食品安全地方標(biāo)準 植物性農(nóng)產(chǎn)品中赤霉素殘留量的測定 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法

食品安全地方標(biāo)準植物性農(nóng)產(chǎn)品中赤霉素殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法1范圍本標(biāo)準規(guī)定了蔬菜水果茶葉中赤霉素（GA3）殘留量的采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的測定方法。本標(biāo)準適用于桔子、蘋果、葡萄、黃瓜、油菜、番茄、西瓜、茶葉、茶青中赤霉素（GA3）殘留量的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T8855新鮮水果和蔬菜取樣方法3原理試樣中的赤霉素用乙腈—乙酸溶液提取，經(jīng)離心、C18基質(zhì)分散萃取、微孔濾膜過濾，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，外標(biāo)法定量。4試劑與材料除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑，實驗用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的二級水要求。4.1乙酸（99.7%）4.2乙酸銨（99.5％）4.3乙腈（色譜純）4.4甲醇（色譜純）4.5C18填料（目）4.6無水硫酸鎂4.7氯化鈉4.8ENVI-Carb固相萃取柱4.9標(biāo)準儲備液稱取100mg（精確到0.1mg）的赤霉素標(biāo)準品（4.8），用甲醇（4.4）溶解并定容于50mL容量瓶中，該溶液濃度為2mg/mL，于-20℃冰箱內(nèi)貯存，有效期6個月。4.10標(biāo)準工作溶液根據(jù)赤霉素在儀器上的響應(yīng)強度，用空白樣品提取液配成不同濃度（ng/mL）的混合標(biāo)準工作溶液，于4℃條件下保存，有效期2周-3周。4.110.22μm有機微孔濾膜4.12乙腈-0.1%乙酸：量取100mL乙腈（4.3），加入用移液槍吸取的0.1mL乙酸（4.1）。4.13乙腈-0.5%乙酸：量取100mL乙腈（4.3），加入用移液槍吸取的0.5mL乙酸（4.1）。4.14500mL純水（4）中加入192.7mg乙酸銨（4.2）和2.5mL乙酸（4.1），即為流動相A；500mL甲醇（4.4）中加入192.7mg乙酸銨（4.2）和2.5mL乙酸（4.1），即為流動相B。5儀器與設(shè)備5.1液相色譜-質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）5.2高速勻漿機5.3離心機：轉(zhuǎn)速不低于10000r/min5.4分析天平：感量為1mg、0.01mg5.5超聲波清洗器5.6渦旋混合器5.7具塞塑料離心管：50mL5.8具塞塑料離心管：10mL5.9樣品粉碎機6分析步驟6.1試樣制備取代表性的樣品，經(jīng)縮分后，將其切碎，充分混勻放入食品加工器粉碎（5.9），均勻分散，制成待測樣，備用。6.2提取凈化果蔬樣品：稱取10g（精確至0.01g）蔬菜水果試樣于50mL具塞塑料離心管（5.7）中，加入10mL乙腈-0.1%乙酸（4.11）提取液，加入無水硫酸鎂（4.6）4g，高速勻漿1min后，于10000r/min下離心5min。靜置片刻，吸取1mL上清液，于10mL具塞塑料離心管（5.8）中，加入30mgC18填料（4.5）后，高速勻漿1min后，于10000r/min下離心5min。過0.22μm有機微孔濾膜（4.11），待測。茶葉樣品：稱取2g（精確至0.01g）試樣于50mL具塞塑料離心管（5.7）中，加入10mL水與10mL乙腈-0.5%乙酸（4.12）提取液，高速勻漿1min后，于10000r/min離心5min。靜置片刻，移取上清液到50mL離心管（5.7）中，重復(fù)提取一次，合并上清液，在上清液中加入氯化鈉（4.7）1g，無水硫酸鎂（4.6）2g，高速勻漿1min后，于10000r/min離心5min，取1mL上樣，過5mL乙腈活化的ENVI-Carb固相萃取柱（4.8），用5mL乙腈洗脫，收集洗脫液，1mL甲醇復(fù)溶，過0.22μm有機濾膜（4.11），待測。茶青樣品：稱取5g（精確至0.01g）試樣，加入10mL乙腈-0.5%乙酸（4.12）提取液，高速勻漿1min后，于10000r/min離心5min。靜置片刻，移取上清液到50mL離心管（5.7）中，重復(fù)提取一次，合并上清液，在上清液中加入氯化鈉（4.7）1g，無水硫酸鎂（4.6）2g，高速勻漿1min后，于10000r/min離心5min，取1mL上樣，過5mL乙腈活化的ENVI-Carb固相萃取柱（4.8），用5mL乙腈洗脫，收集洗脫液，1mL甲醇復(fù)溶，過0.22μm有機濾膜（4.11），待測。6.3高效液相色譜-質(zhì)譜測定6.3.1液相色譜參考條件色譜柱：C18液相色譜柱（5μm，2.1mm×150mm）或相當(dāng)。流動相：A：5mmol/L乙酸銨-0.5%乙酸水溶液；B：5mmol/L乙酸銨-0.5%乙酸甲醇溶液，梯度洗脫程序見表1。表1梯度洗脫程序表時間（min）5mmol/L乙酸銨-0.5%乙酸水溶液（流動相A）5mmol/L乙酸銨-0.5%乙酸甲醇溶液（流動相B）08515160403.56040650501045551559520595238515288515柱溫：40℃。流速：0.2mL/min。進樣體積：5μL6.3.2質(zhì)譜條件a）離子源：電噴霧ESI，正負離子切換模式。b）掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM。c）霧化氣、氣簾氣及輔助氣均為高純氮氣或其他合適氣體；使用前應(yīng)調(diào)解各氣體流量以及離子源溫度（TEM）使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求，霧化氣壓力（GS1）、氣簾氣壓力（CUR）、輔助氣流速（GS2）等詳細條件參見附錄A。d）電噴霧電壓（IS）、碰撞電壓（CE）、去簇電壓（DP）、碰撞室入口電壓（EP）、碰撞室出口電壓（CXP）應(yīng)優(yōu)化至最佳靈敏度，監(jiān)測離子和定量離子等詳細條件參見附錄A。6.3.3定性通過樣品總離子流色譜圖上各色譜峰的保留時間和各色譜峰對應(yīng)的特征離子與標(biāo)準樣品相應(yīng)的保留時間和各色譜峰對應(yīng)的特征離子進行對照定性。樣品與標(biāo)準品保留時間的相對偏差不大于±2.5%。樣品中目標(biāo)化合物的特征離子相對豐度與濃度相當(dāng)標(biāo)準溶液的相對豐度一致，相對豐度偏差不超過表1的規(guī)定，則可判斷樣品中存在目標(biāo)化合物。表2定性離子相對豐度的最大允許偏差相對離子豐度≥50%>20%至50%>10%至20%≤10%允許的相對標(biāo)準偏差±20%±25%±30%±50%6.3.4標(biāo)準曲線的繪制取空白樣品按照6.2處理。用所得的樣品溶液將赤霉素標(biāo)準儲備液（4.8）逐級稀釋得到的濃度為0.5、1、2.5、5、10、100、200、500ng/mL的標(biāo)準工作液（4.9），濃度由低到高進樣檢測，以定量離子峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準曲線回歸方程。本方法采用外標(biāo)法定量。6.3.5空白試驗不加試樣，均按上述步驟進行操作。6.3.6結(jié)果計算試樣中赤霉素殘留量以質(zhì)量分數(shù)w表示，單位以毫克每千克（mg/kg）計，按公式（1）計算：A×Cs×VAs×mA×Cs×VAs×m式中：w—樣品中赤霉素含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；A—試樣溶液對應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值；As—赤霉素標(biāo)準溶液對應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值；Cs—赤霉素標(biāo)準溶液的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；V—樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）；m—樣品的質(zhì)量，單位為克（g）；n—稀釋倍數(shù)。7精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。附錄A

（資料性附錄）

API5000四級桿質(zhì)譜儀參數(shù)（１）質(zhì)譜儀參數(shù)：a）電噴霧電壓（IS）：正模式4500V；負模式-4500V。b）霧化氣壓力（GS1）：40Psi。c）氣簾氣壓力（CUR）：5Psi。d）輔助氣流速（GS2）：40Psi。e）離子源溫度（TEM）：450C。f）監(jiān)測離子對、碰撞電壓（CE）、去簇電壓（DP）、碰撞室入口電壓（EP）、碰撞室出口電壓（CXP）如表A.1所示。表A.1定性、定量離子對以及CE、DP、EP、CXP參數(shù)表化合物母離子（Q1）子離子（Q3）CE（V）DP（V）EP（V）CXP（V）赤霉素-345.2-143.1*-40-90-10-15-221.2-30-90-10-15其中：*為定量離子對。（1）非商業(yè)性聲明：附錄A所列參考質(zhì)譜條件是在Aglient1200液相色譜儀，ABAPI5000質(zhì)譜儀上完成的，此處列出試驗用儀器型號僅為提供參考，并不涉及