發(fā)酵工程在功能性食品中的應用

發(fā)酵工程在功能性食品中的應用江學文1功能性食品功能性食品是指強調(diào)其成分對人體能充分顯示機體防御功能的工業(yè)化食品，是新時代對傳統(tǒng)食品的深層次要求。開發(fā)功能性食品的最終目的，就是要最大限度地滿足人類自身的健康需要。開發(fā)功能性食品，要對其“安全性”和“功能性”進行科學評價，這就需要明確其中起關鍵作用的、真正具有生理作用的功效成分，或稱活性成分，功能因子。1.1功效成分顯然，功效成分是生產(chǎn)功能性食品的關鍵。就目前而言，業(yè)已確認的功效成分，主要包括以下8類：⑴功能性碳水化合物：如真菌多糖、功能性低聚糖、功能性單雙糖。⑵功能性脂類：如ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸、磷脂等。⑶氨基酸、肽與蛋白質(zhì)：如?；撬?、酪蛋白磷肽、降壓肽、免疫球蛋白、酶蛋白等。⑷維生素和維生素類似物：包括水溶性維生素、油溶性維生素、生物類黃酮等。⑸礦物元素：包括常量、微量元素等。⑹植物活性成分：如皂苷、生物堿、萜類化合物、有機硫化物等。⑺益生菌：主要是乳酸菌類，尤其是雙歧桿菌。⑻低能量食品成分：包括蔗糖替代品、脂肪替代品等。功能性食品的出現(xiàn)，標志著作為食品中的關鍵組分，開始從重點要求大量的傳統(tǒng)營養(yǎng)素，轉(zhuǎn)向重點要求微量的功效成分。1.2高新技術由于功效成分普遍具有“微量”、“高效”和“不穩(wěn)定”的特點，應用傳統(tǒng)的工程技術，已不能適應微量成分的制造，不能開發(fā)出高科技的功能性食品。現(xiàn)代食品工程高新技術的出現(xiàn)，將有力地促進這個問題的圓滿解決。高新技術在功能性食品生產(chǎn)中所占的比重不斷增大，特別是生物技術的應用得以長足的發(fā)展，尤其是用在功能性食品配料（即功效成分）的生產(chǎn)上，有力地推動了食品工業(yè)革命性的變化。就目前而言，生物技術已在功能性食品生產(chǎn)上得到有效應用，上述的8類功效成分中，除植物活性成分一般采用提取分離法外，其余的均可用生物技術來高效生產(chǎn)。生物技術，是應用自然科學及工程學原理，依靠微生物動物植物細胞及其產(chǎn)生的活性物質(zhì)，作為某種化學反應的執(zhí)行者，將原料進行加工成某種產(chǎn)品來為社會服務的技術。生物技術包括基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程，其中基因工程、細胞工程和酶工程在功能性食品產(chǎn)業(yè)的應用已有相關專著和文獻報導，可做參考。以下主要就發(fā)酵工程在功能性食品的某些應用作一概述，并簡略回顧一下發(fā)酵技術的發(fā)展歷史。2.發(fā)酵工程與功能性食品產(chǎn)業(yè)2.1發(fā)酵技術的沿革2.1.1傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵技術－天然發(fā)酵主要產(chǎn)品有酒、醋、醬油、泡菜、干酪等，特點是發(fā)酵過程很難人為控制，生產(chǎn)只能憑經(jīng)驗，口傳心授。2.2.2第一代微生物發(fā)酵技術－純培養(yǎng)技術的建立德國人柯赫首先建立了微生物的純培養(yǎng)技術，開創(chuàng)了人為控制發(fā)酵過程的時期，加上簡單密封式發(fā)酵罐的發(fā)明，發(fā)酵管理技術的改進，發(fā)酵工業(yè)進入了近代化學工業(yè)的行列。這時期產(chǎn)品有酒精、丙酮、丁醇、有機酸、酶制劑等，主要是一些厭氧發(fā)酵和表面固體發(fā)酵產(chǎn)生的初級代謝產(chǎn)物。2.2.3第二代（近代）微生物發(fā)酵技術－深層培養(yǎng)技術可分為兩個時期，前一時期抗生素工業(yè)的發(fā)展，以青霉素的生產(chǎn)為代表，形成規(guī)?；a(chǎn)，同時采用了深層培養(yǎng)技術，即機械攪拌通氣技術，從而推動了抗生素工業(yè)乃至整個發(fā)酵工業(yè)的快速發(fā)展。這時期的產(chǎn)品主要是好氧發(fā)酵的次級代謝產(chǎn)物。后一一時時期期是是20世世紀紀50年年代代氨氨基基酸酸發(fā)發(fā)酵酵工工業(yè)業(yè)，，在在引引進進了了““代代謝謝控控制制發(fā)發(fā)酵酵技技術術””后后，，得得以以快快速速發(fā)發(fā)展展，，即即將將微微生生物物通通過過人人工工誘誘變變，，獲獲得得代代謝謝發(fā)發(fā)生生改改變變的的突突變變株株，，在在控控制制條條件件下下，，選選擇擇性性地地大大量量生生產(chǎn)產(chǎn)某某種種人人們們所所需需要要的的產(chǎn)產(chǎn)品品。。這這項項技技術術也也被被用用于于核核苷苷酸酸、、有有機機酸酸和和抗抗生生素素的的生生產(chǎn)產(chǎn)中中。。這這個個時時期期是是近近代代發(fā)發(fā)酵酵工工業(yè)業(yè)的的鼎鼎盛盛時時代代。。新新產(chǎn)產(chǎn)品品、、新新技技術術、、新新工工藝藝、、新新設設備備不不斷斷出出現(xiàn)現(xiàn)，，應應用用范范圍圍也也日日益益擴擴大大，，如如能能源源開開發(fā)發(fā)、、環(huán)環(huán)境境保保護護等等。。2..2.4第第三代代微生生物發(fā)發(fā)酵技技術－－發(fā)酵酵工程程又稱微微生物物工程程，以以基因因工程程、細細胞工工程、、蛋白白質(zhì)工工程等等現(xiàn)代代生物物技術術為支支撐，，利用用微生生物的的生長長和代代謝活活動，，通過過現(xiàn)代代化工工程技技術手手段進進行工工業(yè)規(guī)規(guī)模生生產(chǎn)的的技術術，是是微生生物（（菌種種）、、發(fā)酵酵工藝藝和發(fā)發(fā)酵設設備的的協(xié)調(diào)調(diào)，根根據(jù)發(fā)發(fā)酵目目的對對微生生物的的采集集、分分離和和選育育提出出要求求，對對發(fā)酵酵工藝藝進行行設計計和優(yōu)優(yōu)化，，對發(fā)發(fā)酵設設備提提出改改進和和配套套選型型的工工程技技術。。它的主主要內(nèi)內(nèi)容包包括：：工業(yè)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)菌種種的選選育，，最佳佳發(fā)酵酵條件件的選選擇和和控制制，生生化反反應器器的設設計以以及產(chǎn)產(chǎn)品的的分離離提取取和精精制等等過程程。在功能能性食食品領領域，，發(fā)酵酵工程程在生生產(chǎn)多多元糖糖醇、、大型型真菌菌菌絲絲體、、微藻藻、維維生素素和維維生素素類似似物、、多不不飽和和脂肪肪酸、、功能能性乳乳制品品等方方面都都已到到實際際應用用，并并已產(chǎn)產(chǎn)生明明顯的的經(jīng)濟濟效益益和深深遠的的社會會效益益。2.2木糖糖醇的的發(fā)酵酵法生生產(chǎn)木糖醇醇為多多元糖糖醇，，溶于于水會會吸熱熱，其其吸熱熱值在在糖醇醇類甜甜味劑劑中最最大，，因此此食用用時會會產(chǎn)生生涼爽爽的口口感，，在體體內(nèi)代代謝不不需要要胰島島素參參與，，能防防齲齒齒，也也可作作為非非腸道道營養(yǎng)養(yǎng)的能能量來來源。。木糖醇醇的生生產(chǎn)方方法有有三種種：提提取、、化學學合成成、生生物合合成。。目前前，工工業(yè)生生產(chǎn)主主要采采用化化學合合成法法：半半纖維維素加加酸催催化水水解，，得到到含木木糖的的水解解液，，經(jīng)純純化脫脫色，，在一一定條條件下下通過過戊糖糖加氫氫反應應生產(chǎn)產(chǎn)木糖糖醇，，轉(zhuǎn)化化率50～～60％。。生物物合成成法是是利用用微生生物中中的還還原酶酶，以以木糖糖為底底物來生產(chǎn)產(chǎn)木糖糖醇，，可有有效降降低木木糖醇醇的生生產(chǎn)成成本：：不僅僅省去去木糖糖純化化步驟驟，而而且簡簡化木木糖醇醇的分分離步步驟，，是一一種很很有前前途的的生產(chǎn)產(chǎn)方法法。2.2.1原料料：主要要使用植植物半纖纖維素的的水解產(chǎn)產(chǎn)物，半半纖維素素的主要要成分是是木聚糖糖，在無無機酸作作用下水水解成木木糖，可可作為基基質(zhì)。2.2.2菌種：以以木糖為基基質(zhì)生產(chǎn)木木糖醇，主主要考慮2種酶：一一是木糖還還原酶（以以NADPH或NADH為輔輔酶），一一是木糖醇醇脫氫酶（（以NAD+或NADP+為為輔酶）。。選擇木糖糖醇生產(chǎn)菌菌種的原則則：高木糖糖還原酶活活性或低木木糖醇脫氫氫酶活性。。根據(jù)該原原則，選擇擇了膜醭假假絲酵母，，木糖代謝謝途徑：木糖NADPHNADP+木糖醇NAD+NADH木酮糖5－磷磷酸木酮糖糖單磷酸己糖糖途徑2.2.3影響因素素2.2.3.1通氣氣率通通氣培養(yǎng)能能提高木糖糖向木糖醇醇的轉(zhuǎn)化量量，因為木木糖醇的生生產(chǎn)直接同同生物量的的增加相聯(lián)聯(lián)系。并且且受氧氣消消耗量的影影響極大。。要有效生生產(chǎn)木糖醇醇，首先考考慮的是微微生物細胞胞在培養(yǎng)基基中快速積積累，這可可通過在介介質(zhì)中溶解解氧來解決決，但木糖糖醇的生產(chǎn)產(chǎn)需要缺氧氧條件，在在整個培養(yǎng)養(yǎng)過程中介介質(zhì)維持高高水平的溶溶解氧會導導致木糖醇氧化化成木酮糖糖。因此，，應在培養(yǎng)養(yǎng)早期維持持高水平的的溶解氧，，然后在產(chǎn)產(chǎn)木糖醇的的時期降低低微生物的的呼吸率。。2.2.3.2木糖糖含量培培養(yǎng)基中中的木糖含含量會顯著著影響木糖糖醇的產(chǎn)量量。一般來來講，在批批量處理中中，如果微微生物能夠夠耐受高含含量的糖分分和高滲透透壓，初始始糖含量的的增加能提提高生產(chǎn)速速率和轉(zhuǎn)化化率。根據(jù)試驗初初始木糖含含量在80g～120g／L比較合適適。2.2.3.3氮源源氮氮源和通氣氣率都是非非常重要，，通過比較較8種無機機氮源和4種有機氮氮源，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)銨鹽是最最好的無機機氮源，酵酵母提取物物是最好的的有機氮源源。使用這這兩種氮源源時，木糖糖醇轉(zhuǎn)化率率分別為16.7g／L和30.6g／L。。2.2.3.4培養(yǎng)養(yǎng)基中的其其它糖類往往基質(zhì)質(zhì)中加入葡葡萄糖，會會對酵母發(fā)發(fā)酵木糖生生成木糖醇醇產(chǎn)生反作作用，葡萄萄糖對木糖糖消耗的禁禁阻效應，，只需很短短時間就就就能達到最最大值，一一旦葡萄糖糖含量降低低到一定值值時，對木木糖的轉(zhuǎn)化化很快又重重新開始。。這說明其調(diào)調(diào)節(jié)機制并并不是代謝謝產(chǎn)物阻遏遏（阻遏酶酶合成），，而是反饋饋抑制（抑抑制酶活性性）。當葡葡萄糖含量量低于5g／L時，，木糖醇的的產(chǎn)量不會會降低，因因為此時葡葡萄糖進行行的是有氧氧代謝，不不會產(chǎn)生乙乙醇。而當當葡萄糖含含量超過5g／L時時，多于部部分會通過過無氧代謝謝生成乙醇醇，此反應應和木糖還還原生成木木糖醇同為為還原反應應，相互之之間競爭氧氧化還原勢勢，導致木木糖醇產(chǎn)量量降低。2.2.3.5pH和溫溫度假絲酵母菌菌株最適pH4～6，最適溫溫度范圍28～30℃。2.2大型型真菌的發(fā)發(fā)酵法生產(chǎn)產(chǎn)許多大型真真菌含有多多種活性物物質(zhì)，如多多糖、多肽肽、生物堿堿、萜類化化合物、甾甾醇、苷類類、酚類、、酶、維生生素、植物物激素等。。具有提高高免疫力、、抗腫瘤、、抗炎和抗抗?jié)兊裙π?。大型真菌的的深層發(fā)酵酵是在抗菌菌素發(fā)酵技技術的基礎礎上發(fā)展起起來的，與與傳統(tǒng)栽培培真菌子實實體的方法法不同。它它是在大型型發(fā)酵罐內(nèi)內(nèi)進行，通通過調(diào)整培培養(yǎng)基組成成和發(fā)酵工工藝，在短短時間內(nèi)得得到大量的的真菌菌絲絲體。分析析表明，這這樣得到的的真菌菌絲絲體與傳統(tǒng)統(tǒng)栽培真菌菌子實體，，在化學組組成和生理功能上均均很相似。。用發(fā)酵菌菌絲體中的的真菌多糖糖、真菌蛋蛋白及其他他活性物質(zhì)質(zhì)，來調(diào)制制生產(chǎn)功能能性食品，，這類食品品具有增強強機體免疫疫力和明顯顯的抗腫瘤瘤活性，很很有發(fā)展前前途。這種種方法的最最大優(yōu)點是是，易于實實現(xiàn)工業(yè)化化生產(chǎn)，規(guī)規(guī)模大、產(chǎn)產(chǎn)量高、周周期短、效效益高。缺缺點是，一一次性投資資大，部分分菌絲體缺缺乏子實體體特有的風風味。經(jīng)研究認為為適合于深深層發(fā)酵的的食用或藥藥用大型真真菌多達80余種，，但真正實實現(xiàn)工業(yè)化化生產(chǎn)的尚尚不太多。。發(fā)酵法生生產(chǎn)真菌的的主要工藝藝是：母種種搖搖瓶培養(yǎng)種種子罐發(fā)發(fā)酵罐深層層發(fā)酵。2..2.1靈芝的的發(fā)酵法生生產(chǎn)2.2.1.1工工藝斜面母種（（26～28℃，5d）一一級搖搖瓶培養(yǎng)（（500ml，24～26℃℃，200r／min，2～～3d）二二級搖瓶瓶培養(yǎng)（500ml,26～28℃℃,90r／min,2d)種子罐培養(yǎng)養(yǎng)（40L，26～～28℃,，200r／min,1:0.3～～0.5VVm,接接種量5%,4d））發(fā)發(fā)酵酵罐培養(yǎng)（（200L，26～～28℃，，200r/min，1:0.5VVm，6～～7d）放放罐2.2.1.2培培養(yǎng)基組組成（略））2.2.1.3培培養(yǎng)條件件⑴溫度靈靈芝深層層培養(yǎng)適宜宜溫度為27～30℃，低于于27℃菌菌絲生長緩緩慢，高于于30℃菌菌絲易老化化，36～～38℃菌菌絲停止生生長。溫度度能影響多多糖的產(chǎn)量量。在發(fā)酵酵過程中，，前期0～～30h以以稍高的溫溫度促進菌絲迅迅速生長，，在30～～150h以稍低的的溫度盡可可能延長有有效物質(zhì)的的生成期，，150h后，溫度度稍提高，，以促進有有效物質(zhì)的的分泌。⑵通氣通通氣的目目的是保證證最好的溶溶氧性，以以提供靈芝芝菌絲體生生長所需的的氧，此外外還可除去去二氧化碳碳和代謝產(chǎn)產(chǎn)物。深層層培養(yǎng)供氧氧狀況對菌菌體的生長長和有效物物質(zhì)的積累累意義重大大，特別是是發(fā)酵初期期12～16h，由由于菌絲量量顯著增加加，菌絲耗耗氧率達到到高峰，對對溶解氧極極為敏感，，需特別注注意供氧狀狀況，否則則引起異常常發(fā)酵，出出現(xiàn)菌絲自溶或原原生質(zhì)凝集集，導致明明顯的代謝謝變化、產(chǎn)產(chǎn)量下降甚甚至發(fā)酵失失敗。⑶攪拌由由于氧難難溶于水，，為加大其其溶解度，，必須進行行攪拌，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速100～200r/min，過快快會把菌絲絲打得很碎碎，對菌體體生長不利利。還應根根據(jù)培養(yǎng)基基得性質(zhì)，，決定攪拌拌器形式，，攪拌流型型等問題，，靈芝菌絲絲體深層培培養(yǎng)基粘度度大液面高高，常采用用兩檔或三三檔攪拌器器，大型發(fā)發(fā)酵罐多至至四檔。目目前國內(nèi)外外已發(fā)展瘦瘦長型無機機械攪拌發(fā)發(fā)酵罐（H:D=12～16）,罐身身高，空氣氣量大，氧氧利用率高高。由于無無機械攪拌拌，罐體易易保持嚴密密，染菌率率低，一般般在0.2%以下。。⑷消泡靈靈芝深層層培養(yǎng)基中中含有蛋白白質(zhì)類物質(zhì)質(zhì)，在通氣氣和攪拌下下易形成泡泡沫，導致致培養(yǎng)液上上升，造成成大量的逃逃液，增加加染菌機會會。同時由由于泡沫過過多，還會會影響通氣氣和攪拌的的正常進行行。泡沫產(chǎn)產(chǎn)生的主要要原因有兩兩點：一是是通氣攪拌拌程度；二二是培養(yǎng)基基的原料性性質(zhì)。消除除泡沫的方方法有機械械消泡和消消泡劑消泡泡兩種，一一般采用后后一種。靈靈芝深層培培養(yǎng)的消泡泡劑為植物物油，用量量0.03%。⑸pH靈靈芝深層層培養(yǎng)要求求一定的pH范圍，，最適生長長的pH5.0～6.0，發(fā)發(fā)酵初期pH4.0～5.4，到了發(fā)發(fā)酵中期菌菌絲體生長長旺盛，菌菌體干物質(zhì)質(zhì)和有效成成分積累，，pH急劇劇下降到2.5～3.5之間間，進入發(fā)發(fā)酵后期菌菌絲生長緩緩慢，出現(xiàn)現(xiàn)菌體自溶溶，pH回回升。發(fā)酵酵過程中pH的變化化也與培養(yǎng)養(yǎng)基組成有有密切的關關系，如采采用玉米粉粉－蔗糖－－酵母粉培培養(yǎng)基，到到發(fā)酵中后后期pH會會急劇下降降，而采用用花生餅粉粉－蔗糖培培養(yǎng)基pH變化不大大。在發(fā)酵酵中遇到急急劇下降或或上升，一一般加入酸酸或堿調(diào)節(jié)節(jié)，加入磷磷酸鹽作緩緩沖。⑹菌齡與接接種量靈芝深層培培養(yǎng)菌種的的菌齡一般般為48h左右,接接種量5％％～10％％，接種量量少了會延延長發(fā)酵周周期，接種種量太多菌菌絲老化快快，降低有有效物質(zhì)的的積累，也也給后處理理帶來困難難。2.3維生生素C的發(fā)發(fā)酵法生產(chǎn)產(chǎn)維生素C，，又名L－－抗壞血酸酸，為人體體所必需的的維生素，，并作為許許多具有重重要生理功功能的金屬屬酶的輔助助因子，參參與膠原蛋蛋白的羥基基化、肉堿堿生物合成成、多巴胺胺羥基化等等多種代謝謝活動。同同時維生素素C還是一一種重要的的自由基清清除劑，可可清除超氧氧陰離子（（O2–·）、羥自自由基（OH·）和和烷過氧基基（ROO·）等，，這些自由由基被認為為與癌癥、、心血管疾疾病等密切切相關。維維生素C廣廣泛用于食食品、功能能性食品、、藥品和化化妝品中，，目前世界界總產(chǎn)量每每年近80000t，總值超超過6億美美元，市場場前景廣闊闊。2.3.1萊氏法工工藝一直為生產(chǎn)產(chǎn)維生素C的普遍方方法，其基基本原理是是：D－葡萄糖糖H2/NiD－山梨醇醇弱氧化醋酸酸桿菌L－山梨糖糖丙酮/H2SO4雙丙酮－L－山梨糖糖高錳酸鉀雙丙酮－L－古洛酸酸水解2－酮基－－L－古洛洛酸內(nèi)酯化、烯烯醇化L－抗壞血血酸2.3.2兩次發(fā)酵酵工藝由于萊氏工工藝路線繁繁雜冗長，，輔助原料料消耗量大大，自20世紀60年代開始始研究重點點集中于微微生物發(fā)酵酵，希望能能將D－山山梨醇或L－山梨糖糖直接轉(zhuǎn)化化為2－酮酮基－L－－古洛酸。。我國從1969年年開始在微微生物發(fā)酵酵－化學合合成法的基基礎上進行行維生素C的兩次發(fā)發(fā)酵工藝的的研究，在在1974年取得很很大成功，，篩選得到到以氧化葡葡萄糖酸桿桿菌為主要要產(chǎn)酸菌，，以條紋假假單胞菌為為伴生菌的的自然共生生菌絲，兩兩者共生發(fā)發(fā)酵時，能能L－山梨梨糖直接轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化為2－－酮基－L－古洛酸酸，省去了萊氏氏法中的丙丙酮保護步步驟，避免免了丙酮、、酸、堿或或苯等有機機溶劑的大大量使用，，其工藝簡簡單，可節(jié)節(jié)省大量化化工原料，，安全衛(wèi)生生，三廢和和污染較小小，已為國國內(nèi)大部分分廠家采用用。2.3.3生產(chǎn)菌種種將D－－山山梨梨醇醇轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化為為L－－山山梨梨糖糖的的微微生生物物除除弱弱氧氧化化醋醋酸酸桿桿菌菌，，還還可可用用生生黑黑醋醋酸酸桿桿菌菌。。將將L－－山山梨梨糖糖轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化為為2－－酮酮基基－－L－－古古洛洛酸酸所所用用的的主主要要產(chǎn)產(chǎn)酸酸菌菌是是氧氧化化葡葡萄萄糖糖酸酸桿桿菌菌，，除除與與條條紋紋假假單單胞胞菌菌共共生生發(fā)發(fā)酵酵外外，，還還可可與與熒熒光光假假單單胞胞菌菌、、雙雙黃黃假假單單胞胞桿桿菌菌和和綠綠葉葉假假單單胞胞菌菌等等共共生生發(fā)發(fā)酵酵。。2.3.4發(fā)發(fā)酵酵工工藝藝生產(chǎn)產(chǎn)時時可可直直接接用用葡葡萄萄糖糖或或淀淀粉粉水水解解液液為為原原料料，，經(jīng)經(jīng)還還原原葡葡萄萄糖糖成成山山梨梨醇醇。。反反應應結結束束后后，，過過濾濾除除去去催催化化劑劑，，離離子子交交換換除除去去離離子子雜雜質(zhì)質(zhì)，，活活性性炭炭脫脫色色，，濃濃縮縮得得到到符符合合要要求求的的山山梨梨醇醇溶溶液液、、將將山山梨梨醇醇溶溶液液泵泵入入內(nèi)內(nèi)循循環(huán)環(huán)氣氣升升式式發(fā)發(fā)酵酵罐罐中中。。加加水水調(diào)調(diào)節(jié)節(jié)山山梨梨醇醇含含量量至至10％％～～35％％，，通通常常在在發(fā)發(fā)酵酵初初期期濃濃度度較較低低，，待待菌菌體體繁繁殖殖至至對對數(shù)數(shù)期期再再提提高高含含量量。。接接種種弱弱氧氧化化醋醋酸酸桿桿菌菌進進行行發(fā)發(fā)酵酵，，調(diào)調(diào)pH6.2～～6.8，，溫溫度度28～～30℃℃，，罐罐內(nèi)內(nèi)壓壓力力0.02～～0.1MPa，，通通氣氣量量0.6～～1vvm，，罐罐內(nèi)內(nèi)裝裝填填率率70％％～～80％％。。經(jīng)14～～30h發(fā)發(fā)酵酵結結束束，，山山梨梨醇醇得得率率可可達達96.5%，，培培養(yǎng)養(yǎng)基基組組成成（（略略））。。第第一一次次發(fā)發(fā)酵酵結結束束后后，，將將發(fā)發(fā)酵酵醪醪升升溫溫至至80℃℃保保持持10min滅滅菌菌，，補補充充所所需需原原輔輔料料，，調(diào)調(diào)pH6.7～～7.0，，接接種種氧氧化化葡葡萄萄糖糖酸酸桿桿菌菌和和條條紋紋假假單單胞胞菌菌，，在在30℃℃溫溫度度下下進進行行共共生生發(fā)發(fā)酵酵。。為為保保證證產(chǎn)產(chǎn)酸酸的的正正常常進進行行應應定定期期補補充充堿堿維維持持pH7.0。。經(jīng)經(jīng)20～～36h，，將將山山梨梨糖糖耗耗盡盡，，發(fā)發(fā)酵酵達達到到終終點點。。發(fā)酵結結束后后，過過濾或或離心心除去去菌體體蛋白白，發(fā)發(fā)酵液液經(jīng)靜靜置、、澄清清、離離子交交換、、濃縮縮、干干燥后后可得得2－－酮基基－L－古古洛糖糖酸晶晶體，，再經(jīng)經(jīng)后續(xù)續(xù)的化化學合合成階階段得得到終終產(chǎn)品品維生生素C，總總得率率為44.5%～46.7%。共共生發(fā)發(fā)酵種種子和和發(fā)酵酵罐培培養(yǎng)基基（略略）2..3.5發(fā)發(fā)酵法法生產(chǎn)產(chǎn)維生生素C的研研究進進展⑴2－酮酮基－－L－－古洛洛糖酸酸轉(zhuǎn)化化率的的提高高L－山山梨糖糖生物物氧化化成2－酮酮基－－L－－古洛洛糖酸酸是由由細胞胞膜界界面或或細胞胞內(nèi)的的山梨梨糖酮酮脫氫氫酶所所催化化，生生成L－山山梨糖糖酮中中間體體，進進入細細胞質(zhì)質(zhì)，然然后經(jīng)經(jīng)胞內(nèi)內(nèi)脫氫氫酶進進一步步作用用，在在細胞胞質(zhì)山山梨糖糖酮還還原酶酶和山山梨糖糖還原原酶作作用下下生成成木酮酮糖，，進入入磷酸酸戊糖糖途徑徑，生生成6－磷磷酸葡葡萄糖糖，進進入糖糖醛酸酸途徑徑，生生成尿尿苷二二磷酸酸葡萄萄糖醛醛酸（（UDP葡葡萄糖糖醛酸酸），，再經(jīng)經(jīng)糖醛醛酸還還原酶酶催化化，以NADPH為為氫供供體還還原成成L－－古洛洛糖酸酸，然然后由由內(nèi)酯酯酶催催化脫脫水形形成L－古古洛糖糖酸內(nèi)內(nèi)酯，，最后后由L－古古洛糖糖酸內(nèi)內(nèi)酯氧氧化酶酶氧化化成抗抗壞血血酸。。靈長長目動動物和和人因因為缺缺乏L－古古洛糖糖酸內(nèi)內(nèi)酯氧氧化酶酶，故故不能能合成成抗壞壞血酸酸，而而大多多數(shù)動動植物物都具具有這這一途途徑。。在這這一途途徑中中，UDP-葡萄萄糖醛醛酸在在差向向異構構酶催催化下下，C5上上的基基團差差向異異構，，生成成UDP-艾杜杜糖醛醛酸。。國外有有研究究將李李氏醋醋桿菌菌細胞胞膜界界面上上的山山梨糖糖酮脫脫氫酶酶基因因，在在含細細胞質(zhì)質(zhì)山梨梨糖酮酮脫氫氫酶的的氧化化葡萄萄糖酸酸桿菌菌中表表達，，使L－山山梨糖糖氧化化為2－酮酮基－－L－－古洛洛糖酸酸的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化率率提高高35％。。在發(fā)酵酵過程程中，，由于于UDP-艾杜杜糖醛醛酸的的生成成，導導致2－酮酮基－－L－－古洛洛糖酸酸的產(chǎn)產(chǎn)量下下降。。通過過化學學誘變變，可可使UDP-艾艾杜糖糖醛酸酸的合合成數(shù)數(shù)量大大幅度度減少少，從從而提提高2－酮酮基－－L－－古洛洛糖酸酸的得得率。。另外外，也也有人人提出出通過過2,5–二酮基基–D–葡萄糖糖酸途途徑，，來合合成2－酮酮基－－L－－古洛洛糖酸酸。先由歐歐文氏氏菌突突變株株將D－葡葡萄糖糖轉(zhuǎn)化化為2,5–二酮基基–D–葡萄糖糖酸，，然后后將整整個培培養(yǎng)基基經(jīng)十十二烷烷基硫硫酸鈉鈉處理理以降降低細細胞活活力，，再加加入葡葡萄糖糖，最最后經(jīng)經(jīng)棒狀狀桿菌菌變異異菌株株作用用生成成2－－酮基基－L－古古洛糖糖酸。。在整整個生生產(chǎn)過過程中中，葡葡萄糖糖轉(zhuǎn)化化率最最高可可達85％％，2－－酮基基－L－古古洛糖糖酸的的最終終含量量為10.5g/L。⑵由2－酮酮基－－L－－古洛洛糖酸酸生物物轉(zhuǎn)化化為L－抗抗壞血血酸傳統(tǒng)工工藝中中，2－－酮基基－L－古古洛糖糖酸可可通過過兩條條化學學途徑徑轉(zhuǎn)化化為L－抗抗壞血血酸：：一是是2－－酮基基－L－古古洛糖糖酸在在強酸酸下酯酯化成成甲基基－2－酮酮基－－L－－古洛洛糖酸酸，然然后與與堿反反應生生成抗抗壞血血酸金金屬鹽鹽，最最后酸酸化為為抗壞壞血酸酸。此此法反反應步步驟較較多，，且需需要使使用較較多的的氣態(tài)態(tài)HCL。。二