sds-page電泳問題與討論實例版?zhèn)€人總結(jié)之四

SDS電泳問題討論（實例版 凌波麗個人總結(jié)之四、 、小木蟲(金幣 一下，謝謝提供資 配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響 ， 在SDS－PAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris－甘氨酸緩沖系。在濃縮膠中其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導(dǎo)電性與電場強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度壓著蛋白質(zhì)分子 到一起濃縮為一狹窄的區(qū)帶當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后同時由于分離膠孔徑的縮小在電場的作用下蛋白分子根據(jù)其固有的 ， 所以，pH對整個反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實驗中在排除其他因 樣品如何處理根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDSDTT（Beta）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入Buffer，離心，沸水煮5min，再離 帶有烷基化作用的還原 非還原SDS處理：生理體液、、尿素等樣品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加還SDS電泳凝膠中各主要成分的作 提高SDS聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室 微笑”（兩 中間凹下）形帶原因主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗。“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)主要是樣品溶解效果不佳或分離膠濃度過大引起的 ，，處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑什么是“鬼 處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來 為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用 ）） 處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度為什么電泳的條帶很電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確 ；適當(dāng)降低電壓為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮。處理辦法：電泳槽正確裝配即可濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎這主要出現(xiàn)在初學(xué)者中一般對電泳不會有太大的影響前者主要原因是拔梳子用力不均勻 凝膠時間不對，或慢或快，怎么回事通常膠在30MIN-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用，TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。如果凝的太快，可能是APSTEMED用量過，二、 電泳帶彌散和拖尾的原因和改進(jìn)措施(2013-10-，握。一般上樣體積為10-15μL（即2-10μg蛋白質(zhì)。如果樣品很稀上樣量可以達(dá)到100μL。2.（1）樣品應(yīng)該充分溶解：保持各種蛋白質(zhì)樣品和Marker在上樣前能夠充分溶解，上樣前最(2)可以根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)試劑盒的要求加入樣品溶解液；如果是自行配置標(biāo)準(zhǔn)和未知樣品，按照0.5-1.0mg/LEppendorf（可以在蓋子處加上卡子后在110度沸水中水浴加熱3（可以在薄塑料板上鉆出幾個與Eppendorf管直徑形同的圓洞，Eppendorf管放下去直到蓋子邊緣約束不能再往下為止，把薄塑料板的出Eppendorf管的管體大分的那一放入沸水鍋中，薄塑料板自然飄在沸水表面，便于取用和加熱，也可避免沸水濺起?？梢砸慌鷮τ诙鄠€Eppendorf管進(jìn)行不同時間的沸水浴。Eppendorf管扔進(jìn)沸水浴鍋中，蓋子可能會被沖開，而后在室溫下冷卻待用。如果較長時間不用，則將樣品放入零下20度冰箱中，需用時在取出后使用前在110度沸水中加熱3（3）改變樣品緩沖溶液使得樣品能夠充分溶解，SDSSDS電泳帶變寬的原因和改進(jìn)措施(2013-10-7)原因三：SDS電泳帶與鄰近蛋白質(zhì)電泳相連。除了上樣量過多和樣品溶解不完全外，凝膠的加只能重新凝膠，梳子拔起時要等凝膠凝聚完畢，速度不宜過快，拔起的方向要垂直于樣品處理（充分溶解樣品：根據(jù)樣品分離目的不同，在上樣前對樣品進(jìn)行的溶解處理主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。SDSbufferSDSDTTBeta巰基乙醇)后，蛋白質(zhì)構(gòu)象SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶;另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。100μl10μl20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。非還原SDS處理：生理體液、、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未在SDS不連續(xù)電泳中，pH對整個反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的。制膠緩沖液使用的是Tris-HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.8，分離膠pH8.8;而電泳緩沖液使用的Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低;而Cl性場度比這帶成較電度著白子到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH(>8.8分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。所以，pH，驗中排其他后仍能好解問的況應(yīng)首要考慮該因素，即適當(dāng)進(jìn)一步地拉開濃縮膠和分離膠之間的pH值的差值。聚丙烯酰胺凝膠濃度/%蛋白質(zhì)分離范圍/kd 36— 24— 14— 14— 14—濃縮膠濃度低；分離膠濃度高于濃縮膠，一般不小 5%2KD的蛋白質(zhì)必須要用Tricine膠系統(tǒng)，上面說的改進(jìn)對于分子量低于3KD的蛋白質(zhì)的電泳沒有用，但是對于高于3KD的蛋白質(zhì)的電泳有用。以上材料的主要參考文獻(xiàn)是主編，蛋白質(zhì)純化實驗方案與應(yīng)用，化學(xué)工業(yè)，2010，第13章。SDS 的蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴(kuò)散的原因和解決方法20131024蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴(kuò)散可能有多種原加樣量過多，會引起蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴(kuò)散。為了提高分辨率，應(yīng)該避免加樣過多，小體積樣品可給出窄帶.加樣體積根據(jù)樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為10-15μL（即2-10μg蛋白質(zhì)。如果樣品很稀上樣量可以達(dá)到100μL。加樣沒有立即電泳會引起蛋白質(zhì)條帶模糊、分辨不佳和條帶擴(kuò)散。加熱蛋白質(zhì)樣品變性需要沸水浴3-5的二硫鍵在高溫下可能是會斷開，但是于空氣中溫度降低會重新形成二硫鍵，而且可能在過久放置過程中蛋白質(zhì)可能會再折疊，更不要扔到冰箱里保存。配制對應(yīng)蛋白質(zhì)相對分子量的適當(dāng)濃度的電泳凝膠，使得蛋白質(zhì)組分的以充分分離。蛋白質(zhì)樣品被水解。注意除去蛋白質(zhì)樣品的內(nèi)源性的水解酶，不要反復(fù)凍融電泳時間過長或過短。溴酚藍(lán)達(dá)到分離膠的底部即應(yīng)該關(guān)閉電泳電源低于10Kd的蛋白質(zhì)分子在SDSelectrophoresis不可能獲得好的分辨率，此時要緩沖溶液、SDSMr<15KDSDS可以加大緩沖溶液的摩爾濃度，并且用三羥甲基甘氨酸代替甘氨酸作為終止離子，濃度可先不變，還可以把分離膠的交聯(lián)度C增加到10%，這樣應(yīng)該可以順利。Mr<15KD的肽要用SDS，分離膠濃度應(yīng)該在15-20%，同時分離膠的交聯(lián)度C大約5%。SDS SDS電泳主要利用聚丙烯酰胺的分子篩效應(yīng)分離蛋白質(zhì)和核酸，SDS-PAG蛋白質(zhì)電泳分幾乎所有蛋白質(zhì)電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行，而所有條件總要確保蛋白質(zhì)解離成單個多肽亞基并進(jìn)可能減少其相互間的，最常用的就是SDS電泳技術(shù)，關(guān)于大家在此過程中經(jīng)常遇到的問題進(jìn)行一些討論：Q：SDS電泳的基本原理A：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS(十二烷基硫酸鈉)，SDS會與變性的多肽，并使蛋負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，1.4g15KD200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得Q：配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳A：在SDS不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris-HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分pH8.9;TrispH因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低;而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)pH所以，pH對整個反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實驗中在排除其他因后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。Q：樣品如何處A：根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。1、還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT(或Beta巰基乙醇)后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被SDS按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。2、帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶;另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。100μl樣品緩沖液中10μl20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。3、非還原SDS處理：生理體液、、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加Q：SDS電泳凝膠中各主要制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris-HCL系統(tǒng)，具體作用后面介紹;TEMED與AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固;Q：提高SDS電泳分辨率的途A1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。體可參照編著的《蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊》P82-103。Q：“微笑”(兩邊中間凹下)形帶原因A：主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗。Q：“皺眉”(兩邊向下中間鼓起)形帶原A：主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。Q：A：主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的處理辦法：加樣前離心;選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑;電泳緩沖液時間過長，重新配制;降低凝膠濃度。Q：為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)A：主要是樣品不溶性顆粒引起的處理辦法：加樣前離心;加適量樣品促溶劑。Q：A的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑;或可加適量EDTA來還原劑的氧化。Q：為什么溴酚藍(lán)不能起到指A：我們在實驗中常會遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：更換正確pH值的Buffer;降低分離膠的濃度。A：電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長度;保證濃縮膠貯液的pH正確(6.7);適當(dāng)降低電壓;Q：A：這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反;b.外槽液過少;c.電泳槽底部的絕緣體未去掉(比如倒膠用的橡膠皮)。處理辦法：電泳槽正確裝配即可Q：濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎?A：這主要出現(xiàn)在初學(xué)者中，一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致;后者是由于在解除制膠的后，板未壓緊而致空氣進(jìn)入引起的。SDS蛋白質(zhì)電泳的原理，蛋白質(zhì)電泳中蛋白樣品的準(zhǔn)備，蛋白質(zhì)電泳中拖尾現(xiàn)象的原因，濃縮膠的注意事項。SDS電泳中根本沒有帶出現(xiàn)目的蛋白質(zhì)的相對分子量對應(yīng)的條帶原因和解決2014717SDS電泳中根本沒有帶出現(xiàn)目的蛋白質(zhì)的相對分子量對應(yīng)的條帶。分兩種情對應(yīng)樣品泳道處用很寬的彌散帶出現(xiàn)。這又分為兩種情況：①上樣樣品中有不均一的雜MADLI-S、紅外光譜儀和紫外可見光光譜儀光譜檢測一下可能的凝膠上的目的蛋白質(zhì)帶中會收到的蛋白質(zhì)樣品的MADLI-S、紅外光譜和紫外光-可見光光譜的特征值與目的蛋白質(zhì)是否有吻合2的方法，再結(jié)合目的蛋白質(zhì)的序列特征，進(jìn)行MS-MSSDS目的蛋白質(zhì)沒有充分溶解（需要加入增溶劑），或者變性不徹底以至于目的蛋白質(zhì)沒有在結(jié)合SDS之后形成桿狀結(jié)構(gòu)而是還有部分球狀結(jié)構(gòu)引起電泳位置異常，或者發(fā)生了非常均一性的聚合（均一性聚合可能性不大），或者SDS用量不夠沒有充分使得目的蛋白質(zhì)沒有在結(jié)合SDS之后形成均一的桿狀結(jié)構(gòu)而是還有部分球狀結(jié)構(gòu)引起電泳位置異常（SDS用量不夠的話帶會較寬或者有多條，一般不會單一而且明亮）。1的原因 起來很復(fù)雜，一般知道一下，直接用2和3檢測盒調(diào)整就行了。緩沖液和分離膠的濃度不合適，需要重新配膠。處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低Mr范圍。可以2。聚丙烯酰胺凝膠濃度/%蛋白質(zhì)分離范圍/kd 36— 24— 14— 14— 14—濃縮膠濃度低；分離膠濃度高于濃縮膠，一般不小 5%如果樣品準(zhǔn)備中使用了如果樣品準(zhǔn)備中使用了EG，那么EG進(jìn)入電泳體系肯定會對電泳有影響，可以在樣品液點樣前用超濾離心管超濾離心去掉PEG成不溶物與PEG形成網(wǎng)絡(luò)聚合體無法去除EG。如果真的在煮沸蛋白質(zhì)樣品時可能使得EG形成的串珠狀高聚物，那么實際目的蛋白質(zhì)的分子量可能會加大很多，導(dǎo)致在電泳時在時可能使得PEGEG的特異性的紅外光譜的樣品，也有可能只有EG的特異性的紅外光譜而沒有熱變性的目的蛋白質(zhì)的特異性的紅外光譜，因為變性過程中有了PEG的干擾最終變性態(tài)也改變了，然后用S分別：檢測熱變性的目的蛋白質(zhì)的特異性的質(zhì)譜、EG的特異性的質(zhì)譜和樣品的質(zhì)譜，前兩者與第三者的質(zhì)譜應(yīng)該諸多到了此刻就不要去做SS電泳了，除非你非要用WB，那么你就要考慮去掉有關(guān)蛋白酶、——考慮堿性蛋白酶的水解酶類在樣品組織里是否有充足來源；另外堿性蛋白酶在煮沸變性WB、Pulldon、免疫沉淀、免疫共沉淀等，可以用MADLI-S、圓二色光譜、紅外光譜和紫外光-可見光光譜等更易于操作蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用方法代替WBull-onMADLI-MS、圓二色光譜、紅外光譜和紫外光-可見光光譜等特征值。五、SDS電泳實例分析：1.SDS大家好，請教一個問題：最近做SDS電泳，發(fā)現(xiàn)每次跑完膠，撬開薄板以后，膠的下端惱。分離膠的濃度是10%，80V或者90V恒壓跑全程，溴酚藍(lán)前沿出膠大約需要兩個半小時。感謝參與，應(yīng)助指數(shù)+1可能的原凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不 凝膠和玻璃擋板底有bubble，或者倆遍聚合不完全樣品中含有不溶性顆2.SDS各位大俠好：最近跑SDS出現(xiàn)了一點問題，蛋白分子量大小45KD，但是電泳時marker相比卻在44K29KD之間如果靠近44k就算了44k挺遠(yuǎn)的，請問各位有誰遇到過這種情況嗎這與蛋白的結(jié)構(gòu)以及等電點等因素有什么關(guān)系嗎謝謝指教大小有關(guān)，與形狀無關(guān)，為啥大小卻跟marker不一致呢糾結(jié)郁悶求解釋小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回silicare(金幣+3,BioEPI+1):2012-01-31你的電泳緩沖液是否正確？不同的電泳緩沖液marker膠是否正確。如上面仁兄所小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回silicare(金幣+12012-01-31是不是你的蛋白發(fā)生了降解？用你的樣品和別人的樣品一起跑個電泳，看看別人的樣分能不能對上，如果對上了，那就是你樣品的問題，如果他的也沒有對上，那就是膠的問baodongq★小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回silicare(金幣+12012-01-31蛋白結(jié)構(gòu)應(yīng)該沒有問題，在確認(rèn)膠的配制和電泳過程沒有問題，那么你的樣品在什么緩沖里面，里面的鹽濃度高不高，還 pH，都會有所影響hxs-520★★★小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回silicare(金幣+32012-01-31一般情況，如果膠有問題，marker也同樣有但是如果maker給的圖與說明書一致，那可能就是電泳之外的問題3.SDS ybs007【答案】應(yīng)助回★★amisking(金幣+3,BioEPI+1):2011-07-25loadingbuffer。電泳緩沖液。你的緩沖液用了多久，是否是回收的 ）電壓。懷疑是不是開始的電壓太高了請著重注意一下電泳液和電壓，尤其是電泳液，我曾經(jīng)在這個上栽了好多跟頭fanglove0o0蛋白質(zhì)電泳帶模糊不清和分辨率低，原因可能是蛋白質(zhì)樣品加多了，小量樣品能夠有窄帶加樣后沒有立即電泳，電泳后沒有立即固定，引起了擴(kuò)散樣品的蛋白質(zhì)發(fā)生了水解通?？拷把氐奈恢玫牡鞍踪|(zhì)帶分辨率不好，適當(dāng)灌制較長的凝膠個人意見，參考例4.例4.SDS20最近一直在做哪個sds聚丙烯酰胺凝膠電泳（分離膠濃度12%，濃縮膠是5%，在濃縮膠中的電壓用的80V大概30分鐘然后進(jìn)入分離膠的時候電壓用的120V整個電泳跑完的時間大概是2.5小時，樣品用的茶葉中提取的多酚氧化酶（粗蛋白，也用凝膠過濾層析初步進(jìn)行了分離純化，想做下電泳看看純度怎么樣，發(fā)現(xiàn)一直沒出現(xiàn)條帶，感覺拖尾非常嚴(yán)重，還有是做了很多次最后下面都有一條橫貫線（從左到右分別是ake粗蛋白兩個，純化后的蛋白兩個，最后兩個也是粗蛋白只是這個兩個粗蛋白的濃度不一樣，一直都找不到原因，在此求助于各位師兄 【答案】應(yīng)助回帖★kx444555:金幣+1,鼓勵交流2013-07-02你這個明顯是濃縮膠沒有凝 可以嘗試濃縮膠分離膠配好后過夜再上樣開【答案】應(yīng)助回帖★kx444555:金幣+2,鼓勵交流2013-05-28SDSpHmarker條帶都制劑可以解決，濃度低則可以用超濾濃縮或TCA沉淀法解決。Good蛋白拖尾看起來像是被降解了，建議在低溫條件下進(jìn)行親和層【答案】應(yīng)助回帖★kx444555:金幣+1,2013-07-02蛋白膠本身有問題，哪有電泳跑這么久的，200V跑到底，42min。我一直用這個參數(shù)。你所謂的蛋白通過SE純化，你知道蛋白的分子量大致范圍啊，沒有對照所以看不出來。在重新跑膠的時候，最后加入過SE之前的樣品，作為對照。小火爐【答案】應(yīng)助回帖建議樓主用15%的分離膠試試，90V，30in，120V，1h小小米吶 火爐at2013-05-31建議樓主用15%的分離膠那為什么時間長反倒要把分離膠濃度調(diào)高，不是應(yīng)該用低點的【答案】應(yīng)助回帖★kx444555:金幣+2,2013-07-02 MARKER 你蛋白是堿性蛋白嗎？如果是堿性蛋白，跑電泳的時候正負(fù)極要調(diào)換一下跑電泳例.dspge跑膠時間太長，時間也有問題10 sds 【答案】應(yīng)助回帖★★★★小丹木木:金幣+2,2012-03-27西瓜:金幣+3,MolEPI+1,2012-03-28不知道你要做什么，目的蛋白在哪里，看圖嘛下面這些是的話，還可以再跑跑，拉開距離?？梢耘軡舛雀咭稽c的，因為你這些跑的蛋白看來有點小就說你的題目問的，長時間跑膠會熱，會影響結(jié)果建議加個make，最右邊的那個是嗎？跑膠每孔的體積要一制，不夠補(bǔ)上樣緩沖液，要不你看你的第4道，被擠成啥養(yǎng)了調(diào)調(diào)上樣量，3,5的有點多，2,4的有點跑的稍有點彎，還可以，最好不變電壓跑完，80v（我常用，參考電泳上下槽的電泳 是一樣的，一般上槽我會用新的，下槽用舊的 不缺錢，就全新【答案】應(yīng)助回★感謝參與，應(yīng)【答案】應(yīng)助回★感謝參與，應(yīng)cxch1224:金幣+1★有幫助,謝謝2012-03-27用6%的膠，30K左右的用12.5%膠，都有不錯的結(jié)果送鮮花一送鮮花一不知道你要做什么，目的蛋白在哪里，看圖嘛下面這些是的話，還可以再跑跑，拉開距離?？梢耘軡舛雀咭稽c的，因為你這些跑的蛋白看來有點小就說你的題目問的，長時間跑膠會熱，會影響結(jié)建議加個maker，最右非常感不知道你要做什么，目的蛋白在哪里，看圖嘛下面這些是的話，還可以再跑跑，拉開距離。可以跑濃度高一點的，因為你這些跑的蛋白看來有點小就說你的題目問的，長時間跑膠會熱，會影響結(jié)建議加個maker，最右前沿是藍(lán)色的嗎？怎么我看到藍(lán)色的前面還有一條乳白色或者土紅色的線★西瓜:金幣+2,2012-03-28應(yīng)該是藍(lán)色的那條線，我當(dāng)時做大點的蛋白，都要把最前面的跑出你這個蛋白有點小感覺，跑到濃點的膠1/3或1/4處，應(yīng)該就差例6.請教大家雙向電泳圖譜問題是上樣量太高了嗎？定量后的濃度為2.16ug/ul，24厘米膠條，按照推薦上樣量250ug來算上樣116ul。左側(cè)為酸性端，有橫紋，請問是什么原因呢凌波★小木蟲:金幣+0.5,樣品沒有完全溶解，上樣前確保樣品完全溶解并且保持穩(wěn)定IEF的物質(zhì)存在，改進(jìn)樣品方法，可用分子篩、超濾、透析等純化蛋白樣品中存在存在干擾IEF的離子?？捎贸瑸V、透析等純化蛋白質(zhì)樣品降低離子強(qiáng)度（離子濃度要小于10mmol/L)；或者用TCA、沉淀蛋白質(zhì)，然后用緩沖溶液重新溶解被沉淀的蛋白質(zhì)（當(dāng)然棄TCA、）.凌波★小木蟲:金幣+0.5, 上樣量過大。需要適當(dāng)減少上樣量聚焦時間過短使得聚焦不完全。需要適當(dāng)延長聚焦時 凌波★★★★wizardfan:金幣+5,2013-08-22我覺得樓主的垂直方向也存在拖尾，應(yīng)是SDSSDS含量不足，電泳緩沖溶液的終濃度的SDS終濃度應(yīng)為0.1%;2.2.雙向電泳的第二向SDS電泳的電泳緩沖溶液（除了SDS含量不足外）可能放置過雙向電泳的第二SDS電泳時，可SDSSDS平衡液中加入30%的丙三醇和6M尿素；回帖我覺得樓主的垂直方向也存在拖尾，應(yīng)是SDSSDS含量不足，電泳緩沖溶液的終濃度的SDS終濃度應(yīng)為0.1%;雙向電泳的第二向SDS電泳的點用緩沖溶液（除了SDS含非常感謝。下次再試電泳緩沖液是新配置的，應(yīng)該沒問題。 也是夠的?？赡芫劢箷r間不行★ ，小木蟲金幣+0.51.的排除離子的干擾有可能是樣品中核酸的影響建議用核酸酶混合物(DnaseI和Rnase按照你給的上樣量應(yīng)該是銀染的吧？感覺你這背景很深而且高豐度的蛋白點都呈現(xiàn)透回帖:10樓:Originallypostedby2013-08-22在酸性端且大分子區(qū)域出現(xiàn)橫向條紋，我前不久也碰見過，樣品蛋白是用沉淀后的，。按照你給的上樣量，應(yīng)該是銀。水水應(yīng)該沒問題，是超純水是銀染，上樣量是太高了，染色時間30in，下次考慮縮短下。謝例7求助]6請問各位大俠電泳圖跑成這樣，銀染 謝凌波樣品沒有完全溶解，上樣前確保樣品完全溶解并且保持穩(wěn)定樣品中存在干擾IEF的物質(zhì)存在，改進(jìn)樣 ）蛋白質(zhì)（當(dāng)然棄去TCA 。 聚焦時間過長，引起膠內(nèi)滲水，并且改變了凝膠 的電場微環(huán)境，使得蛋白質(zhì)樣品 8.家蠶表皮二維電泳圖家蠶表皮二維電泳圖例8[求助]，， 6蛋白提取過程：乙腈沉淀蛋白，凍干（7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS）溶解凍干樣品，超純水透析三天除鹽，10KD超濾后測濃度，-80冰箱 IEF過程：7cmPH3-10蛋白上樣量1.5mg聚焦4000v1DTT210min*2IAA4%10min*2次2DTT215minIAA2.5%15min5mA20min10mA至結(jié)束R-2502013-08-22500ulpro聚焦【答案】應(yīng)助回帖蛋白【答案】應(yīng)助回帖蛋白提取純度不夠，估計雜質(zhì)和鹽濃度過2013-08-28聚焦4000v2mg蛋白2樓:Originallypostedbyat2013-09-06蛋白提取純度不夠，估計雜質(zhì)和鹽濃度過7cm能不能說說那種雜質(zhì)呢？怎么除去鹽濃度高的話，我聚焦也達(dá)到4000v了??！能不能說說那種雜質(zhì)呢？怎么除去鹽濃度高的話，我聚焦也達(dá)到 了我看雙向圖都是點 是一團(tuán)黑圓這個是怎么回事呢而且我上樣量挺大的7cm要500ug 學(xué)術(shù)【答案】應(yīng)助回帖凌波麗【答案】應(yīng)助回帖我覺得樓主可能有四個問題一、樓主的垂直方向存在拖尾，應(yīng)是SDSSDS含量不足，電泳緩沖溶液的終濃度的SDS終濃度應(yīng)為0.1%;SDS電泳的電泳緩沖溶液（SDS含量不足外）可能放置過雙向電泳的第二SDS電泳時，可SDSSDS平衡液中加入30%的丙三醇和6M尿素；二、上樣量過高5。凝膠的顯色背景比較深，蛋白質(zhì)的顯色斑面積太大（大的顯色斑很可能已經(jīng)掩蓋了很 ）的含量小的蛋白質(zhì)的小的顯色的含量小的蛋白質(zhì)的小的顯色 ，顯示上樣量明顯偏大，應(yīng)該較少上樣量樣品中存在干擾IEF的物質(zhì)存在，改進(jìn)樣品 白質(zhì)樣品用透析有時不容易除去一些小分子雜質(zhì)可以在透析后再用超濾純化蛋白質(zhì)樣品，濃度要小于10mmol/L)TCA白質(zhì)（當(dāng)然棄去TCA、。））我覺得樓主可能有四個問題一、樓主的垂直方向存在拖尾，應(yīng)是SDSSDS含量不足，電泳緩沖溶液的終濃度的SDS終濃度應(yīng)為0.1%;！沒想到您還真的來了，太激動了雙向電泳的第二向SDS電泳之前，還要用SDS緩沖溶液平衡IPG膠條嗎？這個平衡是平衡母液加2%DTT一次和4%IAA。這個濃度合適嗎？時間是我上面介紹的兩種方法，我試了兩次這兩種平衡方法對 圖沒有改進(jìn)效果，不知怎么的。蛋白上樣量我也覺得大了，我會改進(jìn)的，謝謝您說的太對了我感覺還是我蛋白樣品有干擾離子存在，可是我透析就透析72h，而且每3h換一次超純水，然后10KD超濾管超濾的。 ， 【答案】應(yīng)助回帖回帖！，）非常感謝啊！還資助我那么多金幣，太感動了??！沒想到您還真的來了，太激動！，）雙向電泳的第二向SDS電泳之前還要用SDS緩沖溶液平衡IPG膠條嗎？這個SDS IPG膠條長7cm時，DTT25mg，平衡液用量2.5ml，碘代乙酰胺IPG膠條長11，13cm時，DTT40mg，平衡液用量4.0ml，碘代乙酰胺IPG膠條長17cm時，DTT60mg，平衡液用量6ml，碘代乙酰胺IPG膠條長18cm時，DTT100mg，平衡液用量10ml，碘代乙酰胺400mg；其他長度的IPG膠條平衡試劑配制方法，大致按照以上比例推算一下。二、平衡步驟(以下兩個指標(biāo)取交集平衡緩沖液用量：2.5-10ml，DTT：25- ，平衡操作耗時10-平衡緩沖液用量：2510ml，碘代乙酰胺：100400m，平衡操作耗時1015min。凌波麗【答案】應(yīng)助回帖）） 試試有（文獻(xiàn)也介紹過。"）） 凌波麗【答案】應(yīng)助回帖））Good凌波【答案】應(yīng)助回帖回帖6樓:Originallypostedbyat2013-09-06聚焦總量多少？聚焦電壓可以升高回帖:"重新處理蛋白，通過查文獻(xiàn)，我用75%沉淀尿中蛋白（這個蛋白的回收率高，下批我用您介紹的試試有（文獻(xiàn)也介紹過。"重新處理蛋白質(zhì)用和都可以蛋白沉淀下來后，我用的是7M2M4%CHAPS40mMtris120mM2%ampholytes前只用7M2M4%CHAPS的然后蛋白溶解后從透析膜看去，會有白色顆粒，這是蛋這種情況呢你有沒遇到這種情況呢凌波【答案】應(yīng)助回帖 ：。當(dāng)尿素等一些變性劑或者表面活性劑會使得蛋白質(zhì)溶解與水中，也是有一個定量化的問題。在一定比例的表面活性劑和變性劑表面活性劑和變性劑與蛋白質(zhì)相互作用肯定會改變蛋白質(zhì)的折疊形態(tài)和其表面的結(jié)合的水膜而且表面活性劑和變性劑加入水中本身改變了溶液的離子強(qiáng)度和H等水環(huán)境，使得與原本可能還能夠溶于水的蛋白質(zhì)的折疊態(tài)也發(fā)生改變，因為蛋白質(zhì)是形成膠體溶液不是離子溶液所以蛋白質(zhì)在溶液中也是彼此又相互作用的 ：。， ，表面活性劑和變性劑的物質(zhì)的量蛋白質(zhì)的物質(zhì)的量的達(dá)到某種特定比例時會因為表面活性劑和變性劑形成了兩性離子結(jié)和在蛋白質(zhì)分子表面親水基團(tuán)在外給蛋白質(zhì)穿上了比較完整的親水外衣但是有沒有太多的結(jié)合上游離水分子所以促進(jìn)了蛋白質(zhì)的溶解但是在表面活性劑和變性劑的物質(zhì)的量：蛋白質(zhì)的物質(zhì)的量=其他比例時，可能會存在：無法完全給蛋白質(zhì)穿上親水外溢反而消耗了活性水或者表面活性劑和變性劑過多而自己彼此相互作用形成自我組織的聚合體， ， 活性劑和變性劑透析膜的孔徑能夠使得尿素這類小分子透過蛋白質(zhì)大分子無法透過所以變性劑（或表面活性劑）流失了，水環(huán)境又發(fā)生了變化，表面活性劑和變性劑的物質(zhì)的量：蛋白質(zhì)的物質(zhì)的量也就變化了 例9.[求助]聚丙烯凝膠電泳marker跑成空心什么原因5amisking:金幣+7,2013-08-2910bp 老跑成空心，什么原因？還有取膠時只抓著膠的一個角，為什么膠很臟呀Administrator2013-08-291800分鐘_副本【答案】應(yīng)助回帖★myprayer:金幣+1,看你空心的趨勢都是一樣的，所以判斷是你的膠溶的不均 回帖 。。2樓:Originallypostedbyat2013-08-30。?？茨憧招牡内厔荻际且粯拥?，所以判斷是你的膠溶的不均5圖為真菌胞內(nèi)蛋白雙向電泳圖，pH3-107cmbio-rad公司7cm膠S1250V30S2500V30S34000V3S44000V20,000S5500V設(shè)置等電聚焦時的溫度（20℃）【答案】應(yīng)助回帖產(chǎn)生這個的問題是第一向沒有分開。蛋白聚焦不夠所以2D的時候看到這樣的圖譜。建議你回帖產(chǎn)生這個的問題是第一向沒有分開。蛋白聚焦不夠所以2D的時候看到這樣的圖譜。建議你增加電壓，至少8000v，延長時間。這樣，在一維上蛋白聚焦足夠好以后，才能在二維上看到點狀的，而不是帶狀的圖譜。等點聚焦條件等按bio-rad公司說的來得，他寫7cm膠不是4000v嗎？？？要8000v?。?？我一直以為是樣品的原因凌波【答案】應(yīng)助回帖。 。 樣品沒有完全溶解，上樣前確保樣品完全溶解并且保持穩(wěn)定樣品中存在干擾IEF的物質(zhì)存在，改進(jìn)樣品方法，可用分子篩、超濾、透析等純化蛋白樣品中可能存在干擾IEF的離子。可用超濾、透析等純化蛋白質(zhì)樣品降低離子強(qiáng)度（離子濃度要小于10mmol/L)；或者用TCA、沉淀蛋白質(zhì)，然后用緩沖溶液重新溶解被沉淀的蛋白質(zhì)（當(dāng)然棄去TCA、。聚焦時間過短使得聚焦不完全。需要適當(dāng)延長聚焦時聚焦時間過長，引起膠內(nèi)滲水，并且改變了凝膠的的電場微環(huán)境，使得蛋白質(zhì)樣品再次具體可以再討論例例11.求助，sds跑膠都糊成一片了，~~o(>_<)o★10kx444555:金幣+1,2013-09-27從左到右是maker，樣品a，樣品b。a和b分別是微生物蛋白和蚯蚓蛋白，提取方法不一也還可以但是顯然被aa樣品裂解液中的成分有問題啊以至我是半路弄分子生物的，初次接觸蛋白，還望各位有經(jīng)驗的蟲子指點，謝謝【答案【答案】應(yīng)助回帖蛋白濃度小到PAGE夫法檢測，還有就是你的蛋白已經(jīng)降解，條帶就會彌【答案】應(yīng)助回帖可能原因與解決蛋白質(zhì)發(fā)生了降解。處理辦法：重新提取蛋白質(zhì)，加入蛋白酶抑制劑樣品濃縮效果不好。處理辦法：樣品上樣前煮沸充分，適當(dāng)增加濃縮膠的長度;保證濃縮膠貯液的H正確(67)，適當(dāng)降低電壓。一般電按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Bufer，離心，沸水煮5in，再離心加樣。拖尾嚴(yán)重，樣品溶解解效果不佳或分離膠濃度過大引起的處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑（比如表面活性劑電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度參考例例初始懸賞金幣15 結(jié)果如圖，中間很粗的條帶，分不開。減少上樣量，有的細(xì)條帶又看不到了感謝參與，應(yīng)助指數(shù)+1:引用回帖bngat2012-11-30你2.5ul的樣品中，目的蛋白的濃度也有1mg/ml。上10ul肯定是上樣量太多了。不知道你想要了，不知道是你照...分離的是菌體表面蛋白，希望得到的條帶越多，越分散，越好。圖片是我照的虛。果，這個還是不好辦。銀染可以看到很多條帶，且效果非常明顯，，例，，例 跪求：蛋白質(zhì)電泳條帶老是跑不開去怎么o青果10本跑蛋白質(zhì)電泳面別同學(xué)用我們的溶液條帶都跑開了，但我們還是不行，膠濃度應(yīng)該沒問題，我們用的12%的分離膠，5%的濃縮膠，這個膠濃度下別同學(xué)的maker都是分散的，我們的就不行，我們用了12mA和20mA的電流，長的時候跑了近三個小時溴酚藍(lán)都跑過了還不行，難道我們的操作【答案】應(yīng)助回帖★o青果(gyesang代發(fā)金幣+1,2013-05-1013:05:041949stone:MolEPI+1,good2013-05-1016:10:56o青果:金幣+12013-05-1140%儲液體；分離膠Tris-HCl的pH值是否是8.8，一般濃度為1.5M；AP、SDS、TEMED是然后是儀器是否能提供穩(wěn)定的電流/12mA【答案】應(yīng)助回帖★o青果(myprayer代發(fā)):金幣+1,贈人玫瑰手有余香，鼓勵應(yīng)助，分子生物版塊期待你 。同樣期待你更詳細(xì)的應(yīng)助指導(dǎo)。2013-05-0908:17:00樓主你在用溴酚藍(lán)染膠的時候一定有碰到膠吧,對于12%的膠來說,韌性是很好的,你捏住一個角可以把它提起來的(甚至還可以輕輕地左右晃動).如果樓主發(fā)現(xiàn)它軟得不行好像輕輕一捏就爛掉的話問題就是在膠上面.樓主的跑膠緩沖液看上去沒問題,建議換一瓶【答案】應(yīng)助回帖★ 。myprayer:金幣+1,贈人玫瑰手有余香鼓勵應(yīng)助分子生物版塊期待你的 期待你更詳細(xì)的應(yīng)助 。如LS所說，檢查一下acrylamide濃度和緩沖液pH。跑膠時有沒有漏電【答案】應(yīng)助回帖★o青果(myprayer代發(fā)):金幣+1,鼓勵應(yīng)助，分子生物版塊期待你的 待你更詳細(xì)的應(yīng)助指導(dǎo)。2013-05-0908:17:42我覺得acrylamide濃度或者acrylamidebisacrylamide的比例有問題 o樓主你在用溴酚藍(lán)染膠的時候一定有碰到膠吧,對于12%的膠來說,韌性是很好的,你捏住一個角可以把它提起來的(甚至還可以輕輕地左右晃動).如果樓主發(fā)現(xiàn)它軟得不行好像輕輕一捏就爛掉的話問題就是在膠上面.樓主的跑...我們的丙烯酰胺是重新配的，別的同學(xué)也用過了，他們能跑開?。。』靥靥鹢青果3樓:Originallypostedbyat2013-05-09如LS所說，檢查一下acrylamide濃度和緩沖液pH。跑膠時有沒有漏電我到現(xiàn)在也不明白。再配置一次，讓你同學(xué)在旁 你【答案】應(yīng)助回帖★o青果(gyesang代發(fā)):金幣+1,2013-05-10o青果:金幣+1,★有幫助,我們好像確實是制膠的問題，移液槍沒校正可能產(chǎn)生了影響，我們用了10%的膠跑了，效果好了一點2013-05-1118:31:15【答案】應(yīng)助回帖★o青果(gyesang代發(fā)):金幣+1,2013-05-10我覺得是電壓電流的事，我們師兄跑不開的時候跑了足足6個小時才跑好的，不要著急，慢點來德國工兵鏟【答案】應(yīng)助回帖★o青果(gyesang代發(fā)):金幣+1,2013-05-10可以很負(fù)責(zé)的告訴你，你的Tris液體的pH值有問題跑膠時漏電怎么檢查，我們也用過另一臺電泳槽，效果也不【答案】應(yīng)助回帖膠的問題，分離膠的【答案】應(yīng)助回帖★o青果:金幣+12013-05-11 。。泳時間建議使用新的電泳液在電泳初始階段看看氣泡是不是均勻的從底部升起而不是那種像似的一絲絲的上來一般國內(nèi)省點錢都讓學(xué)生反復(fù)使用電泳液此外你在電泳過程中要看看電源有沒有報錯，一般我使用伯樂的mini系統(tǒng)，2塊膠200v,40-45min12%的膠(29:1),一塊膠建議使用橫流35mA,35min同上12%的膠。建議是每次電泳時候內(nèi)槽 。。希望對你有用百目【答案】應(yīng)助回帖。。SDS電泳太慢和帶彌散的改進(jìn)措建議改進(jìn)措施可以適當(dāng)進(jìn)一步地拉開濃縮膠和分離膠之間的pH值，比如濃縮膠為pH=6.6，分離膠為，可以考慮加高電泳時，濃縮膠的電壓為90-100V，分離膠的電壓到120V-200V；濃縮膠和分離膠有時候可能都設(shè)成150V也能電泳成功。，使用全新配置的緩沖溶液適當(dāng)該種膠濃度下使用分離效果明顯的Marker保持各種蛋白質(zhì)樣品和Marker在上樣前能夠充分溶解，上樣前最好離心一下，實在溶解適當(dāng)調(diào)整聚丙烯酰胺的凝膠濃度聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。樣品緩沖溶液用：Tris-HCl緩沖溶液，電泳緩沖溶液用:Tris–Gly緩沖溶液 控制好電泳時間，別把樣品跑出了膠）樣品處理（充分溶解樣品：根據(jù)樣品分離目的不同，在上樣前對樣品進(jìn)行的溶解處理主）（1）還原SDS處理：在上樣ufer中加入SDS和D(或Bta巰基乙醇)后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Bufer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。 （2SDS處理碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶;另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。100μl樣品緩沖液中10μl20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫 （3）非還SDS處理：生理體液、、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，， ，在SDS不連續(xù)電泳中，pH對整個反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的。制膠緩沖液使用緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低;而Cl離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動由于導(dǎo)電性與電場強(qiáng)度成反比這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH(>8.8)的增加，呈堿性甘氨酸大量解離泳動速率增加直接緊隨氯離子之后同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。所以，pH對整個反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的實驗中， ，聚丙烯酰胺凝膠濃度/%蛋白質(zhì)分離范圍/kd536—1014—12.514—1514—濃縮膠濃度低；分離膠濃度高于濃縮膠，一般不小于5%2KD的蛋白質(zhì)必須要用Tricine膠系統(tǒng)，上面說的改進(jìn)對于分子量低于3KD的蛋白質(zhì)的電泳沒有用，但是對于高于3KD的蛋白質(zhì)的電泳有用。以上材料的主要參考文獻(xiàn)是主編，蛋白質(zhì)純化實驗方案與應(yīng)用，化學(xué)工 ，2010，第13章（建 參考例14.SDS泳道形狀詭異10跑SDS把細(xì)胞裂解液上樣結(jié)果跑出來這么奇怪的形狀(最右邊兩個泳道) 的問題,換了好幾塊膠了上樣的時候其他的泳道都沒問題,就是只要把這個細(xì)胞裂解液加上去,對應(yīng)的泳道就肯定就跑成這鬼樣子電解緩沖液也沒問題 其他人拿我配的緩沖液跑都沒大概就是這裂解液樣品的問 請問這是不是鹽濃度太高了?還是鹽濃度太低了?我這里還有少量NP-40,不應(yīng)該影響吧？大概還會殘留一些養(yǎng)細(xì)胞用的見了鬼了，按理說我這緩沖液最多只是同東中郎【答案】應(yīng)助回帖★★★★★gyesang:金幣+2,2013-10-05fuyuandj86:金幣+42013-10-06這位同學(xué)，你的上樣量太大了的結(jié)果，可以的樣品先稀釋一下再上樣。先稀釋5倍看看吧，不行的話少上一點，上樣量蛋白太多了?！敬鸢浮繎?yīng)助回帖★★★★gyesang:金幣+3,2013-10-05fuyuandj86:金幣+22013-10-06上樣量太大，或者把裂解液過濾純化下再電泳【答案】應(yīng)助回帖★★gyesang:金幣+1,2013-10-05fuyuandj86:金幣+22013-10-06上樣量太多，多稀釋些，上樣前離心取上清【答案】應(yīng)助回帖★fuyuandj86:金幣+22013-10-06你試試離心取上清上【答案】應(yīng)助回 樣 的問題，不是跑膠的問題，建議重新做樣品再跑膠看上樣量太大，逐步兩倍的稀釋一下，跑一下就知道了凌波麗樣品處理（充分溶解樣品：根據(jù)樣品分離目的不同，在上樣前對樣品進(jìn)行的溶解處理主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。SDSbufferSDSDTTBeta巰基乙醇)后，蛋白質(zhì)構(gòu)象SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入Buffer，離心，沸水煮5min，再離帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶;另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。100μl10μl20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。非還原SDS處理：生理體液、、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未保持各種蛋白質(zhì)樣品和Marker在上樣前能夠充分溶解，上樣前最好離心一下，實在溶解減少上樣量，樓主的樣品應(yīng)該稀釋十倍后再上樣可以考慮加高電泳時，濃縮膠的電壓為90-100V，分離膠的電壓到120V-200V，；濃縮膠和分離膠有時候可能都設(shè)成150V能電泳成功。凌波麗更準(zhǔn)確的回答樓主的電泳問題是SDS電泳帶彌散、拖尾，原因和解決方法如下（我今天下午剛寫好的材料SDS電泳帶彌散和拖尾的原因和改進(jìn)措施(2013-10-原因一：上樣量過多，應(yīng)該減少上樣量。對策：加樣體積根據(jù)樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為10-15µL（即2-10µg蛋白質(zhì)。如果樣品很稀上樣量可以達(dá)到（1）Marker在上樣前能夠充分溶解，上樣前最好(2)可以根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)試劑盒的要求加入樣品溶解液；如果是自行配置標(biāo)準(zhǔn)和未知樣品，按照0.5-1.0mg/L樣品溶解液。溶解后，將其轉(zhuǎn)移至Eppendorf管，蓋上蓋子（可以在蓋子處加上卡子后在110度沸水中水浴加熱3（可以在薄塑料板上鉆出幾個與Eppendorf管直徑形同的圓洞，Eppendorf管放下去直到蓋子邊緣約束不能再往下為止，把薄塑料板的出Eppendorf管的管體大部分的那一面放入沸水浴鍋中，薄塑料板自然飄在沸水表面，便于取用和加熱，也可避免沸水濺起?？梢砸慌鷮τ诙鄠€Eppendorf管進(jìn)行不同時間的沸水浴。Eppendorf管扔進(jìn)沸水浴鍋中，蓋子可能會被沖開，而后在室溫下冷卻待用。如果較長時間不用，則將樣品放入零下20度冰箱中，需用時在取出后使用前在110度沸水中加熱3（3）改變樣品緩沖溶液使得樣品能夠充分溶解，SDS例15.哪位大神幫忙分析一下，右下角那個蛋白怎么跑成那樣了，跑了兩次了都這【答案】應(yīng)助回帖【答案】應(yīng)助回帖凌波【答案】應(yīng)助回帖樓主的電泳問題是SDS電泳帶彌散、拖尾和變寬（SDS電泳帶與鄰近蛋白質(zhì)電泳相連： 電泳帶彌散和拖尾的原因和改進(jìn)措施(2013-10-原因一：上樣量過多，應(yīng)該減少上樣量。對策：加樣體積根據(jù)樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為10-15µL（即2-10µg蛋白質(zhì)。如果樣品很稀上樣量可以達(dá)到（1）樣品應(yīng)該充分溶解：保持各種蛋白質(zhì)樣品和arker在上樣前能夠充分溶解，上樣前最好離心一下，實在溶解不掉的顆粒就去掉。(2)可以根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)試劑盒的要求加入樣品溶解液；如果是自行配置標(biāo)準(zhǔn)和未知樣品，按照0.51.0mg/L樣品溶解液。溶解后，將其轉(zhuǎn)移至Eppendorf管，蓋上蓋子（可以在蓋子處加上卡子）后在110度沸水中水浴加熱3分鐘（可以在薄塑料板上鉆出幾個與Epenorf管直徑形同的圓洞，Epenorf管放下去直到蓋子邊緣約束不能再往下為止，把薄塑料板的出Eppenof管的體大分的那面放沸水鍋中薄塑料板自然飄在沸水表面，便于取用和加熱，也可避免沸水濺起。可以一批對于多個Eppnorf管進(jìn)行不同時間的沸水浴。Eppndorf管扔進(jìn)沸水浴鍋中，蓋子可能會被沖開，而后在室溫下冷卻待用。如果較長時間不用，則將樣品放入零下20度冰箱中，需用時在取出后使用前在110度沸水中加熱3分鐘室溫冷卻后再上樣，以去掉樣品蛋白質(zhì)中的亞穩(wěn)態(tài)聚合體。（3）改變樣品緩沖溶液使得樣品能夠充分溶解，SDSSDS電泳帶變寬的原因和改進(jìn)措施(2013-10-除了以上兩條原因外，還有原因三：SDS電泳帶變寬，SDS電泳帶與鄰近蛋白質(zhì)電泳相連。除了上樣量過多和樣品溶，加會泳。加往膠之策只子時凝，宜快拔起的方向要垂直于凝膠表面；要避免凝膠兩側(cè)的玻璃板與凝膠之間產(chǎn)生裂紋，在凝膠過程中不要擠壓凝膠兩側(cè)的玻璃板。17cm★初始懸賞金5myprayer:金幣+1,鼓勵發(fā)帖積極2013-10-11圖為真菌胞內(nèi)蛋白雙向電泳圖，樣品采用TCA-，。將1克凍干菌體用液氮研磨至粉末，加入TCA-質(zhì)量體積比為10%的混合液15ml和0.07%DTT，-20℃沉淀1h,離心并用含DTT的洗滌以TCA，真空干燥以除去丙酮。重懸于裂解液(7M尿素、2M硫脲、4CHAPS、40mMDTT、1IPG緩沖液、痕量溴酚藍(lán))中，4℃14000×g高速離心20min，。pH3-10，17cmbio-rad公司說的來的，等電聚焦程序設(shè)17cm膠50V12小時（20℃）S1250V1.5S21000V線性2小時除鹽S310000V線性5S410000V60,000S5500V設(shè)置每根膠條的極限電 （50-70mA/根SDS電泳，70V，30min,200v,4h. 1樣品時，感DTT的洗滌以除去TCA時，TCA可能未除盡，另外，真空干燥以除去時，我是在超凈臺里吹EP管中的物質(zhì)，需要2-3小時，耗時較多，且怕此過程中蛋白變性請問有沒有好一點辦法？？另外一個重要問題此方法提的的蛋白總是鹽離子太多，從后面IEF可看出，不知如何解 2等點聚焦過程中，總覺得聚焦不夠充分，不知是不是鹽離子太多的原因，主動水化過程中水化液中溴酚藍(lán)從負(fù)極向正極移動，但未完全到達(dá)正極。S3結(jié)束時，電壓總是未能升到10000V，是不是應(yīng)該將5小時延長為6小時？？3用考馬斯亮藍(lán)BBG250染色時，有2次竟然沒有染出蛋白，不知BBG250染色液是不是有什么特別注意的地方，比如加試劑的先后順序等？？ 復(fù)（6塊膠）才能進(jìn)行后面的分析？？就是只跑2塊膠（CK和處理）不是不能進(jìn)行后面的實驗啊？？？圖1CBBR250剛聚焦完后的膠條 如 1.★★★★小木蟲:金幣+0.5,kx444555:金幣+4,鼓勵交流2013-10-12回帖謝謝您的回復(fù)，由于自己完全是自己摸索，我還是有幾處不明白，特來請教1.是用多洗幾次嗎？？既能除鹽，又能除TCA嗎2稍微調(diào)整兩性電解質(zhì)的用量，是裂解液中，還是水化液中的兩性電解3上樣量是350-400微克總蛋4您的意思是可以先同時6個IEF膠條都先聚焦好，再每2個跑第二向SDS嗎★★★★★★小木蟲:金幣+0.5,給個紅包，謝謝回kx444555:金幣+4,鼓勵交流2013-10-12zhangbaocau:金 -10-121.是可以除鹽，TCA是沉淀蛋白用的，離心沉淀蛋白后TCA洗是為了除去沉淀里面的TCA和鹽分，可以多做1-2我不清楚你的裂解液和水化液有什么區(qū)別。我通常的做法是直接重懸在EF水化液里，后面就直接上聚焦的看成分就知道樣品處于變性條件一般做離心前（我一般是做超速離心的，20°C）做室溫30分鐘處理樣品。不清楚你為什么要4°C下離心，水化通常都是在室溫下進(jìn)行的?？既究梢赃m當(dāng)增加一點上樣量可以是500μg-1mg總蛋白上樣體積在300μl體積多了膠條也吸收不了。上等點聚焦前室溫放置1-2h讓膠條溶脹。這個看個人喜好吧我覺得相對于第二向IEF比較容易出問題不同次跑出來的效果未必一樣。所以一般是一起做IEF。因為里有很多電泳裝置，一般是一起跑4塊膠，太 面用洗是為了除去沉淀里面的TCA和鹽分，可以多做1-2次。2寫錯了，您說的對。將1克凍干菌體用液氮研磨至粉末，