流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件

流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用41、實(shí)際上，我們想要的不是針對(duì)犯罪的法律，而是針對(duì)瘋狂的法律?！R克·吐溫42、法律的力量應(yīng)當(dāng)跟隨著公民，就像影子跟隨著身體一樣。——貝卡利亞43、法律和制度必須跟上人類思想進(jìn)步。——杰弗遜44、人類受制于法律，法律受制于情理?！小じ焕?5、法律的制定是為了保證每一個(gè)人自由發(fā)揮自己的才能，而不是為了束縛他的才能?！_伯斯庇爾流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用41、實(shí)際上，我們想要的不是針對(duì)犯罪的法律，而是針對(duì)瘋狂的法律?！R克·吐溫42、法律的力量應(yīng)當(dāng)跟隨著公民，就像影子跟隨著身體一樣?！惪ɡ麃?3、法律和制度必須跟上人類思想進(jìn)步?！芨ミd44、人類受制于法律，法律受制于情理?！小じ焕?5、法律的制定是為了保證每一個(gè)人自由發(fā)揮自己的才能，而不是為了束縛他的才能?！_伯斯庇爾流式細(xì)胞術(shù)在臨床上的應(yīng)用深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心李富榮第一部分流式細(xì)胞儀（FCM)）工作原理流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用41、實(shí)際上，我們想要的不是針對(duì)犯罪的法1流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件2流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件3流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件4流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件5流式細(xì)胞儀的構(gòu)造及原理流式細(xì)胞儀的構(gòu)造及原理6FCM測(cè)量光信號(hào)獲取與分析散射光信號(hào)●前向散射光(FSC)----細(xì)胞大小●側(cè)向散射光（SSC)---細(xì)胞粒度（膜的粒度、核大小與粒度、胞質(zhì)數(shù)量）FSC信號(hào)越大，表明細(xì)胞體積越大；反之，則越小。SSC信號(hào)越大，表明細(xì)胞粒度越大；反之，則越小。FCM測(cè)量光信號(hào)獲取與分析散射光信號(hào)7根據(jù)FSC-SSC二維點(diǎn)圖，可以容易區(qū)分Lym(R3)Gran(R1)與Mono(R2)R1R2IncidentLightSourceRightAngleLightDectectoraCellComplexityForwardLightDetectoraCellSurfaceAreaR3R2R1根據(jù)FSC-SSC二維點(diǎn)圖，可以容易的區(qū)分出Lym(R3).Gran(R1)與Mono(R2)根據(jù)FSC-SSC二維點(diǎn)圖，可以容易區(qū)分Lym(R3)Gra8流式細(xì)胞術(shù)常用染料及檢測(cè)波長(zhǎng)流式細(xì)胞術(shù)常用染料及檢測(cè)波長(zhǎng)9流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件10熒光染料的發(fā)射不同波長(zhǎng)熒光染料的發(fā)射不同波長(zhǎng)11DNA和RNA熒光探針的理化特性熒光探針分子量結(jié)合方式堿基特異性激發(fā)鋒（nm)發(fā)射鋒(nm)P1668嵌入無493630EB394嵌入無482616MI1069非嵌入G-C320,445575CA31183非嵌入GC320,445575HO33258624非嵌入AT343480HO33342615非嵌入AT343455DAPI350非嵌入AT5406507-AAD1270嵌入GC540655AO370嵌入(雙鏈）無492530靜電（單鏈）640PY303嵌入(雙鏈）GC>AT549-562565-574靜電（單鏈）DNA和RNA熒光探針的理化特性熒光探針分子量12細(xì)胞周期分析通過熒光探針對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行相對(duì)DNA含量的測(cè)定，可分析細(xì)胞周期各時(shí)期的百分比，周期動(dòng)力參數(shù)及DNA異倍體G1SG2GoM細(xì)胞周期分析通過熒光探針對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行相對(duì)DNA含量的測(cè)定，13分選系統(tǒng)（Sorting)依據(jù)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的細(xì)胞參數(shù)可分選所需細(xì)胞群體：●電荷式分選穩(wěn)定液流測(cè)量區(qū)液滴形成液滴充電液滴偏轉(zhuǎn)分選收集邏輯電路分選系統(tǒng)（Sorting)依據(jù)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的細(xì)胞參數(shù)可分選14電荷式分選電荷式分選15通道式分選穩(wěn)定液流測(cè)量區(qū)邏輯電路捕獲管分選收集通道式分選穩(wěn)定液流測(cè)量區(qū)邏輯電路捕獲管分選收集16

第二部分流式細(xì)胞術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第二部分17流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件18流式臨床應(yīng)用淋巴細(xì)胞亞群分析Th1/Th2腫瘤學(xué)HLA-B27PNH四聚體血小板活化細(xì)胞凋亡移植免疫流式臨床應(yīng)用淋巴細(xì)胞亞群分析Th1/Th2腫瘤學(xué)19流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件20流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件21流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件22流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件23流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件24常用淋巴細(xì)胞亞群報(bào)告模式R常用淋巴細(xì)胞亞群R25深圳市人民醫(yī)院流式細(xì)胞術(shù)報(bào)告單模式深圳市人民醫(yī)院流式細(xì)胞術(shù)報(bào)告單模式26流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件27流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件28流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件29流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件30流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件31流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件32流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件33流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件34流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件35流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件36流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件37流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件38HLA-B27通過CD3PEvsSSC設(shè)門，圈定CD3陽(yáng)性細(xì)胞（T淋巴細(xì)胞），檢測(cè)其B-27的平均熒光強(qiáng)度。如標(biāo)本的平均熒光強(qiáng)度小于標(biāo)準(zhǔn)微球熒光強(qiáng)度則為陰性，反之為陽(yáng)性。HLA-B27通過CD3PEvsSSC設(shè)門，圈定CD3陽(yáng)性細(xì)39流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件40

Th1/Th2細(xì)胞Th1/Th2細(xì)胞41流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件42流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件43流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件44流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件45流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件46流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件47

腫瘤學(xué)腫瘤學(xué)48流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件49流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件50流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件51流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件52流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件53流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件54流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件55流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件56流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件57流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件58流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件59流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件60

細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡61流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件62流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件63流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件64流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件65流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件66移植免疫移植免疫67流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件68流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件69流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件70流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件71流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件72四聚體四聚體73Tetramer-原理內(nèi)源性抗原外源性抗原Tetramer-原理內(nèi)源性抗原外源性抗原74Tetramer-原理MHCClassI-HLA-A2Tetramer-原理MHCClassI-HLA-A275Tetramer-原理Tetramer-原理76Tetramer-原理國(guó)外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè)2001；24(2):102-105Tetramer-原理國(guó)外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè)2001；24(277HLAClassI限定性腫瘤抗原肽HLAClassI限定性腫瘤抗原肽78抗原特異性CTL的分析方法51Cr釋放實(shí)驗(yàn)PCR法酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)擴(kuò)增特異T淋巴細(xì)胞受體Tetramer法間接法需大量的特異性CTLs作為效應(yīng)細(xì)胞需體外擴(kuò)增，周期長(zhǎng)，敏感性低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力難以廣泛應(yīng)用敏感性高但只能用于已知TCR基因型的特異性CTLs檢測(cè)直接法敏感性高不受TCR基因型的限制有限稀釋法(LDA)用Tetramer法研究表明，外周血中僅有0.2-2.5%的CD8+細(xì)胞對(duì)CMV和EBV特異抗原特異性CTL的分析方法51Cr釋放實(shí)驗(yàn)PCR法酶聯(lián)免疫斑79Tetramer法DohertyPC.Thenumbersgameforvirus-specificCD8+Tcells[J].Science,1998,280:227了解病毒特異性CTL和記憶性CTL方面的一項(xiàng)革命檢測(cè)病毒特異性CD8細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)(GoldStandard)Tetramer法DohertyPC.Thenumber80Tetramer-應(yīng)用感染性疾病HIV-AIDS,EBV,CMV,HPV,HBV,HCV,Influenza,Measles,Malaria,TBandRSVBreast,Prostate,Melanoma,Colon,Lung,Cervical,OvarianandLeukemiaDiabetes,Lymedisease,Multiplesclerosis,Rheumatoidarthritis,AutoimmunevitiligoEBVandCMV移植自身免疫性疾病腫瘤Tetramer-應(yīng)用感染性疾病HIV-AIDS,EBV,81感染性疾病Tetramer-應(yīng)用-例證含有HIV-I型病毒包膜肽等三種抗原肽：HIV特異性CTL數(shù)量與血漿中RNA病毒量有明顯的負(fù)相關(guān)，而與產(chǎn)毒性感染細(xì)胞的清除率無關(guān)慢性HCV感染患者的特異性CTLs數(shù)量明顯少于急性HCV感染和已康復(fù)患者用黑色素瘤抗原誘導(dǎo)潛在的腫瘤特異性T細(xì)胞—用Tetramer分離，富集GVHD(移植物抗宿主反應(yīng))：受體與供體的次要組織相容性抗原(mHags)的不同引起，在骨髓移植后早期出現(xiàn)(14天內(nèi))，造成骨髓移植失敗---HLA-mHags肽四聚體監(jiān)測(cè)mHags特異性CTL，以了解對(duì)GVHD的臨床治療效果HLA-A2/pp65Tetramer監(jiān)測(cè)腎移植患者感染CMV后的免疫應(yīng)答能力

移植腫瘤感染性疾病Tetramer-應(yīng)用-例證含有HIV-I型病毒包82流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件83流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件84

第三部分定量流式細(xì)胞術(shù)第三部分85

定量流式細(xì)胞術(shù)的概述定量流式細(xì)胞術(shù)指的是對(duì)待細(xì)胞的某種生物分子的絕對(duì)計(jì)量，而不是陽(yáng)性細(xì)胞的相對(duì)百分?jǐn)?shù)。原理：通過檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)微球的熒光強(qiáng)度獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線（或方程）求得待測(cè)細(xì)胞的某種生物分子的精確數(shù)值，從而反應(yīng)在某種生理、病理?xiàng)l件下待測(cè)細(xì)胞出現(xiàn)的微細(xì)變化，對(duì)臨床疾病的研究、診斷及治療等具有重要意義。定量流式細(xì)胞術(shù)的概述定量流式細(xì)胞術(shù)指的是對(duì)待細(xì)胞的某種生物86血小板表面抗原定量-PLATELETCalibratorKit血小板表面抗原定量-PLATELETCalibrator87特點(diǎn)可定量與血小板相關(guān)的任何抗原(如CD41,CD61,CD42a等)免洗間接法一抗亞型為IgG1,IgG2a或IgG2b定量范圍寬(500-90,000分子/血小板)定量準(zhǔn)確，CV值(變異系數(shù))小血小板表面抗原定量-PLATELETCalibratorKit特點(diǎn)可定量與血小板相關(guān)的任何抗原(如CD41,CD61,88標(biāo)準(zhǔn)曲線血小板表面抗原定量-PLATELETCalibratorKit標(biāo)準(zhǔn)曲線血小板表面抗原定量-PLATELETCalibr89結(jié)果血小板表面抗原定量-PLATELETCalibratorKit結(jié)果血小板表面抗原定量-PLATELETCalibrat90CD41/61復(fù)合物變形與Firbrinogen結(jié)合，為初期血栓形成的關(guān)鍵步驟PLATELETFibrinogenKitCD41/61復(fù)合物變形與Firbrinogen結(jié)合，為初期91應(yīng)用心血管疾病(不穩(wěn)定心絞痛，心肌梗塞等)監(jiān)測(cè)抗凝集治療(如RepPro,Integrelin,Plavix,Ticlid等)檢測(cè)GPIIb/IIIa(CD41/CD61)受體Fibrinogen結(jié)合能力血液體外(invitro)活化(ADP等誘導(dǎo))后，檢測(cè)Fibrinogen結(jié)合能力血小板活化狀態(tài)(exvivo)標(biāo)本處理PLATELETFibrinogenKit應(yīng)用心血管疾病(不穩(wěn)定心絞痛，心肌梗塞等)血液體外(inv92白細(xì)胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCalibratorKit白細(xì)胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCalibra93特點(diǎn)可定量與白細(xì)胞相關(guān)的任何抗原(如CD3,CD4,CD55,CD59等)單個(gè)定量(用一個(gè)單抗，如CD28抗體定量白細(xì)胞表面CD28分子數(shù))多參數(shù)定量(如用CD8設(shè)門來定量CD8+T細(xì)胞上CD28分子數(shù))全血和分離的細(xì)胞(如細(xì)胞株等)均可間接法一抗亞型為IgG1和IgG2a定量范圍寬(1000-300,000分子/白細(xì)胞)定量準(zhǔn)確，CV值(變異系數(shù))小白細(xì)胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCalibratorKit特點(diǎn)可定量與白細(xì)胞相關(guān)的任何抗原(如CD3,CD4,CD94標(biāo)準(zhǔn)曲線白細(xì)胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCalibratorKit標(biāo)準(zhǔn)曲線白細(xì)胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCal95結(jié)果白細(xì)胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCalibratorKit結(jié)果白細(xì)胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCalib96BloodDendriticCellEnumerationKitDC作用：1.樹突狀細(xì)胞（dendriticcell,DC）為一群非均一性專職抗原遞呈細(xì)胞，與MHC二類分子結(jié)合向其它免疫活性細(xì)胞傳遞抗原信息。

2.骨髓樣DC（MDC）和淋巴樣DC(PDC).在誘導(dǎo)和調(diào)控免疫應(yīng)答方式上完全不同：首先它們表達(dá)不同的抗原識(shí)別受體并對(duì)不同的抗原起作用；表達(dá)不同的細(xì)胞因子受體并對(duì)不同的細(xì)胞因子起反應(yīng)，即使受到相同的抗原刺激。骨髓樣DC（MDC）與Th1效應(yīng)相關(guān),而淋巴樣DC（PDC）與Th2效應(yīng)有聯(lián)系；

已經(jīng)應(yīng)用的領(lǐng)域包括：1）SLE病人病情和療效觀察；2）AIDS病人免疫機(jī)能分析；3）病毒性肝炎病人免疫狀況研究；4）疫苗研究。BloodDendriticCellEnumerati97特點(diǎn)簡(jiǎn)便、快捷、絕對(duì)計(jì)數(shù)DC亞群數(shù)/ml特點(diǎn)簡(jiǎn)便、DC亞群數(shù)/ml98流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件99最新技術(shù)計(jì)數(shù)血液中循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法最新技術(shù)100循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CEC)增加于CELLQUANTFF-CD146急性冠狀動(dòng)脈綜合征血小板減少性紫癜鐮刀細(xì)胞貧血敗血癥狼瘡腎病綜合征器官移植排斥手術(shù)創(chuàng)傷癌癥傳統(tǒng)方法顯微鏡檢，手工計(jì)數(shù)。費(fèi)時(shí)，費(fèi)力，無法標(biāo)準(zhǔn)化循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CEC)增加于CELLQUANTFF-CD1101新技術(shù)—新標(biāo)準(zhǔn)CELLQUANTFF-CD146免疫磁珠富集與3色流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合僅需1mL血整個(gè)過程不到1個(gè)小時(shí)靈敏度高：1mL血中可檢測(cè)出10個(gè)循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞重復(fù)性好，室間差(InterlaboratoryCV)小新技術(shù)—新標(biāo)準(zhǔn)CELLQUANTFF-CD146免疫磁珠富102方法CELLQUANTFF-CD146將包被CD146單抗的鐵磁性納米顆粒(CD146FF)與1mL血孵育富集的CD146+細(xì)胞用以下試劑染色

PI(碘化丙啶)(確定有核細(xì)胞)CD45-FITC(排除WBC(白細(xì)胞)干擾)CD146-PE單抗(識(shí)別CD146抗原的另一位點(diǎn))標(biāo)準(zhǔn)濃度微球(用于絕對(duì)計(jì)數(shù))流式分析(循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞鑒定)

有核細(xì)胞(PI+);CD45-;CD146+;前向散射角(FSC)范圍寬方法CELLQUANTFF-CD146將包被CD146單抗103CELLQUANTFF-CD146PI-CD45FITCCELLQUANTFF-CD146PI-CD45FITC104CELLQUANTFF-CD146PI-CD45FITCCELLQUANTFF-CD146PI-CD45FITC105CELLQUANTFF-CD146CELLQUANTFF-CD146106CELLQUANTFF-CD146CELLQUANTFF-CD146107CELLQUANTFF-CD146CELLQUANTFF-CD146108

第四部分

在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用第四部分109優(yōu)點(diǎn)：1.臨床醫(yī)師進(jìn)行疾病細(xì)胞免疫研究的一種好工具2.可同時(shí)進(jìn)行臨床基礎(chǔ)研究和疾病診斷、療效評(píng)價(jià)3.可與世界研究水平同步4.臨床醫(yī)師不需親自參與試驗(yàn)過程5.研究工作周期短優(yōu)點(diǎn)：110流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件11141、學(xué)問是異常珍貴的東西，從任何源泉吸收都不可恥?！⒉贰と铡しɡ?/p>

42、只有在人群中間，才能認(rèn)識(shí)自己?！聡?guó)

43、重復(fù)別人所說的話，只需要教育；而要挑戰(zhàn)別人所說的話，則需要頭腦。——瑪麗·佩蒂博恩·普爾

44、卓越的人一大優(yōu)點(diǎn)是：在不利與艱難的遭遇里百折不饒?！惗喾?/p>

45、自己的飯量自己知道。——蘇聯(lián)41、學(xué)問是異常珍貴的東西，從任何源泉吸收都不可恥?！⒉?12流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用41、實(shí)際上，我們想要的不是針對(duì)犯罪的法律，而是針對(duì)瘋狂的法律?！R克·吐溫42、法律的力量應(yīng)當(dāng)跟隨著公民，就像影子跟隨著身體一樣?！惪ɡ麃?3、法律和制度必須跟上人類思想進(jìn)步?！芨ミd44、人類受制于法律，法律受制于情理?！小じ焕?5、法律的制定是為了保證每一個(gè)人自由發(fā)揮自己的才能，而不是為了束縛他的才能。——羅伯斯庇爾流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用41、實(shí)際上，我們想要的不是針對(duì)犯罪的法律，而是針對(duì)瘋狂的法律?！R克·吐溫42、法律的力量應(yīng)當(dāng)跟隨著公民，就像影子跟隨著身體一樣?！惪ɡ麃?3、法律和制度必須跟上人類思想進(jìn)步?！芨ミd44、人類受制于法律，法律受制于情理。——托·富勒45、法律的制定是為了保證每一個(gè)人自由發(fā)揮自己的才能，而不是為了束縛他的才能?！_伯斯庇爾流式細(xì)胞術(shù)在臨床上的應(yīng)用深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心李富榮第一部分流式細(xì)胞儀（FCM)）工作原理流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用41、實(shí)際上，我們想要的不是針對(duì)犯罪的法113流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件114流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件115流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件116流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件117流式細(xì)胞儀的構(gòu)造及原理流式細(xì)胞儀的構(gòu)造及原理118FCM測(cè)量光信號(hào)獲取與分析散射光信號(hào)●前向散射光(FSC)----細(xì)胞大小●側(cè)向散射光（SSC)---細(xì)胞粒度（膜的粒度、核大小與粒度、胞質(zhì)數(shù)量）FSC信號(hào)越大，表明細(xì)胞體積越大；反之，則越小。SSC信號(hào)越大，表明細(xì)胞粒度越大；反之，則越小。FCM測(cè)量光信號(hào)獲取與分析散射光信號(hào)119根據(jù)FSC-SSC二維點(diǎn)圖，可以容易區(qū)分Lym(R3)Gran(R1)與Mono(R2)R1R2IncidentLightSourceRightAngleLightDectectoraCellComplexityForwardLightDetectoraCellSurfaceAreaR3R2R1根據(jù)FSC-SSC二維點(diǎn)圖，可以容易的區(qū)分出Lym(R3).Gran(R1)與Mono(R2)根據(jù)FSC-SSC二維點(diǎn)圖，可以容易區(qū)分Lym(R3)Gra120流式細(xì)胞術(shù)常用染料及檢測(cè)波長(zhǎng)流式細(xì)胞術(shù)常用染料及檢測(cè)波長(zhǎng)121流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件122熒光染料的發(fā)射不同波長(zhǎng)熒光染料的發(fā)射不同波長(zhǎng)123DNA和RNA熒光探針的理化特性熒光探針分子量結(jié)合方式堿基特異性激發(fā)鋒（nm)發(fā)射鋒(nm)P1668嵌入無493630EB394嵌入無482616MI1069非嵌入G-C320,445575CA31183非嵌入GC320,445575HO33258624非嵌入AT343480HO33342615非嵌入AT343455DAPI350非嵌入AT5406507-AAD1270嵌入GC540655AO370嵌入(雙鏈）無492530靜電（單鏈）640PY303嵌入(雙鏈）GC>AT549-562565-574靜電（單鏈）DNA和RNA熒光探針的理化特性熒光探針分子量124細(xì)胞周期分析通過熒光探針對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行相對(duì)DNA含量的測(cè)定，可分析細(xì)胞周期各時(shí)期的百分比，周期動(dòng)力參數(shù)及DNA異倍體G1SG2GoM細(xì)胞周期分析通過熒光探針對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行相對(duì)DNA含量的測(cè)定，125分選系統(tǒng)（Sorting)依據(jù)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的細(xì)胞參數(shù)可分選所需細(xì)胞群體：●電荷式分選穩(wěn)定液流測(cè)量區(qū)液滴形成液滴充電液滴偏轉(zhuǎn)分選收集邏輯電路分選系統(tǒng)（Sorting)依據(jù)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的細(xì)胞參數(shù)可分選126電荷式分選電荷式分選127通道式分選穩(wěn)定液流測(cè)量區(qū)邏輯電路捕獲管分選收集通道式分選穩(wěn)定液流測(cè)量區(qū)邏輯電路捕獲管分選收集128

第二部分流式細(xì)胞術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第二部分129流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件130流式臨床應(yīng)用淋巴細(xì)胞亞群分析Th1/Th2腫瘤學(xué)HLA-B27PNH四聚體血小板活化細(xì)胞凋亡移植免疫流式臨床應(yīng)用淋巴細(xì)胞亞群分析Th1/Th2腫瘤學(xué)131流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件132流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件133流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件134流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件135流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件136常用淋巴細(xì)胞亞群報(bào)告模式R常用淋巴細(xì)胞亞群R137深圳市人民醫(yī)院流式細(xì)胞術(shù)報(bào)告單模式深圳市人民醫(yī)院流式細(xì)胞術(shù)報(bào)告單模式138流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件139流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件140流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件141流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件142流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件143流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件144流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件145流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件146流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件147流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件148流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件149流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件150HLA-B27通過CD3PEvsSSC設(shè)門，圈定CD3陽(yáng)性細(xì)胞（T淋巴細(xì)胞），檢測(cè)其B-27的平均熒光強(qiáng)度。如標(biāo)本的平均熒光強(qiáng)度小于標(biāo)準(zhǔn)微球熒光強(qiáng)度則為陰性，反之為陽(yáng)性。HLA-B27通過CD3PEvsSSC設(shè)門，圈定CD3陽(yáng)性細(xì)151流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件152

Th1/Th2細(xì)胞Th1/Th2細(xì)胞153流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件154流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件155流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件156流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件157流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件158流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件159

腫瘤學(xué)腫瘤學(xué)160流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件161流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件162流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件163流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件164流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件165流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件166流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件167流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件168流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件169流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件170流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件171流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件172

細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡173流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件174流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件175流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件176流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件177流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件178移植免疫移植免疫179流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件180流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件181流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件182流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件183流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件184四聚體四聚體185Tetramer-原理內(nèi)源性抗原外源性抗原Tetramer-原理內(nèi)源性抗原外源性抗原186Tetramer-原理MHCClassI-HLA-A2Tetramer-原理MHCClassI-HLA-A2187Tetramer-原理Tetramer-原理188Tetramer-原理國(guó)外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè)2001；24(2):102-105Tetramer-原理國(guó)外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè)2001；24(2189HLAClassI限定性腫瘤抗原肽HLAClassI限定性腫瘤抗原肽190抗原特異性CTL的分析方法51Cr釋放實(shí)驗(yàn)PCR法酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)擴(kuò)增特異T淋巴細(xì)胞受體Tetramer法間接法需大量的特異性CTLs作為效應(yīng)細(xì)胞需體外擴(kuò)增，周期長(zhǎng)，敏感性低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力難以廣泛應(yīng)用敏感性高但只能用于已知TCR基因型的特異性CTLs檢測(cè)直接法敏感性高不受TCR基因型的限制有限稀釋法(LDA)用Tetramer法研究表明，外周血中僅有0.2-2.5%的CD8+細(xì)胞對(duì)CMV和EBV特異抗原特異性CTL的分析方法51Cr釋放實(shí)驗(yàn)PCR法酶聯(lián)免疫斑191Tetramer法DohertyPC.Thenumbersgameforvirus-specificCD8+Tcells[J].Science,1998,280:227了解病毒特異性CTL和記憶性CTL方面的一項(xiàng)革命檢測(cè)病毒特異性CD8細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)(GoldStandard)Tetramer法DohertyPC.Thenumber192Tetramer-應(yīng)用感染性疾病HIV-AIDS,EBV,CMV,HPV,HBV,HCV,Influenza,Measles,Malaria,TBandRSVBreast,Prostate,Melanoma,Colon,Lung,Cervical,OvarianandLeukemiaDiabetes,Lymedisease,Multiplesclerosis,Rheumatoidarthritis,AutoimmunevitiligoEBVandCMV移植自身免疫性疾病腫瘤Tetramer-應(yīng)用感染性疾病HIV-AIDS,EBV,193感染性疾病Tetramer-應(yīng)用-例證含有HIV-I型病毒包膜肽等三種抗原肽：HIV特異性CTL數(shù)量與血漿中RNA病毒量有明顯的負(fù)相關(guān)，而與產(chǎn)毒性感染細(xì)胞的清除率無關(guān)慢性HCV感染患者的特異性CTLs數(shù)量明顯少于急性HCV感染和已康復(fù)患者用黑色素瘤抗原誘導(dǎo)潛在的腫瘤特異性T細(xì)胞—用Tetramer分離，富集GVHD(移植物抗宿主反應(yīng))：受體與供體的次要組織相容性抗原(mHags)的不同引起，在骨髓移植后早期出現(xiàn)(14天內(nèi))，造成骨髓移植失敗---HLA-mHags肽四聚體監(jiān)測(cè)mHags特異性CTL，以了解對(duì)GVHD的臨床治療效果HLA-A2/pp65Tetramer監(jiān)測(cè)腎移植患者感染CMV后的免疫應(yīng)答能力

移植腫瘤感染性疾病Tetramer-應(yīng)用-例證含有HIV-I型病毒包194流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件195流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用課件196

第三部分定量流式細(xì)胞術(shù)第三部分197

定量流式細(xì)胞術(shù)的概述定量流式細(xì)胞術(shù)指的是對(duì)待細(xì)胞的某種生物分子的絕對(duì)計(jì)量，而不是陽(yáng)性細(xì)胞的相對(duì)百分?jǐn)?shù)。原理：通過檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)微球的熒光強(qiáng)度獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線（或方程）求得待測(cè)細(xì)胞的某種生物分子的精確數(shù)值，從而反應(yīng)在某種生理、病理?xiàng)l件下待測(cè)細(xì)胞出現(xiàn)的微細(xì)變化，對(duì)臨床疾病的研究、診斷及治療等具有重要意義。定量流式細(xì)胞術(shù)的概述定量流式細(xì)胞術(shù)指的是對(duì)待細(xì)胞的某種生物198血小板表面抗原定量-PLATELETCalibratorKit血小板表面抗原定量-PLATELETCalibrator199特點(diǎn)可定量與血小板相關(guān)的任何抗原(如CD41,CD61,CD42a等)免洗間接法一抗亞型為IgG1,IgG2a或IgG2b定量范圍寬(500-90,000分子/血小板)定量準(zhǔn)確，CV值(變異系數(shù))小血小板表面抗原定量-PLATELETCalibratorKit特點(diǎn)可定量與血小板相關(guān)的任何抗原(如CD41,CD61,200標(biāo)準(zhǔn)曲線血小板表面抗原定量-PLATELETCalibratorKit標(biāo)準(zhǔn)曲線血小板表面抗原定量-PLATELETCalibr201結(jié)果血小板表面抗原定量-PLATELETCalibratorKit結(jié)果血小板表面抗原定量-PLATELETCalibrat202CD41/61復(fù)合物變形與Firbrinogen結(jié)合，為初期血栓形成的關(guān)鍵步驟PLATELETFibrinogenKitCD41/61復(fù)合物變形與Firbrinogen結(jié)合，為初期203應(yīng)用心血管疾病(不穩(wěn)定心絞痛，心肌梗塞等)監(jiān)測(cè)抗凝集治療(如RepPro,Integrelin,Plavix,Ticlid等)檢測(cè)GPIIb/IIIa(CD41/CD61)受體Fibrinogen結(jié)合能力血液體外(invitro)活化(ADP等誘導(dǎo))后，檢測(cè)Fibrinogen結(jié)合能力血小板活化狀態(tài)(exvivo)標(biāo)本處理PLATELETFibrinogenKit應(yīng)用心血管疾病(不穩(wěn)定心絞痛，心肌梗塞等)血液體外(inv204白細(xì)胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCalibratorKit白細(xì)胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCalibra205特點(diǎn)可定量與白細(xì)胞相關(guān)的任何抗原(如CD3,CD4,CD55,CD59等)單個(gè)定量(用一個(gè)單抗，如CD28抗體定量白細(xì)胞表面CD28分子數(shù))多參數(shù)定量(如用CD8設(shè)門來定量CD8+T細(xì)胞上CD28分子數(shù))全血和分離的細(xì)胞(如細(xì)胞株等)均可間接法一抗亞型為IgG1和IgG2a定量范圍寬(1000-300,000分子/白細(xì)胞)定量準(zhǔn)確，CV值(變異系數(shù))小白細(xì)胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCalibratorKit特點(diǎn)可定量與白細(xì)胞相關(guān)的任何抗原(如CD3,CD4,CD206標(biāo)準(zhǔn)曲線白細(xì)胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCalibratorKit標(biāo)準(zhǔn)曲線白細(xì)胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCal207結(jié)果白細(xì)胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCalibratorKit結(jié)果白細(xì)胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCalib208BloodDendriticCellEnumerationKitDC作用：1.樹突狀細(xì)胞（dendritic