滇重樓內(nèi)生真菌分離與多樣性研究

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材料與方法

1.1滇重樓樣品采集

2022年4—5月，采集云南省昆明市嵩明縣阿子營鄉(xiāng)、大理州鶴慶縣松桂鎮(zhèn)、保山市隆陽區(qū)潞江鎮(zhèn)的滇重樓（無病蟲害），帶土采集后帶回溫室栽培，留待后續(xù)測驗。各試驗樣地的生境條件見表1，試驗分別取滇重樓的塊莖、根和葉3個部位舉行其內(nèi)生真菌的分開。表1各樣品采集地根本處境

Table1Habitatcharacteristicsofsamplingsinthisstudy

1.2內(nèi)生真菌的分開與純化

參考黃芳等[18]的研究方法，采用PDA培養(yǎng)基（青霉素G鈉和硫酸鏈霉素的質(zhì)量濃度為120μg·L-1）對滇重樓內(nèi)生真菌舉行分開與純化，其中各部位外觀消毒方案為：75%乙醇處理1min，無菌水沖洗4次，葉片用2.5%次氯酸鈉消毒4min（塊莖用0.1%升汞消毒5min，根用2.5%次氯酸鈉消毒15min），之后用無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干水分待用。接入分開培養(yǎng)基的各組織外觀消毒后的處理方法為：葉片剪成0.5cm×0.5cm，塊莖用解剖刀切成0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的方塊，根用解剖刀切成1cm長小段。菌種保藏采用PDA瓊脂斜面培養(yǎng)基，28℃恒溫箱倒置培養(yǎng)。試驗每皿接種5塊，各個樣地、各個部位各接種20皿。

1.3內(nèi)生真菌鑒定

1.3.1形態(tài)鑒定對分開與純化獲得的內(nèi)生真菌菌株舉行其群體形態(tài)特點（包括菌落大小、顏色、外觀特征、質(zhì)地）和個體形態(tài)特點（包括菌絲子實體和孢子形態(tài)）鑒定，參考《真菌鑒定手冊》[19]和《半知菌屬圖解》[20]對其舉行根本的分類，將具有一致形態(tài)特征的菌株歸并為同一形態(tài)類型。

1.3.2分子鑒定采用CTBA法[21]提取真菌基因組DNA。ITS擴增使用的引物為ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3′），兩者為通用引物，由上海生工生物工程公司合成。50μLPCR回響體系為：10μL10×PCRBuffer，0.25μLdNTPs（10mmol·L-1），1μLITS4，1μLITS5，0.3μLTaq酶，1μLDNA模板，用ddH2O補足50μL。擴增程序：94℃4min，94℃1min，54℃1min，72℃1min，33個循環(huán)，72℃3min，4℃保存。擴增產(chǎn)物送往上海生工生物工程公司測序。測序結(jié)果通過Chromas軟件校對，以每個形態(tài)型菌株的ITS序列作為靶序列，在NCB