核酸分子雜交-研究生教學(xué)課件

核酸分子雜交Nucleicacidhybridization*1*2指含有一部分互補(bǔ)序列、分子來源不同的核苷酸單鏈，在一定條件下按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，形成核苷酸雙鏈的過程。核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)印跡(blotting)指利用各種物理方法，使電泳凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到硝基纖維膜等特定的支持物上，使之成為固相化分子的過程。*3核酸雜交技術(shù)的理論基礎(chǔ)：DNA變性復(fù)性現(xiàn)象。第一節(jié)核酸探針及其標(biāo)記核酸探針(probe)的概念：

用來檢測(cè)某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA的標(biāo)記互補(bǔ)片段：與待測(cè)特定核苷酸的某一段序列互補(bǔ)；有明確的標(biāo)志用于后續(xù)的檢測(cè)。*4*5探針的種類寡核苷酸探針基因組DNA探針cDNA探針RNA探針

一

探針的種類及其選擇DNA探針*61．基因組DNA探針雙鏈探針:單鏈探針

采用PCR技術(shù)將各種克隆在質(zhì)粒載體中的特異性基因片段擴(kuò)增、標(biāo)記制備而成。

用化學(xué)法合成或從克隆在M13噬菌體的特異性基因片段制備。*72．cDNA探針

提取mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄cDNA，再經(jīng)cDNA克隆或PCR擴(kuò)增、標(biāo)記而制備成cDNA探針。3．RNA探針通常采用含T7或SP6啟動(dòng)子的表達(dá)載體來制備高度敏感的RNA探針。*8將目的基因克隆到含T7或SP6啟動(dòng)子的表達(dá)載體的MCS中，用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶在插入序列的下游切割而成的線性載體作為模板，加入T7或SP6RNA聚合酶、NTPs、和標(biāo)記-dUTP,即可制備出高度敏感的RNA探針。4．寡核苷酸探針采用DNA合成儀人工合成、標(biāo)記制備。二核酸標(biāo)記物及其選擇

核酸探針的標(biāo)記可分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記；根據(jù)標(biāo)記物摻入情況可分為均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記探針。不影響堿基對(duì)特異性理想標(biāo)記物應(yīng)備條件①高度靈敏性④有較高的化學(xué)穩(wěn)定性②高度特異性檢且不影響與目標(biāo)DNA結(jié)合③不影響標(biāo)記用酶的活性⑤標(biāo)記及檢測(cè)方法簡(jiǎn)單⑥環(huán)保，無損害*9優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)靈敏度和特異性極高半衰期短,隨用隨標(biāo)(一)放射性核素對(duì)各種酶促反應(yīng)無任何影響不影響堿基配對(duì)的特異性與穩(wěn)定性放射性污染用于核酸探針標(biāo)記的放射性核素主要有32P、35S和3H等；32P應(yīng)用最多。*10(二)非放射性標(biāo)記物優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)靈敏度較放射性核素標(biāo)記略低無放射性污染用于核酸探針標(biāo)記的非放射性標(biāo)記物主要有生物素、地高辛、熒光素(FITC、羅丹明)和酶等。穩(wěn)定性好,可較長(zhǎng)時(shí)間存放特異性較放射性核素標(biāo)記低*11*12ThemethodusedtoproducenonradioactiveDNAmoleculescarriedaspecificchemicalmarkercouldbedetectedwithanappropriateantibodyoravidin.biotin-avidinsystemDig-dUTP1.地高辛和生物素用一種標(biāo)記核苷酸代替原料dNTPs中對(duì)應(yīng)的非標(biāo)記核苷酸，使標(biāo)記核苷酸摻入到合成新鏈中。Dig-dUTPUU別名：VitaminH分子量：244.31水溶性好關(guān)于生物素（Biotin）結(jié)合對(duì)象：親和素Avidin鏈親和素Streptavidin中性親和素NeutrAvidin單體親和素MonoAvidin

*14當(dāng)雙鏈DNA一條鏈上有切口時(shí)，E.coliDNA聚合酶Ⅰ的5’→3’的外切酶活性能從切口的5’端除去核苷酸；同時(shí)，5’→3’聚合酶活性可將核苷酸連接到切口的3’羥基末端；使切口沿著DNA鏈移動(dòng)。(一)DNA切口平移(nicktranslation)

標(biāo)記法*15三、核酸探針標(biāo)記的主要方法用一種標(biāo)記核苷酸代替原料dNTPs中對(duì)應(yīng)的非標(biāo)記核苷酸，使標(biāo)記核苷酸摻入到合成新鏈中。思考題13’5’3’5’3’5’①5’→3’聚合酶活性②3’→5’外切酶活性③5’→3’外切酶活性DNA酶Ⅰ：在雙鏈DNA上隨機(jī)打開若干個(gè)單鏈缺口，產(chǎn)生3’-OH端。大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性；5’→3’

外切核酸酶活性。DNA切口平移標(biāo)記法示意圖*16最適切口平移的片段一般為50-500個(gè)核苷酸。使寡核苷酸隨機(jī)引物與DNA模板結(jié)合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探針；(二)DNA隨機(jī)引物標(biāo)記法*17用一種標(biāo)記核苷酸代替原料核苷酸中對(duì)應(yīng)的非標(biāo)記核苷酸，使標(biāo)記核苷酸摻入到合成新鏈中。Klenow片段沒有5’→3’外切酶活性，反應(yīng)穩(wěn)定，可

以獲得大量的有效探針；隨機(jī)引物：含有各種可能排列順序的6聚寡核苷酸片段的混合物。（46=4096種）DNA聚合酶ⅠKlenow片段：保留5’→3’DNA聚合酶活性,弱3’→5’外切酶活性，無5’→3’外切酶活性。DNA隨機(jī)引物標(biāo)記法示意圖*18通常，產(chǎn)物平均長(zhǎng)度為400-600個(gè)核苷酸。Bio-5′3′3′5′完整雙鏈DNA限制性內(nèi)切酶5′3′3′5′Bio-dNTP其他3種dNTPsKlenow聚合酶5′3′3′5′變性5′3′3′5′5′末端突出的DNA3′末端標(biāo)記的DNA末端標(biāo)記的單鏈DNA探針1.DNA的3′末端標(biāo)記(三)DNA探針的末端標(biāo)記*19Dig-dUTP用一種標(biāo)記核苷酸代替原料核苷酸中對(duì)應(yīng)的非標(biāo)記核苷酸，使標(biāo)記核苷酸摻入到合成新鏈中。核酸探針標(biāo)記的其它方法(一)DNA切口平移標(biāo)記法(二)DNA隨機(jī)引物標(biāo)記法(七)單鏈DNA探針的標(biāo)記(三)末端標(biāo)記1：3′DNA末端標(biāo)記法(四)RNA探針的標(biāo)記(五)cDNA探針的標(biāo)記(六)寡核苷酸探針的標(biāo)記*21核酸探針標(biāo)記的主要方法(三)末端標(biāo)記2：

5′DNA的末端標(biāo)記四、標(biāo)記探針的純化凝膠過濾層析常用的商品凝膠基質(zhì)是SephadexG-50和Bio-GelP-60，所獲的探針長(zhǎng)度一般大于100nt。選擇性沉淀反復(fù)使用乙醇沉淀；2mol/L醋酸銨

和乙醇的沉淀效果更好。*22第二節(jié)Southern印跡雜交

Southern印跡雜交（Southernblotting）是指DNA與DNA分子之間的雜交?；具^程:

將瓊脂糖凝膠電泳分離的待測(cè)DNA片段變性，再將凝膠中的DNA分子轉(zhuǎn)移到硝基纖維膜等固相支持物上，然后用標(biāo)記的探針檢測(cè)待測(cè)的DNA?？捎糜诨蚪MDNA的定性與定量分析，重組質(zhì)粒和噬菌體的分析等。*23一、固定支持物與印跡方法的選擇*241975年，EdwenSouthern建立的DNA印跡：印跡轉(zhuǎn)移的方法有毛細(xì)作用轉(zhuǎn)移、電轉(zhuǎn)移和真空負(fù)壓吸引轉(zhuǎn)移支持物轉(zhuǎn)移緩沖液紙巾玻璃板500gWhatman濾紙凝膠Whatman濾紙重物NC膜或尼龍膜*25限制性內(nèi)切酶消化酶切DNA樣品的電泳分離凝膠中DNA的NaOH變性凝膠中DNA分離帶Southern印跡凝膠中DNA帶被轉(zhuǎn)移到NC膜上標(biāo)記探針雜交探針雜交帶曝光顯影

二、Southern印跡雜交的基本過程④HRP標(biāo)記抗體與Dig結(jié)合②漂洗和封閉YHRPHRPHRP⑤底物與抗體-HRP反應(yīng),顯色或發(fā)光底物①

電泳,轉(zhuǎn)膜，紫外交聯(lián)固定D││D

North-South雜交原理和操作流程(地高辛標(biāo)記)③雜交：Dig標(biāo)記的探針與靶DNA結(jié)合*27用無關(guān)的單鏈DNA，如小牛胸腺DNA或鮭魚精子DNA預(yù)雜交。思考題21.曝光：用濾紙吸去雜交膜上多余底物，作好標(biāo)記，

保鮮膜包裹，放在暗夾里，放上X光片，曝光1-5

分鐘；2.顯影：取出X光片，按使用說明書顯影和定影。化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

Luminol化學(xué)發(fā)光原理*28

North-South雜交原理和操作流程(Biotin標(biāo)記)③雜交：生物素標(biāo)記的探針與靶DNA結(jié)合⑤底物在HRP催化下,反應(yīng)發(fā)光②洗膜封閉①電泳,轉(zhuǎn)膜，紫外交聯(lián)固定SAHRP底物B││B④HRP標(biāo)記的鏈親和素與探針上的生物素結(jié)合*29第三節(jié)Northern印跡雜交

利用類似于Southern印跡雜交的技術(shù)來檢測(cè)RNA稱為Northern印跡雜交（Northernblotting）。原理和過程與Southern印跡基本相同，只是檢測(cè)的分子是RNA，可用來對(duì)組織或細(xì)胞中的mRNA進(jìn)行定性或定量分析。*30Northern與Southernblotting的異同點(diǎn)相同點(diǎn)：原理均為毛細(xì)作用用途：檢測(cè)組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平；比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。不同點(diǎn)：轉(zhuǎn)移的是RNA轉(zhuǎn)移前無需酶切轉(zhuǎn)移效率較高變性方法:DNA(堿變性）

RNA（甲醛、乙二醛等）*31一、斑點(diǎn)雜交與狹縫印跡雜交

將DNA或RNA變性后直接點(diǎn)樣于NC膜或尼龍膜上，再采用特定的探針進(jìn)行雜交，稱為斑點(diǎn)印跡。簡(jiǎn)便、快速，可以在同一張膜上進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)。12/14/20223296孔斑點(diǎn)印跡轉(zhuǎn)印系統(tǒng)第四節(jié)

其他核酸分子雜交方法Slot-blot結(jié)果GS-670型光密度掃描儀(Bio-Rad)

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是直接用熒光標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞涂片中的目標(biāo)基因進(jìn)行雜交的方法。可用于檢測(cè)組織切片或細(xì)胞內(nèi)某些特異性核苷酸或核酸片段。12/14/202234(一)熒光原位雜交(FluorescenceISH,FISH)

二、原位雜交(insituhybridization)

新鮮組織切片、細(xì)胞涂片或石蠟切片上的組織或細(xì)胞樣品，經(jīng)固定劑固定和蛋白酶消化使細(xì)胞膜通透性增大，使標(biāo)記探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與互補(bǔ)的核酸片段雜交。方法：特點(diǎn)：不需提取被檢核酸，被檢核酸可在細(xì)胞內(nèi)定位。應(yīng)用：被檢測(cè)基因或mRNA在細(xì)胞內(nèi)的檢測(cè)及定位。1986創(chuàng)建的熒光原位雜交(FISH)用于特定基因的定位及其缺失、擴(kuò)增或重排的檢測(cè)。352022/12/14*36(二)菌落原位雜交*37（三）噬菌斑雜交plaquebybridization標(biāo)記的探針與待測(cè)核酸樣品在同一液體系統(tǒng)中形成雜交分子，經(jīng)含變性劑(通常為尿素)的PAGE分離后進(jìn)行信號(hào)顯示。12/14/202238

三、液相分子雜交(一)核酸酶S1保護(hù)分析法

是一種檢測(cè)RNA的雜交技術(shù)，又稱為S1-描圖。(1)用M13噬菌體體系合成高比活性的單鏈DNA探針；(2)與待測(cè)RNA樣品在液相中進(jìn)行雜交形成DNA/RNA雜交雙鏈；(3)加入核酸酶S1降解沒雜交的單鏈DNA和RNA；(4)采用PAGE分離雜交雙鏈后信號(hào)顯示檢測(cè)。12/14/202239

(二)RNA酶保護(hù)分析法

原理與核酸酶S1保護(hù)分析法基本相同，利用了RNA酶A和RNA