pp基因工程的基本操作程序課件

第2節(jié)基因工程的操作程序第2節(jié)目的基因的檢測與及表達產(chǎn)物的測定基因工程的四大步驟：目的基因的獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與及表達產(chǎn)物的測定基因工程的四大步驟：目的基因閱讀P72并思考1、什么是目的基因？2、獲取目的基因的方法有哪些？閱讀P72并思考1、什么是目的基因？從基因文庫中獲取目的基因基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）從基因文庫中獲取目的基因基因文庫基因組文庫部分基因文庫基因文庫的構建過程基因組文庫限制酶供體細胞的全部DNA大量DNA片段拼接到載體上導入受體細胞擴增基因文庫的構建過程基因組文庫限制酶供體細胞的大量DNA拼接到利用PCR技術擴增目的基因PCR的全稱：聚合酶鏈式反應PCR的原理：體外的DNA復制

利用PCR技術擴增目的基因PCR的全稱：模板原料引物酶控制溫度利用PCR技術擴增目的基因——目的基因DNA——四種脫氧核苷酸——某單鏈DNA分子片段——耐熱的DNA聚合酶——PCR儀自動調控PCR的條件：模板利用PCR技術擴增目的基因——目的基因DNA——四種脫氧PCR的過程：利用PCR技術擴增目的基因變性(90-95℃)復性(55-60℃)延伸(70-75℃)PCR的過程：利用PCR技術擴增目的基因變性(90-95℃)cDNA基因文庫的構建過程mRNA單鏈DNA

雙鏈DNA逆轉錄cDNA文庫（部分基因組文庫）cDNA基因文庫的構建過程mRNA單鏈DNA雙鏈DNA逆轉依據(jù)目的基因的有關信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因在染色體上的位置基因的轉錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質等特性。從基因文庫中分離獲取目的基因依據(jù)目的基因的有關信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列從基因文庫中用化學方法直接人工合成條件：基因較小，核苷酸序列已知。用化學方法直接人工合成條件：基因較小，核苷酸序列已知。二、基因表達載體的構建—核心用切目的基因相同的限制性內切酶切割質粒二、基因表達載體的構建—核心用切目的基因相同的限制性內切酶切二、基因表達載體的構建—核心二、基因表達載體的構建—核心二、基因表達載體的構建—核心目的基因二、基因表達載體的構建—核心目的基因外顯子內含子與RNA聚合酶結合位點編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點編碼區(qū)原核生物基因真核生物基因外顯子內含子與RNA聚合酶結合位點編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編二、基因表達載體的構建—核心1、基因表達載體的組成目的基因啟動子終止子標記基因等二、基因表達載體的構建—核心1、基因表達載體的組成目的基因二、基因表達載體的構建—核心2、基因表達載體的構建目的：a.使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。b.使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。二、基因表達載體的構建—核心2、基因表達載體的構建目的：a.三、目的基因導入受體細胞

1、目的基因導入植物細胞常用的方法是什么？具體過程是怎樣的？

2、目的基因導入動物細胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎樣的？

3、目的基因導入大腸桿菌的方法是怎樣的？鈣離子有什么作用？三、目的基因導入受體細胞1、目的基因導入植物細胞常用的方法1.目的基因導入植物細胞常用的方法:

農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法農桿菌的特點:a.易感染雙子葉植物和祼子植物。b.Ti質粒上的T-DNA可轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上三、目的基因導入受體細胞1.目的基因導入植物細胞常用的方法:農桿菌的特點:三、目的基三、目的基因導入受體細胞1.目的基因導入植物細胞農桿菌轉化法的導入過程:構建基因表達載體轉入農桿菌植物細胞導入穩(wěn)定維持和表達三、目的基因導入受體細胞1.目的基因導入植物細胞農桿菌轉化法２.目的基因導入動物細胞常用的方法:

顯微注射技術操作程序：三、目的基因導入受體細胞a.先提純含目的基因的表達載體b.從動物體內取出卵(受精卵）c.顯微注射儀進行顯微注射d.將含目的基因的受精卵移植到輸卵管或子宮中發(fā)育成新個體２.目的基因導入動物細胞常用的方法:三、目的基因導入受體細胞pp基因工程的基本操作程序課件3.目的基因導入微生物細胞原核生物的特點:繁殖快，多為單細胞，遺傳物質相對較少。大腸桿菌的轉化過程:用Ca2+處理細胞增加細胞壁的透性，與細胞膜無關三、目的基因導入受體細胞→

感受態(tài)細胞重組表達載體DNA分子與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子3.目的基因導入微生物細胞原核生物的特點:大腸桿菌的轉化過程四、目的基因的檢測與鑒定1、導入目的基因后需要檢測哪些方面？各采取什么方法？2、什么是DNA分子探針？檢測時的DNA探針通過什么原理來檢測目的基因和相應的mRNA？3、利用抗體－抗原雜交檢測的原理是什么？四、目的基因的檢測與鑒定1、導入目的基因后需要檢測哪些方面？目的基因的檢測內容和方法四、目的基因的檢測與鑒定1目的基因插入2目的基因是否表達目的基因的檢測內容和方法四、目的基因的檢測與鑒定1目的基因DNA分子雜交技術基因探針：核酸分子探針是指特定的已知核酸片段，能與互補核酸序列退火雜交，用于對待測核酸樣品中特定基因順序的探測。滿足：（1）必須是單鏈，（2）帶有容易被檢測出來的標記物。DNA分子雜交技術基因探針：核酸分子探針是指特定的已知核酸片3.在遺傳工程技術中,下列何種目的基因一般以直接分離的方法獲得()A.人的胰島素基因B.蠶的蠶絲蛋白基因C.芽孢桿菌的抗蟲基因D.菜豆儲藏蛋白基因4.1976年,美國的科學家首次將人的生長抑制素釋放因子的基因轉移到大腸桿菌,并獲得了表達,此文中的表達是指該基因在大腸桿菌()A.能進行DNA復制B.能傳遞給細菌后代C.能合成生長抑制素釋放因子D.能合成人的生長素3.在遺傳工程技術中,下列何種目的基因一般以直接分離的方法獲3.基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的,在基因操作的基本步驟中,不進行減基互補配對的步驟是()A.人工合成目的基因B.目的基因與載體結合C.將目的基因導入受體細胞D.目的基因的檢測和表達3.基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的,在基因操作的基因工程同步測驗一、選擇題(每項只有一個正確答案)1．下列有關限制性核酸內切酶的說法，正確的是A．限制酶主要是從真核生物中分離出來的B．限制酶的識別序列只能由6個核苷酸組成C．限制酶能識別雙鏈DNA分子的某種特定的核酸序列，并使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開D．限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端都為黏性末端基因工程同步測驗一、選擇題(每項只有一個正確答案)基因工程同步測驗2．有關基因工程敘述正確的是(

)A．限制酶只在獲取目的基因時才用B．重組質粒的形成是在細胞內完成的C．只要目的基因進入細胞就能成功實現(xiàn)表達D．蛋白質的氨基酸排列順序可能為合成目的基因提供線索基因工程同步測驗2．有關基因工程敘述正確的是()基因工程同步測驗3．下圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制性核酸內切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是A．①②③④

B．①②④③C．①④②③ D．①④③②基因工程同步測驗基因工程同步測驗4．以下甲、乙兩圖表示從細菌細胞中獲取目的基因的兩種方法，以下說法中錯誤的是（

）A．甲方法可建立該細菌的基因組文庫B．乙方法可建立該細菌的cDNA文庫C．甲方法要以脫氧核苷酸為原料D．乙方法需要逆轉錄酶參與基因工程同步測驗4．以下甲、乙兩圖表示從細菌細胞中獲取目的基基因工程同步測驗5．目的基因導入受體細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只有通過鑒定和檢測才能知道。下列屬于目的基因檢測和鑒定的是(

)①檢測受體細胞是否有目的基因②檢測受體細胞是否有致病基因③檢測目的基因是否轉錄出mRNA

④檢測目的基因是否翻譯成蛋白質A．①②③

B．②③④C．①③④ D．①②④

基因工程同步測驗5．目的基因導入受體細胞后，是否可以穩(wěn)定維持基因工程同步測驗7、(11分)(2012·新課標全國卷)根據(jù)基因工程的有關知識，回答下列問題：(1)限制性內切酶切割DNA分子后產(chǎn)生的片段，其末端類型有________和________。(2)質粒運載體用EcoRⅠ切割后產(chǎn)生的片段如下：

AATTC……G

G……CTTAA為使運載體與目的基因相連，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，還可用另一種限制性內切酶切割，該酶必須具有的特點是_____________________________。(3)按其來源不同，基因工程中所使用的DNA連接酶有兩類，即大腸桿菌DNA連接酶

和

T4DNA連接酶?；蚬こ掏綔y驗7、(11分)(2012·新課標全國卷)根據(jù)基因工程同步測驗(4)反轉錄作用的模板是________，產(chǎn)物是________。若要在體外獲得大量反轉錄產(chǎn)物，常采用________技術。(5)基因工程中除質粒外，________和________也可作為運載體。(6)若用重組質粒轉化大腸桿菌，一般情況下，不能直接用未處理的大腸桿菌作為受體細胞，原因是__________________________________。

基因工程同步測驗(4)反轉錄作用的模板是________，產(chǎn)基因工程同步測驗8．酵母菌的維生素、蛋白質含量高，可生產(chǎn)食品和藥品等。科學家將大麥細胞的LTP1基因植入啤酒酵母菌中，獲得的啤酒酵母菌種可產(chǎn)生LTP1蛋白，并釀出泡沫豐富的啤酒?；镜牟僮鬟^程如下：基因工程同步測驗8．酵母菌的維生素、蛋白質含量高，可生產(chǎn)食品基因工程同步測驗(1)該技術定向改變了酵母菌的性狀，這在可遺傳變異的來源中屬于____________。(2)從大麥細胞中可直接分離獲得LTP1基因，還可采用________方法獲得目的基因。本操作中為了將LTP1基因導入酵母菌細胞內，所用的載體是________________________。(3)此操作中可以用分別含有青霉素、四環(huán)素的兩種選擇培養(yǎng)基進行篩選，則有C進入的酵母菌在選擇培養(yǎng)基上的生長情況是____________________________________________________________________________________________________________?；蚬こ掏綔y驗(1)該技術定向改變了酵母菌的性狀，這在可遺基因工程同步測驗(4)除了看啤酒泡沫豐富與否外，還可以怎樣檢測LTP1基因在啤酒酵母菌中的表達？________________________________________________________________________________________________________________________________________________?；蚬こ掏綔y驗基因工程同步測驗(1)該技術定向改變了酵母菌的性狀，這在可遺傳變異的來源中屬于____________。(2)從大麥細胞中可直接分離獲得LTP1基因，還可采用________方法獲得目的基因。本操作中為了將LTP1基因導入酵母菌細胞內，所用的載體是________________________。(3)此操作中可以用分別含有青霉素、四環(huán)素的兩種選擇培養(yǎng)基進行篩選，則有C進入的酵母菌在選擇培養(yǎng)基上的生長情況是____________________________________________________________________________________________________________。(1)該技術定向改變了酵母菌的性狀，這在可遺傳變異的來源中屬于____________。(2)從大麥細胞中可直接分離獲得LTP1基因，還可采用________方法獲得目的基因。本操作中為了將LTP1基因導入酵母菌細胞內，所用的載體是________________________。(3)此操作中可以用分別含有青霉素、四環(huán)素的兩種選擇培養(yǎng)基進行篩選，則有C進入的酵母菌在選擇培養(yǎng)基上的生長情況是____________________________________________________________________________________________________________。(1)該技術定向改變了酵母菌的性狀，這在可遺傳變異的來源中屬于____________。(2)從大麥細胞中可直接分離獲得LTP1基因，還可采用________方法獲得目的基因。本操作中為了將LTP1基因導入酵母菌細胞內，所用的載體是________________________。(3)此操作中可以用分別含有青霉素、四環(huán)素的兩種選擇培養(yǎng)基進行篩選，則有C進入的酵母菌在選擇培養(yǎng)基上的生長情況是____________________________________________________________________________________________________________。基因工程同步測驗(1)該技術定向改變了酵母菌的性狀，這在可遺演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！第2節(jié)基因工程的操作程序第2節(jié)目的基因的檢測與及表達產(chǎn)物的測定基因工程的四大步驟：目的基因的獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與及表達產(chǎn)物的測定基因工程的四大步驟：目的基因閱讀P72并思考1、什么是目的基因？2、獲取目的基因的方法有哪些？閱讀P72并思考1、什么是目的基因？從基因文庫中獲取目的基因基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）從基因文庫中獲取目的基因基因文庫基因組文庫部分基因文庫基因文庫的構建過程基因組文庫限制酶供體細胞的全部DNA大量DNA片段拼接到載體上導入受體細胞擴增基因文庫的構建過程基因組文庫限制酶供體細胞的大量DNA拼接到利用PCR技術擴增目的基因PCR的全稱：聚合酶鏈式反應PCR的原理：體外的DNA復制

利用PCR技術擴增目的基因PCR的全稱：模板原料引物酶控制溫度利用PCR技術擴增目的基因——目的基因DNA——四種脫氧核苷酸——某單鏈DNA分子片段——耐熱的DNA聚合酶——PCR儀自動調控PCR的條件：模板利用PCR技術擴增目的基因——目的基因DNA——四種脫氧PCR的過程：利用PCR技術擴增目的基因變性(90-95℃)復性(55-60℃)延伸(70-75℃)PCR的過程：利用PCR技術擴增目的基因變性(90-95℃)cDNA基因文庫的構建過程mRNA單鏈DNA

雙鏈DNA逆轉錄cDNA文庫（部分基因組文庫）cDNA基因文庫的構建過程mRNA單鏈DNA雙鏈DNA逆轉依據(jù)目的基因的有關信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因在染色體上的位置基因的轉錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質等特性。從基因文庫中分離獲取目的基因依據(jù)目的基因的有關信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列從基因文庫中用化學方法直接人工合成條件：基因較小，核苷酸序列已知。用化學方法直接人工合成條件：基因較小，核苷酸序列已知。二、基因表達載體的構建—核心用切目的基因相同的限制性內切酶切割質粒二、基因表達載體的構建—核心用切目的基因相同的限制性內切酶切二、基因表達載體的構建—核心二、基因表達載體的構建—核心二、基因表達載體的構建—核心目的基因二、基因表達載體的構建—核心目的基因外顯子內含子與RNA聚合酶結合位點編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點編碼區(qū)原核生物基因真核生物基因外顯子內含子與RNA聚合酶結合位點編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編二、基因表達載體的構建—核心1、基因表達載體的組成目的基因啟動子終止子標記基因等二、基因表達載體的構建—核心1、基因表達載體的組成目的基因二、基因表達載體的構建—核心2、基因表達載體的構建目的：a.使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。b.使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。二、基因表達載體的構建—核心2、基因表達載體的構建目的：a.三、目的基因導入受體細胞

1、目的基因導入植物細胞常用的方法是什么？具體過程是怎樣的？

2、目的基因導入動物細胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎樣的？

3、目的基因導入大腸桿菌的方法是怎樣的？鈣離子有什么作用？三、目的基因導入受體細胞1、目的基因導入植物細胞常用的方法1.目的基因導入植物細胞常用的方法:

農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法農桿菌的特點:a.易感染雙子葉植物和祼子植物。b.Ti質粒上的T-DNA可轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上三、目的基因導入受體細胞1.目的基因導入植物細胞常用的方法:農桿菌的特點:三、目的基三、目的基因導入受體細胞1.目的基因導入植物細胞農桿菌轉化法的導入過程:構建基因表達載體轉入農桿菌植物細胞導入穩(wěn)定維持和表達三、目的基因導入受體細胞1.目的基因導入植物細胞農桿菌轉化法２.目的基因導入動物細胞常用的方法:

顯微注射技術操作程序：三、目的基因導入受體細胞a.先提純含目的基因的表達載體b.從動物體內取出卵(受精卵）c.顯微注射儀進行顯微注射d.將含目的基因的受精卵移植到輸卵管或子宮中發(fā)育成新個體２.目的基因導入動物細胞常用的方法:三、目的基因導入受體細胞pp基因工程的基本操作程序課件3.目的基因導入微生物細胞原核生物的特點:繁殖快，多為單細胞，遺傳物質相對較少。大腸桿菌的轉化過程:用Ca2+處理細胞增加細胞壁的透性，與細胞膜無關三、目的基因導入受體細胞→

感受態(tài)細胞重組表達載體DNA分子與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子3.目的基因導入微生物細胞原核生物的特點:大腸桿菌的轉化過程四、目的基因的檢測與鑒定1、導入目的基因后需要檢測哪些方面？各采取什么方法？2、什么是DNA分子探針？檢測時的DNA探針通過什么原理來檢測目的基因和相應的mRNA？3、利用抗體－抗原雜交檢測的原理是什么？四、目的基因的檢測與鑒定1、導入目的基因后需要檢測哪些方面？目的基因的檢測內容和方法四、目的基因的檢測與鑒定1目的基因插入2目的基因是否表達目的基因的檢測內容和方法四、目的基因的檢測與鑒定1目的基因DNA分子雜交技術基因探針：核酸分子探針是指特定的已知核酸片段，能與互補核酸序列退火雜交，用于對待測核酸樣品中特定基因順序的探測。滿足：（1）必須是單鏈，（2）帶有容易被檢測出來的標記物。DNA分子雜交技術基因探針：核酸分子探針是指特定的已知核酸片3.在遺傳工程技術中,下列何種目的基因一般以直接分離的方法獲得()A.人的胰島素基因B.蠶的蠶絲蛋白基因C.芽孢桿菌的抗蟲基因D.菜豆儲藏蛋白基因4.1976年,美國的科學家首次將人的生長抑制素釋放因子的基因轉移到大腸桿菌,并獲得了表達,此文中的表達是指該基因在大腸桿菌()A.能進行DNA復制B.能傳遞給細菌后代C.能合成生長抑制素釋放因子D.能合成人的生長素3.在遺傳工程技術中,下列何種目的基因一般以直接分離的方法獲3.基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的,在基因操作的基本步驟中,不進行減基互補配對的步驟是()A.人工合成目的基因B.目的基因與載體結合C.將目的基因導入受體細胞D.目的基因的檢測和表達3.基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的,在基因操作的基因工程同步測驗一、選擇題(每項只有一個正確答案)1．下列有關限制性核酸內切酶的說法，正確的是A．限制酶主要是從真核生物中分離出來的B．限制酶的識別序列只能由6個核苷酸組成C．限制酶能識別雙鏈DNA分子的某種特定的核酸序列，并使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開D．限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端都為黏性末端基因工程同步測驗一、選擇題(每項只有一個正確答案)基因工程同步測驗2．有關基因工程敘述正確的是(

)A．限制酶只在獲取目的基因時才用B．重組質粒的形成是在細胞內完成的C．只要目的基因進入細胞就能成功實現(xiàn)表達D．蛋白質的氨基酸排列順序可能為合成目的基因提供線索基因工程同步測驗2．有關基因工程敘述正確的是()基因工程同步測驗3．下圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制性核酸內切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是A．①②③④

B．①②④③C．①④②③ D．①④③②基因工程同步測驗基因工程同步測驗4．以下甲、乙兩圖表示從細菌細胞中獲取目的基因的兩種方法，以下說法中錯誤的是（

）A．甲方法可建立該細菌的基因組文庫B．乙方法可建立該細菌的cDNA文庫C．甲方法要以脫氧核苷酸為原料D．乙方法需要逆轉錄酶參與基因工程同步測驗4．以下甲、乙兩圖表示從細菌細胞中獲取目的基基因工程同步測驗5．目的基因導入受體細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只有通過鑒定和檢測才能知道。下列屬于目的基因檢測和鑒定的是(

)①檢測受體細胞是否有目的基因②檢測受體細胞是否有致病基因③檢測目的基因是否轉錄出mRNA

④檢測目的基因是否翻譯成蛋白質A．①②③

B．②③④C．①③④ D．①②④

基因工程同步測驗5．目的基因導入受體細胞后，是否可以穩(wěn)定維持基因工程同步測驗7、(11分)(2012·新課標全國卷)根據(jù)基因工程的有關知識，回答下列問題：(1)限制性內切酶切割DNA分子后產(chǎn)生的片段，其末端類型有________和________。(2)質粒運載體用EcoRⅠ切割后產(chǎn)生的片段如下：

AATTC……G

G……CTTAA為使運載體與目的基因相連，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，還可用另一種限制性內切酶切割，該酶必須具有的特點是_____________________________。(3)按其來源不同，基因工程中所使用的DNA連接酶有兩類，即大腸桿菌DNA連接酶

和

T4DNA連接酶。基因工程同步測驗7、(11分)(2012·新課標全國卷)根據(jù)基因工程同步測驗(4)反轉錄作用的模板是________，產(chǎn)物是________。若要在體外獲得大量反轉錄產(chǎn)物，常采用________技術。(5)基因工程中除質粒外，________和________也可作為運載體。(6)若用重組質粒轉化大腸桿菌，一般情況下，不能直接用未處理的大腸桿菌作為受體細胞，原因是__________________________________。

基因工程同步測驗(4)反轉錄作用的模板是________，產(chǎn)基因工程同步測驗8．酵母菌的維生素、蛋白質含量高，可生產(chǎn)食品和藥品等。科學家將大麥細胞的LTP1基因植入啤酒酵母菌中，獲得的啤酒酵母菌種可產(chǎn)生LTP1蛋白，并釀出泡沫豐富的啤酒?；镜牟僮鬟^程如下：基因工程同步測驗8．酵母菌的維生素、蛋白質含量高，可生產(chǎn)食品基因工程同步測驗(1)該技術定向改變了酵母菌的性狀，這在可遺傳變異的來源中屬于____________。(2)從大麥細胞中可直接分離獲得LTP1基因，還可采用________方法獲得目的基因。本操作中為了將LTP1基因導入酵母菌細胞內，所用的載體是________________________。(3)此操作中可以用分別含有青霉素、四環(huán)素的兩種選擇培養(yǎng)基進行篩選，則有C進入的酵母菌在選擇培養(yǎng)基上的生長情況是____________________________________________________________________________________________________________?；蚬こ掏綔y驗(1