體外受精胚胎移植技術(shù)

關(guān)于體外受精胚胎移植技術(shù)第一頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.體外受精1.1定義：體外受精(InVitroFertilization)是指哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)，英文簡稱為IVF。第二頁，共五十二頁，2022年，8月28日Invitro

fertilization

or

fertilisation

(IVF)isaprocessbywhich

anegg

isfertilised

by

sperm

outsidethebody:

invitro

("inglass").Theprocessinvolvesmonitoringandstimulatingawoman'sovulatoryprocess,removing

anovumorova

(eggoreggs)fromthewoman's

ovaries

andlettingspermfertilisetheminaliquidinalaboratory.Thefertilisedegg(zygote)isculturedfor2–6daysinagrowthmediumandisthen

implanted

inthesameoranotherwoman's

uterus,withtheintentionofestablishingasuccessful

pregnancy.第三頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.2體外受精的發(fā)展歷史1878年，德國科學(xué)家Schenk就開始進(jìn)行哺乳動物卵子體外受精的嘗試。1945年，美籍華人張明覺成功的進(jìn)行了兔體外受精，但在此后的5年里沒有能再重復(fù)出這一結(jié)果。這個時期的體外受精工作主要建立在經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上。1951年，張明覺和澳大利亞的Austin幾乎同時發(fā)現(xiàn)只有在雌性生殖道內(nèi)停留一段時間的精子才能成功的與卵結(jié)合，進(jìn)行體外受精。精子獲能現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)是體外受精史上的一個里程碑。1959年，張明覺利用體內(nèi)獲能處理的精子進(jìn)行體外受精實(shí)驗(yàn)，獲得世界上首例“試管動物”—試管兔，為哺乳動物體外受精工程奠定了基礎(chǔ)。從此結(jié)束了生殖生物學(xué)界幾十年來對哺乳類卵子體外受精能否成功的爭論。第四頁，共五十二頁，2022年，8月28日20世紀(jì)60年代以后，體外受精研究迅速發(fā)展，在家兔、小鼠、大鼠、人、牛、豬、狒狒、獼猴、綿羊、山羊和老虎等10多種動物獲得了試管后代。1978年7月25日，第一例試管嬰兒LouiseBrown在英國誕生，這是體外受精技術(shù)走向全面應(yīng)用的標(biāo)志性事件，是醫(yī)學(xué)和生物學(xué)上的一次偉大的革命。1988年，中國大陸首例試管嬰兒鄭萌珠誕生。由北京醫(yī)科大學(xué)的張麗珠等人完成。第五頁，共五十二頁，2022年，8月28日“試管嬰兒之父”、英國科學(xué)家羅伯特-愛德華茲，2010年獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。(帕特里克·斯特普托)

第六頁，共五十二頁，2022年，8月28日第七頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.3體外受精的發(fā)展階段第一代：1978年英國專家steptoe和Edowrds定制了世界上第一個試管嬰兒，被稱為人類醫(yī)學(xué)史上的奇跡。它是將精子和卵子置于體外利用各種技術(shù)使卵子受精，培養(yǎng)幾天后移入子宮，使女性受孕生子。第二代：1992年由比利時Palermo醫(yī)師首次在人體成功應(yīng)用卵漿內(nèi)單精子注射（ICSI），使試管嬰兒技術(shù)的成功率得到很大的提高。第三代：隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來，在人工助孕與顯微操作的基礎(chǔ)上，胚胎著床前遺傳病診斷（PGD）開始發(fā)展并用于臨床，使不孕不育夫婦不僅能喜得貴子，而且能優(yōu)生優(yōu)育。第八頁，共五十二頁，2022年，8月28日ICSI,intracytop-lasmicsperminjection,assistedhatching第九頁，共五十二頁，2022年，8月28日Preimplantationgeneticdiagnosis(PGD)PolarbodyPGDBlastomerePGD第十頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.4體外受精過程第十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.4.1卵母細(xì)胞的采集卵母細(xì)胞的采集方法通常有三種：(1)超數(shù)排卵。(2)從活體卵巢中采集卵母細(xì)胞。(3)從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細(xì)胞。第十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日（1)控制性超數(shù)排卵由于自然月經(jīng)周期的長短因人而異，同一患者不同周期也存在差異，所以不易安排取卵時間，而且自然周期中只有一個優(yōu)勢卵泡發(fā)育，受精后只能形成一個胚胎，而移植一個胚胎的妊娠率是很低的。所以需要采用控制性超排卵來增強(qiáng)與改善卵巢功能，以達(dá)到不受自然周期的限制、獲得多個健康卵子的目的，提供多個胚胎移植，并盡可能使黃體發(fā)育與子宮內(nèi)膜功能同步?？刂菩猿怕岩话闶窍扔肎nRHa使體內(nèi)FSH和LH降調(diào)，再施與HMG或FSH排卵藥物，刺激卵巢中的卵泡成長，依據(jù)患者對藥物的反應(yīng)性調(diào)整藥物使用劑量，患者的年齡及藥物的使用劑量不同，所獲得的卵子數(shù)亦不同。

第十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日(2）從活體卵巢中采集卵母細(xì)胞卵巢卵母細(xì)胞的活體采集主要用于非屠宰大中型動物重復(fù)進(jìn)行卵母細(xì)胞的采集?？刹捎檬中g(shù)法也可以在超聲波圖像或腹腔鏡引導(dǎo)下進(jìn)行卵巢卵母細(xì)胞活體采集。第十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日Ⅰ.卵巢卵母細(xì)胞的活體采集手術(shù)活體采集暴露動物卵巢，用含有采卵液的注射器抽吸卵泡的卵泡液。超聲波圖像引導(dǎo)下的卵巢卵母細(xì)胞活體采集優(yōu)點(diǎn)：穿刺孔小。缺點(diǎn)：不如腹腔鏡直觀，且回收率低腹腔鏡引導(dǎo)下的卵巢卵母細(xì)胞活體采集非手術(shù)法，對母體無傷害。第十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日(3)從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細(xì)胞離體卵巢卵母細(xì)胞的采集一般用于從屠宰的大中型動物卵巢上采集卵母細(xì)胞或收集腔前卵泡卵母細(xì)胞。采卵前準(zhǔn)備卵巢保存液、采卵液、采集卵巢器械及采卵器械。第十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日Ⅰ.離體卵巢卵母細(xì)胞的采集屠宰家畜，30分鐘內(nèi)取出卵巢；0.9%溫生理鹽水沖洗；11h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室采卵。25℃,超凈工作臺內(nèi)，去除韌帶和輸卵管，沖洗血污；有腔卵泡采用抽吸法、切割法或剝離法收集卵母細(xì)胞。特點(diǎn)：快速、無菌第十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日抽吸法注射器吸取采卵液，輕刺入卵泡中，吸取卵母細(xì)胞。切割法切割卵巢，回收液體，實(shí)體顯微鏡下?lián)斐雎涯讣?xì)胞。剝離法剝?nèi)⊥暾膱A形卵泡，切開卵泡，收集卵母細(xì)胞。麻煩，損傷小腔前卵泡-無腔卵泡的收集剪碎卵巢，膠原酶消化(或組織切碎機(jī))，過網(wǎng)篩，收集卵母細(xì)胞。第十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日抽吸法用裝有5號針頭的5mL注射器吸取2mL采卵液，將針頭輕輕刺入人2~5mm(羊)或2~8mm(牛)的卵泡中連同卵泡液吸取卵母細(xì)胞，每吸2~5個卵泡后，將注射器內(nèi)的液體緩慢注入檢卵杯中，以備檢查。第十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日（四）卵母細(xì)胞形態(tài)分類依據(jù)卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)的外形。只有A和B級卵母細(xì)胞可用于成熟培養(yǎng)。A級：3層以上完整而致密的卵丘細(xì)胞B級：卵丘細(xì)胞3層以下，部分脫落。C級：卵丘細(xì)胞擴(kuò)展而松散。D級：卵丘細(xì)胞全部脫落，裸卵。第二十頁，共五十二頁，2022年，8月28日第二十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.4.2卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體外受精獲取成熟卵母細(xì)胞主要通過以下兩條途徑：（1）體內(nèi)成熟，經(jīng)超數(shù)排卵處理后，采取成熟卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞或從輸卵管內(nèi)回收剛剛排出的卵母細(xì)胞；（2)體外成熟，采集卵泡中未成熟的卵母細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)使之成熟。后一種方法可以充分利用母畜的卵巢，是解決卵子來源最有效的途徑，具有更大的實(shí)用價值。第二十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日（一）卵母細(xì)胞成熟的特征卵母細(xì)胞成熟是指充分生長卵母細(xì)胞向成熟卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程。包括：減數(shù)分裂的恢復(fù)和完成，以及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、透明帶和卵丘細(xì)胞的成熟變化。第二十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日(二)卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)方法1.培養(yǎng)液合成培養(yǎng)液如TCM-199(80%)、Ham’sF10和F12。緩沖體系對卵母細(xì)胞體外成熟有重要影響。胎牛血清比添加BSA有更高的成熟率。血清含有某種能促進(jìn)卵母細(xì)胞或體外受精的成分，可阻止透明帶硬化和促進(jìn)受精第二十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日2、培養(yǎng)方法在滅菌石蠟油中，制作0.05-0.2mL培養(yǎng)液微滴，1-6個微滴/培養(yǎng)皿。選取A和B級卵母細(xì)胞，用培養(yǎng)液洗滌2～3次，移入微滴中，10-15個卵母細(xì)胞/微滴，在5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。第二十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日（三）影響卵母細(xì)胞體外成熟的因素1.動物種類-卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同，需要條件也不同。2.卵母細(xì)胞供體母畜年齡、性機(jī)能及卵巢狀態(tài)-初情期、性成熟卵母細(xì)胞。3.卵母細(xì)胞類型A級和B級具有較高受精率。4.卵巢運(yùn)輸、取卵方式和季節(jié)-溫度過低，冷休克。5.培養(yǎng)系統(tǒng)，包括溫度、濕度、空氣環(huán)境和培養(yǎng)基等。第二十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.5精子體外獲能定義：哺乳動物的精子必須在子宮或輸卵管內(nèi)經(jīng)過一定的時間，發(fā)生一定的生理變化，才能獲得穿透卵子的能力，此現(xiàn)象稱為精子獲能。有效的體外獲能技術(shù)是成功地進(jìn)行體外受精的前提和保證。第二十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日（1）精子體外獲能Ⅰ.精子體外獲能的主要途徑1、高離子強(qiáng)度液2、鈣離子載體3、氨基多糖法Ⅱ.獲能精子的特征及檢測1、獲能精子的特征2、獲能精子的檢測第二十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日Ⅰ.精子體外獲能的主要途徑生殖道液體中存在誘導(dǎo)獲能和頂體反應(yīng)的因子和鈣離子。加入誘導(dǎo)獲能的有效成分：鈣離子載體、氨基多糖、脂類、咖啡因、腎上腺素、cAMP、鞘磷脂酶等。第二十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.高離子強(qiáng)度液置換精子表面抗原物質(zhì)或去能因子，從而誘發(fā)頂體反應(yīng)。2.鈣離子載體精子的頂體反應(yīng)是一個Ca2+依賴過程。鈣離子載體攜帶鈣離子進(jìn)入精子內(nèi)，可誘發(fā)頂體反應(yīng)并激活頂體酶。3、氨基多糖法（GAGs)GAGs可促進(jìn)精子對Ca2+的吸取，從而誘發(fā)頂體反應(yīng)。其作用程度有賴于氨基多糖的硫酸化程度。肝素是硫酸化程度最高的GAG，其作用也最強(qiáng)。第三十頁，共五十二頁，2022年，8月28日（二）獲能精子的特征及檢測1、獲能精子的特征代謝改變，呼吸代謝明顯增加。運(yùn)動方式改變，超活化運(yùn)動。頂體形態(tài)變化，頂體帽部分的質(zhì)膜和頂體外膜在多處發(fā)生融合，膜泡狀化。超活化運(yùn)動發(fā)生于頂體反應(yīng)之前。第三十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日2、獲能精子的檢測運(yùn)動方式：鏡檢精子活力、運(yùn)動類型和運(yùn)動速度。頂體反應(yīng)：頂體反應(yīng)是判斷精子獲能的有效方法之一。電鏡：頭部質(zhì)膜與頂體外膜泡狀化，或僅殘存頂體內(nèi)膜。頂體染色法(三重染色技術(shù))光鏡觀察：品紅色，無頂體反應(yīng)。白色，有頂體反應(yīng)。藍(lán)黑色，死精子棕色，活精子。頂體帽頂體后區(qū)第三十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.6體外受精將獲能精子與成熟卵子置于受精液中共同培養(yǎng)，使之完成受精過程。影響因素：精子濃度精卵相遇的時間操作：石蠟油中懸浮0.1mL小液滴（精液），移入10-15枚成熟卵母細(xì)胞/小液滴，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至囊胚。第三十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.7研究意義1.7.1.基礎(chǔ)研究領(lǐng)域再現(xiàn)體內(nèi)受精過程，揭示受精的本質(zhì)和機(jī)理，研究胚胎的分化和發(fā)育。1.7.2.應(yīng)用研究領(lǐng)域治療不孕癥。胚胎工廠化生產(chǎn)，為胚胎移植業(yè)開辟胚胎來源。保護(hù)珍稀動物種質(zhì)資源。第三十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.胚胎移植2.1定義:胚胎移植(EmbryoTransfer)又稱受精卵移植，俗稱借腹懷胎，是指將雌性動物的早期胚胎，或者通過體外受精及及其他方式得到的胚胎，移植到同種的、生理狀態(tài)相同的其他雌性動物體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育為新個體的技術(shù)。第三十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日Embryotransferreferstoastepintheprocessofassistedreproductioninwhichembryosareplacedintotheuterusofafemalewiththeintenttoestablishapregnancy.Thistechnique(whichisoftenusedinconnectionwithinvitrofertilization(IVF)),maybeusedinhumansorinanimals,inwhichsituationsthegoalsmayvary.第三十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.2胚胎移植的發(fā)展歷史1890年，Heape在英國劍橋大學(xué)首次報道獲得兔子胚胎移植成功。20世紀(jì)30年代后開始大量研究，1951年willett首次成功地進(jìn)行了牛的胚胎移植。1974年，第一頭胚胎移植的何斯坦奶牛在美國出生。1976年，一些研究小組報道了采用導(dǎo)管高效采集胚胎的非手術(shù)方法，隨后胚胎移植在奶牛中的應(yīng)用得到飛速發(fā)展。我國對牛胚胎移植研究起步較晚，1978牛手術(shù)法胚胎移植犢牛降生，1980年非手術(shù)法移植成功，1982年冷凍胚胎移植成功。第三十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.3胚胎移植的基本原則1.胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性（1）供體和受體在分類學(xué)上屬于同一物種（2）胚胎發(fā)育階段與受體發(fā)情時間上的一致性（3）胚胎發(fā)育階段與受體生殖道解剖位置的一致性2.胚胎質(zhì)量3.經(jīng)濟(jì)效益和科學(xué)價值第三十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.4胚胎移植技術(shù)程序及操作供體和受體的選擇超數(shù)排卵處理供體母畜的配種胚胎的收集胚胎的檢查胚胎的保存與培養(yǎng)胚胎的移植供體和受體的術(shù)后觀察第三十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日×ET胚胎收集質(zhì)量檢查受體母牛同期發(fā)情胚胎移植程序示意圖第四十頁，共五十二頁，2022年，8月28日體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術(shù)流程圖第四十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.4.1供體和受體的選擇供體應(yīng)具有遺傳優(yōu)勢，良好的育種價值；供體應(yīng)具有良好的繁殖能力；供體應(yīng)營養(yǎng)良好，體質(zhì)健壯，健康無疾?。皇荏w具有良好的繁殖機(jī)能，體質(zhì)健康；供受體發(fā)情時間應(yīng)接近或一致（24小時之內(nèi)）。第四十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.4.2胚胎的采集采集時間的確定：發(fā)育時程采集方法：

手術(shù)法采集：適應(yīng)范圍廣非手術(shù)法采集：牛、馬第四十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日第四十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.4.3胚胎的檢查和鑒定胚胎的分級A級：發(fā)育