)非必需。一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時(shí)，生長(zhǎng)速度會(huì)加快當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí)，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長(zhǎng)選擇壓力。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)?；蚬こ叹谋２赜奢d體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不52建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中例如，質(zhì)粒pBR322。它除了能將外源DNA

輸入E．coli細(xì)胞外，還賦予E．coli細(xì)胞Ampr和Tetr。如果在培養(yǎng)基中加入Amp(氨芐青霉素)和Tet(四環(huán)素)，則培養(yǎng)時(shí)可選擇出含pBR322質(zhì)粒的細(xì)胞。

建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中53三.微生物活力和穩(wěn)定性測(cè)定

所有保藏菌種的方法都必須是長(zhǎng)期可靠地保持菌種的優(yōu)良性狀不變。在保藏時(shí)定期檢測(cè)菌種活力，以確定保藏培養(yǎng)物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及確定在實(shí)際保藏過(guò)程中出現(xiàn)的細(xì)胞死亡程度和遺傳穩(wěn)定性。對(duì)工業(yè)微生物生產(chǎn)菌種來(lái)說(shuō)，建議保藏菌種的形態(tài)學(xué)和生化特征(如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、酶活力、遺傳特征及生化指標(biāo))應(yīng)在保藏后加以檢測(cè)和確定。三.微生物活力和穩(wěn)定性測(cè)定所有保藏菌種的方法都必須是長(zhǎng)期54成功的菌種長(zhǎng)期保藏方法之有價(jià)值的指標(biāo)包括在保藏6個(gè)月、1年或更長(zhǎng)時(shí)間后存活百分率(或存活單位)。細(xì)胞