PCR技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用課件

第五節(jié)PCR技術(shù)的擴(kuò)展和應(yīng)用

多重PCR(MultiplexPCR)InversePCRNestedPCRAnchoredPCR

不對稱PCR技術(shù)

Tail-PCR第五節(jié)PCR技術(shù)的擴(kuò)展和應(yīng)用多重PCR(Multi

多重PCR(multiplexPCR)1.原理

在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對特異性引物,針對多個(gè)DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個(gè)目的片段的PCR技術(shù)。這一概念由Chamberian等于1988年提出。

優(yōu)點(diǎn)：多重PCR同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因,可節(jié)省時(shí)間、降低成本、提高效率,特別是節(jié)省珍貴的實(shí)驗(yàn)樣品。

多重PCR(multiplexPCR)1.原理在一個(gè)2.應(yīng)用

2.1醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用

如病原微生物的檢測與鑒別，可同時(shí)進(jìn)行多種病原微生物的鑒定。

2.2植物學(xué)研究

在植物分子育種、基因表達(dá)研究、種質(zhì)純度鑒定、病蟲害檢測等方面,多重PCR也得到重視。

2.應(yīng)用2.1醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用如病原微生物的檢測與鑒別

2.3海洋生物學(xué)研究

海洋浮游生物數(shù)量龐大，種類繁多，而且幼體時(shí)期外形相似。研究發(fā)現(xiàn)，不同種類浮游生物細(xì)胞色素氧化酶I的DNA差異明顯，據(jù)此，研究者可通過設(shè)計(jì)特異性引物，采用多重PCR方法進(jìn)行分類鑒定。

2.3海洋生物學(xué)研究海洋浮游生物數(shù)量龐大，種類繁多，而3.多重PCR的技術(shù)要素

一個(gè)理想的多重PCR反應(yīng)體系，并非單一PCR的簡單混合，需要針對目標(biāo)產(chǎn)物，進(jìn)行全面分析、反復(fù)試驗(yàn)，建立適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。多重PCR的技術(shù)要素主要包括目的片段選擇、引物設(shè)計(jì)、復(fù)性溫度和時(shí)間、延伸溫度和時(shí)間、各反應(yīng)成分的用量等。多重PCR的目標(biāo)是多個(gè)目的片段的擴(kuò)增，因此目的片段的選擇是核心。

3.多重PCR的技術(shù)要素一個(gè)理想的多重PCR反應(yīng)體系，并目的片段必須具有高度特異性，

各個(gè)目的片段之間需具有明顯的長度差異，以利于鑒別。

各個(gè)引物必須高度特異，避免非特異性擴(kuò)增;不同引物對之間互補(bǔ)的堿基不能太多，否則引物之間相互纏繞，嚴(yán)重影響反應(yīng)結(jié)果。

復(fù)性溫度與時(shí)間取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有目的片段的長度。

目的片段必須具有高度特異性，各個(gè)目的片段之間需具有明顯的長多重PCR反應(yīng)中，在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度以確保PCR反應(yīng)的特異性。

復(fù)性時(shí)間略微延長，以使引物與模板之間完全結(jié)合。

延伸反應(yīng)的時(shí)間不宜過長，否則會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。

反應(yīng)體系中適當(dāng)增大模板DNA、引物、聚合酶、dNTP的用量，調(diào)整緩沖液組分，以獲得最佳擴(kuò)增效果。

多重PCR反應(yīng)中，在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度

反向PCR（InversePCR,IPCR）

擴(kuò)增位于靶DNA區(qū)段之外的兩側(cè)未知的DNA序列

反向PCR（InversePCR,IPCR）擴(kuò)增位于此方法在分子生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，可以用于檢測病毒、轉(zhuǎn)座子等在基因組中的整合位點(diǎn)，克隆基因的鄰接序列以及建立基因組步移文庫等。

IPCR技術(shù)一般只能獲得2.0kb以內(nèi)的片段。

DNA的酶解程度、自連接效率以及引物在基因組中的相對專一性是IPCR成功的關(guān)鍵:(1)如果DNA酶切不完全，可能因片段過長而導(dǎo)致無法擴(kuò)增或擴(kuò)增得到多個(gè)產(chǎn)物帶。實(shí)驗(yàn)中使用過量限制性內(nèi)切酶、大酶切體積和長時(shí)間處理非常必要。

此方法在分子生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，可以用于檢測病毒、轉(zhuǎn)座子等(2)在酶解片段的自連接反應(yīng)中，如果DNA濃度過高或反應(yīng)體積過小，則可能導(dǎo)致生成串聯(lián)多聚體。(3)普通IPCR反應(yīng)使用的引物一般長20nt，退火溫度相對較低，在以總基因組DNA的酶解自連物為模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，很可能發(fā)生非特異匹配，導(dǎo)致非目標(biāo)產(chǎn)物的生成?？梢允褂幂^長的兩個(gè)特異引物(25nt～30nt)，退火溫度高，可最大程度地減少由引物非特異匹配引起的假陽性片段擴(kuò)增。

(2)在酶解片段的自連接反應(yīng)中，如果DNA濃度過高或反應(yīng)體

巢式PCR（NestedPCR）

利用兩對以上的引物擴(kuò)增出不同長度片斷的技術(shù)。

第一對引物：外部長片斷擴(kuò)增引物；

第二對引物：內(nèi)部短片斷擴(kuò)增引物。

巢式PCR是為了從一個(gè)DNA模板的同一區(qū)域擴(kuò)增出不同長度片斷即外部長片段和內(nèi)部短片段而設(shè)計(jì)的特殊方法，前者的引物稱外長引物，后者的引物稱內(nèi)部引物，特異地稱為巢式引物，由它擴(kuò)增出的片段也稱套組片段。兩類產(chǎn)物（外長和套組片段）的Tm值是不同的，因此在外引物和套組引物與各自靶位點(diǎn)融合的溫度不同。

巢式PCR（NestedPCR）利用兩對以上的引物在設(shè)計(jì)引物時(shí)，必須使外引物的GC%含量高于內(nèi)引物，因而在一個(gè)含有不同引物的反應(yīng)管中，早期的PCR循環(huán)中，長引物在較高的溫度下與模板特異結(jié)合，此時(shí)內(nèi)因物是被排斥的，因此擴(kuò)增產(chǎn)物是外長片段，在后期PCR循環(huán)時(shí)，由于融合溫度改變到只適于套組引物，外引物是被排斥的，因此，此時(shí)的擴(kuò)增產(chǎn)物是套組片段。因此，巢式PCR的關(guān)鍵是引物設(shè)計(jì)，可以在外引物5ˊ端增加多個(gè)GC鉗子（GC-clamp）達(dá)到擴(kuò)增片斷的目的。

在設(shè)計(jì)引物時(shí)，必須使外引物的GC%含量高于內(nèi)引物，因而在一個(gè)

第一次循環(huán)時(shí)，外引物的融合溫度只能比沒有GC-clamp的引物稍高一點(diǎn)，在起始循環(huán)后，由于GC-clamp已導(dǎo)入初級產(chǎn)物，因此以后的融合溫度可以提高。

由于采用了兩種不同退火溫度的引物，所以巢式PCR的程序與普通PCR不同，整個(gè)程序中某個(gè)階段一些引物工作，另一些引物

“休閑”，在另一階段，“休閑”的引物開始工作。

第一次循環(huán)時(shí)，外引物的融合溫度只能比沒有GC-clamp的巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR的特異性。

另外，如果大片斷擴(kuò)增錯(cuò)誤，則小片斷錯(cuò)誤擴(kuò)增的概率很大。

巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并

錨定PCR（AnchoredPCR）

以基因組總DNA為起始材料,用于克隆某一已知片段的側(cè)翼序列,如分離某一基因的調(diào)控序列,分析T-DNA或轉(zhuǎn)座子插入突變體等。

錨定PCR方法

主要由以下3個(gè)步驟組成:(ⅰ)以基因組總DNA為模板,用一條基因特異性引物(GSP1)進(jìn)行線性PCR擴(kuò)增,產(chǎn)生單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物;(ⅱ)在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下,在單鏈DNA分子的3′末端加上多聚胞嘧啶;(ⅲ)用巢式基因特異性引物(GSP2)和與多聚胞嘧啶配對的錨定引物(AAP)對加尾的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物連入載體后進(jìn)行測序鑒定。

錨定PCR（AnchoredPCR）以基因組總DNADNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶

3′CC…CC

5′

CC…CC錨定引物

3′CC…CC

5'

GG…GG

首先合成第一鏈DNA，然后再添加一同聚物尾（polydC)，與同聚物尾配對的3′錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點(diǎn)polydG)一起作PCR擴(kuò)增

5′

DNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3′CC…CC5′CC…CC

不對稱PCR用來序列的單鏈DNA不對稱PCR用來序列的單鏈DNA

熱不對稱交錯(cuò)PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR,簡稱TAIL－PCR)是一種用來分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)由Liu和Whitter首先研究并報(bào)道。在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中，利用該技術(shù)分離出的DNA序列可以用于圖位克隆、遺傳圖譜繪制的探針，也可以直接測序。

熱不對稱交錯(cuò)PCR(ThermalasymmetricTAIL－PCR技術(shù)原理：

由一個(gè)特異性引物和一個(gè)簡并引物組合構(gòu)成的PCR反應(yīng)叫做“半特異性PCR。這種反應(yīng)會產(chǎn)生3種不同類型的產(chǎn)物:(1)由特異性引物和簡并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物;(2)由同一特異性引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物;(3)由同一簡并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物。

在TAIL－PCR反應(yīng)中,后兩種非目標(biāo)產(chǎn)物可以通過以嵌套的特異性引物進(jìn)行的后續(xù)反應(yīng)來消除。

TAIL－PCR技術(shù)原理：由一個(gè)特異性引物和一個(gè)簡并引物TAIL-PCR技術(shù)的基本原理是利用目標(biāo)序列

旁的已知序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物(specialprime,簡稱sp1，sp2，sp3，約20bp),用它們分別和1個(gè)具有低Tm值的短的(14bp)隨機(jī)簡并引物(Arbitrarydegenerateprime簡稱AD)相組合,以基因組DNA作為模板,根據(jù)引物的長短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對稱的溫度循環(huán),通過分級反應(yīng)來擴(kuò)增特異引物

TAIL-PCR技術(shù)的基本原理是利用目標(biāo)序列旁的已知序列PCR技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用課件PCR技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用課件TAIL－PCR一般分為3次反應(yīng)

，第1次PCR反應(yīng)由5次高特異性反應(yīng)、1次低特異性反應(yīng)、10次較低特異性反應(yīng)和12次熱不對稱的超級循環(huán)構(gòu)成。通過5次高特異性的反應(yīng)，使sp1與已知的序列(載體或T-DNA等)退火并延伸,提高目標(biāo)序列的濃度。1次低特異性的反應(yīng)使簡并引物結(jié)合到較多的目標(biāo)序列上，10次較低特異性的反應(yīng)使兩種引物均能與模板退火,隨后進(jìn)行12次TAIL循環(huán)(即高特異性和低特異性循環(huán)交替)。經(jīng)過上述反應(yīng)得到了不同濃度的3種類型的產(chǎn)物：特異性產(chǎn)物(Ⅰ型)和非特異性產(chǎn)物(Ⅱ型和Ⅲ型)。

TAIL－PCR一般分為3次反應(yīng)，第1次PCR反應(yīng)第2次反應(yīng)則將第一級反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋一定

倍數(shù)后作為模板，通過10次熱不對稱的超級循環(huán)，使特異性的產(chǎn)物被選擇性地?cái)U(kuò)增，而非特異性的產(chǎn)物被壓制到極低的含量。第3次反應(yīng)又將第2次反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋一定倍數(shù)后作為模板，一般設(shè)置為普通的PCR反應(yīng)或熱不對稱的超級循環(huán)。通過上述3次PCR反應(yīng)可獲得與已知序列鄰近的目標(biāo)序列。

第2次反應(yīng)則將第一級反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋一定倍數(shù)后作為模板，通過反應(yīng)

循環(huán)數(shù)

溫度

時(shí)間(s)溫度

時(shí)間

(s)

溫度

時(shí)間

(s)

第一輪19360956059430636072150

19430*7215010943044607215012943063607215094306360721509430446072150172300第二輪109430636072150943063607215094306360721509430446072150172300*:25℃

保持180s后以0.3℃/s升溫至72℃

反應(yīng)循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間(s)溫度時(shí)間反應(yīng)

循環(huán)數(shù)

溫度

時(shí)間(s)溫度

時(shí)間

(s)

溫度

時(shí)間

(s)

第三輪20943063607215094306360721509430446072150172600反應(yīng)循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間(s)溫度時(shí)間

TAIL-PCR的引物設(shè)計(jì)

根據(jù)載體的已知序列設(shè)計(jì)3個(gè)與其邊界距離不等的嵌套的特異性引物，特異性引物的長度約20bp，

Tm一般為58～68℃。

按照物種普遍存在的蛋白質(zhì)的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)一系列簡并引物，簡并引物相對較短，長度為14bp,Tm為30～48℃。

TAIL-PCR的引物設(shè)計(jì)根據(jù)載體的已知序列設(shè)計(jì)3個(gè)與在TAIL-PCR反應(yīng)中，高特異性循環(huán)的退火溫度設(shè)為65℃左右，較低特異性循環(huán)的退火溫度設(shè)為44℃，低特異性循環(huán)的退火溫度設(shè)為25～30℃。反應(yīng)體系中，特異性引物的濃度與普通的PCR相同，簡并引物的濃度要高,一般為2.5～5.0μmol/L，以滿足引物的結(jié)合效率。

在TAIL-PCR反應(yīng)中，高特異性循環(huán)的退火溫度設(shè)為65TAIL-PCR產(chǎn)物分析

多數(shù)情況下，第1次反應(yīng)有較多的非特異性產(chǎn)物由sp1和AD為引物擴(kuò)增出的特異性片段在第1次反應(yīng)中由于量少而不一定能顯現(xiàn)出來。當(dāng)用sp2替代sp1進(jìn)行第2次反應(yīng)后，一些非特異性條帶消失，特異性的產(chǎn)物被選擇性地?cái)U(kuò)增而顯現(xiàn)。欲增加產(chǎn)物的特異性，可以再把第3次反應(yīng)設(shè)置為TAIL循環(huán)。由于特異性引物在第1次反應(yīng)中一般不能擴(kuò)增到可被檢測的水平，因此可以省去第1次反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析，僅僅檢測第2次和第3次反應(yīng)的產(chǎn)物來獲得特異性的目標(biāo)片段。

TAIL-PCR產(chǎn)物分析多數(shù)情況下，第1次反應(yīng)有較多的非取第2次反應(yīng)產(chǎn)物和第3次反應(yīng)產(chǎn)物成對點(diǎn)樣。由于特異引物是嵌套的，因此特異性擴(kuò)增的特點(diǎn)是第3次反應(yīng)產(chǎn)物小于第2次反應(yīng)產(chǎn)物。不同的AD引物的擴(kuò)增效率不同。有效的TAIL-PCR擴(kuò)增出的目標(biāo)片段的大小應(yīng)該在250bp～2kb。由于AD引物在特異性引物的下游有多個(gè)退火位點(diǎn)，同一目標(biāo)序列有時(shí)會產(chǎn)生一個(gè)以上不同長度的特異性片段。

取第2次反應(yīng)產(chǎn)物和第3次反應(yīng)產(chǎn)物成對點(diǎn)樣。由于特異引物是第五節(jié)PCR技術(shù)的擴(kuò)展和應(yīng)用

多重PCR(MultiplexPCR)InversePCRNestedPCRAnchoredPCR

不對稱PCR技術(shù)

Tail-PCR第五節(jié)PCR技術(shù)的擴(kuò)展和應(yīng)用多重PCR(Multi

多重PCR(multiplexPCR)1.原理

在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對特異性引物,針對多個(gè)DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個(gè)目的片段的PCR技術(shù)。這一概念由Chamberian等于1988年提出。

優(yōu)點(diǎn)：多重PCR同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因,可節(jié)省時(shí)間、降低成本、提高效率,特別是節(jié)省珍貴的實(shí)驗(yàn)樣品。

多重PCR(multiplexPCR)1.原理在一個(gè)2.應(yīng)用

2.1醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用

如病原微生物的檢測與鑒別，可同時(shí)進(jìn)行多種病原微生物的鑒定。

2.2植物學(xué)研究

在植物分子育種、基因表達(dá)研究、種質(zhì)純度鑒定、病蟲害檢測等方面,多重PCR也得到重視。

2.應(yīng)用2.1醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用如病原微生物的檢測與鑒別

2.3海洋生物學(xué)研究

海洋浮游生物數(shù)量龐大，種類繁多，而且幼體時(shí)期外形相似。研究發(fā)現(xiàn)，不同種類浮游生物細(xì)胞色素氧化酶I的DNA差異明顯，據(jù)此，研究者可通過設(shè)計(jì)特異性引物，采用多重PCR方法進(jìn)行分類鑒定。

2.3海洋生物學(xué)研究海洋浮游生物數(shù)量龐大，種類繁多，而3.多重PCR的技術(shù)要素

一個(gè)理想的多重PCR反應(yīng)體系，并非單一PCR的簡單混合，需要針對目標(biāo)產(chǎn)物，進(jìn)行全面分析、反復(fù)試驗(yàn)，建立適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。多重PCR的技術(shù)要素主要包括目的片段選擇、引物設(shè)計(jì)、復(fù)性溫度和時(shí)間、延伸溫度和時(shí)間、各反應(yīng)成分的用量等。多重PCR的目標(biāo)是多個(gè)目的片段的擴(kuò)增，因此目的片段的選擇是核心。

3.多重PCR的技術(shù)要素一個(gè)理想的多重PCR反應(yīng)體系，并目的片段必須具有高度特異性，

各個(gè)目的片段之間需具有明顯的長度差異，以利于鑒別。

各個(gè)引物必須高度特異，避免非特異性擴(kuò)增;不同引物對之間互補(bǔ)的堿基不能太多，否則引物之間相互纏繞，嚴(yán)重影響反應(yīng)結(jié)果。

復(fù)性溫度與時(shí)間取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有目的片段的長度。

目的片段必須具有高度特異性，各個(gè)目的片段之間需具有明顯的長多重PCR反應(yīng)中，在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度以確保PCR反應(yīng)的特異性。

復(fù)性時(shí)間略微延長，以使引物與模板之間完全結(jié)合。

延伸反應(yīng)的時(shí)間不宜過長，否則會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。

反應(yīng)體系中適當(dāng)增大模板DNA、引物、聚合酶、dNTP的用量，調(diào)整緩沖液組分，以獲得最佳擴(kuò)增效果。

多重PCR反應(yīng)中，在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度

反向PCR（InversePCR,IPCR）

擴(kuò)增位于靶DNA區(qū)段之外的兩側(cè)未知的DNA序列

反向PCR（InversePCR,IPCR）擴(kuò)增位于此方法在分子生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，可以用于檢測病毒、轉(zhuǎn)座子等在基因組中的整合位點(diǎn)，克隆基因的鄰接序列以及建立基因組步移文庫等。

IPCR技術(shù)一般只能獲得2.0kb以內(nèi)的片段。

DNA的酶解程度、自連接效率以及引物在基因組中的相對專一性是IPCR成功的關(guān)鍵:(1)如果DNA酶切不完全，可能因片段過長而導(dǎo)致無法擴(kuò)增或擴(kuò)增得到多個(gè)產(chǎn)物帶。實(shí)驗(yàn)中使用過量限制性內(nèi)切酶、大酶切體積和長時(shí)間處理非常必要。

此方法在分子生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，可以用于檢測病毒、轉(zhuǎn)座子等(2)在酶解片段的自連接反應(yīng)中，如果DNA濃度過高或反應(yīng)體積過小，則可能導(dǎo)致生成串聯(lián)多聚體。(3)普通IPCR反應(yīng)使用的引物一般長20nt，退火溫度相對較低，在以總基因組DNA的酶解自連物為模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，很可能發(fā)生非特異匹配，導(dǎo)致非目標(biāo)產(chǎn)物的生成。可以使用較長的兩個(gè)特異引物(25nt～30nt)，退火溫度高，可最大程度地減少由引物非特異匹配引起的假陽性片段擴(kuò)增。

(2)在酶解片段的自連接反應(yīng)中，如果DNA濃度過高或反應(yīng)體

巢式PCR（NestedPCR）

利用兩對以上的引物擴(kuò)增出不同長度片斷的技術(shù)。

第一對引物：外部長片斷擴(kuò)增引物；

第二對引物：內(nèi)部短片斷擴(kuò)增引物。

巢式PCR是為了從一個(gè)DNA模板的同一區(qū)域擴(kuò)增出不同長度片斷即外部長片段和內(nèi)部短片段而設(shè)計(jì)的特殊方法，前者的引物稱外長引物，后者的引物稱內(nèi)部引物，特異地稱為巢式引物，由它擴(kuò)增出的片段也稱套組片段。兩類產(chǎn)物（外長和套組片段）的Tm值是不同的，因此在外引物和套組引物與各自靶位點(diǎn)融合的溫度不同。

巢式PCR（NestedPCR）利用兩對以上的引物在設(shè)計(jì)引物時(shí)，必須使外引物的GC%含量高于內(nèi)引物，因而在一個(gè)含有不同引物的反應(yīng)管中，早期的PCR循環(huán)中，長引物在較高的溫度下與模板特異結(jié)合，此時(shí)內(nèi)因物是被排斥的，因此擴(kuò)增產(chǎn)物是外長片段，在后期PCR循環(huán)時(shí)，由于融合溫度改變到只適于套組引物，外引物是被排斥的，因此，此時(shí)的擴(kuò)增產(chǎn)物是套組片段。因此，巢式PCR的關(guān)鍵是引物設(shè)計(jì)，可以在外引物5ˊ端增加多個(gè)GC鉗子（GC-clamp）達(dá)到擴(kuò)增片斷的目的。

在設(shè)計(jì)引物時(shí)，必須使外引物的GC%含量高于內(nèi)引物，因而在一個(gè)

第一次循環(huán)時(shí)，外引物的融合溫度只能比沒有GC-clamp的引物稍高一點(diǎn)，在起始循環(huán)后，由于GC-clamp已導(dǎo)入初級產(chǎn)物，因此以后的融合溫度可以提高。

由于采用了兩種不同退火溫度的引物，所以巢式PCR的程序與普通PCR不同，整個(gè)程序中某個(gè)階段一些引物工作，另一些引物

“休閑”，在另一階段，“休閑”的引物開始工作。

第一次循環(huán)時(shí)，外引物的融合溫度只能比沒有GC-clamp的巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR的特異性。

另外，如果大片斷擴(kuò)增錯(cuò)誤，則小片斷錯(cuò)誤擴(kuò)增的概率很大。

巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并

錨定PCR（AnchoredPCR）

以基因組總DNA為起始材料,用于克隆某一已知片段的側(cè)翼序列,如分離某一基因的調(diào)控序列,分析T-DNA或轉(zhuǎn)座子插入突變體等。

錨定PCR方法

主要由以下3個(gè)步驟組成:(ⅰ)以基因組總DNA為模板,用一條基因特異性引物(GSP1)進(jìn)行線性PCR擴(kuò)增,產(chǎn)生單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物;(ⅱ)在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下,在單鏈DNA分子的3′末端加上多聚胞嘧啶;(ⅲ)用巢式基因特異性引物(GSP2)和與多聚胞嘧啶配對的錨定引物(AAP)對加尾的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物連入載體后進(jìn)行測序鑒定。

錨定PCR（AnchoredPCR）以基因組總DNADNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶

3′CC…CC

5′

CC…CC錨定引物

3′CC…CC

5'

GG…GG

首先合成第一鏈DNA，然后再添加一同聚物尾（polydC)，與同聚物尾配對的3′錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點(diǎn)polydG)一起作PCR擴(kuò)增

5′

DNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3′CC…CC5′CC…CC

不對稱PCR用來序列的單鏈DNA不對稱PCR用來序列的單鏈DNA

熱不對稱交錯(cuò)PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR,簡稱TAIL－PCR)是一種用來分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)由Liu和Whitter首先研究并報(bào)道。在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中，利用該技術(shù)分離出的DNA序列可以用于圖位克隆、遺傳圖譜繪制的探針，也可以直接測序。

熱不對稱交錯(cuò)PCR(ThermalasymmetricTAIL－PCR技術(shù)原理：

由一個(gè)特異性引物和一個(gè)簡并引物組合構(gòu)成的PCR反應(yīng)叫做“半特異性PCR。這種反應(yīng)會產(chǎn)生3種不同類型的產(chǎn)物:(1)由特異性引物和簡并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物;(2)由同一特異性引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物;(3)由同一簡并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物。

在TAIL－PCR反應(yīng)中,后兩種非目標(biāo)產(chǎn)物可以通過以嵌套的特異性引物進(jìn)行的后續(xù)反應(yīng)來消除。

TAIL－PCR技術(shù)原理：由一個(gè)特異性引物和一個(gè)簡并引物TAIL-PCR技術(shù)的基本原理是利用目標(biāo)序列

旁的已知序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物(specialprime,簡稱sp1，sp2，sp3，約20bp),用它們分別和1個(gè)具有低Tm值的短的(14bp)隨機(jī)簡并引物(Arbitrarydegenerateprime簡稱AD)相組合,以基因組DNA作為模板,根據(jù)引物的長短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對稱的溫度循環(huán),通過分級反應(yīng)來擴(kuò)增特異引物

TAIL-PCR技術(shù)的基本原理是利用目標(biāo)序列旁的已知序列PCR技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用課件PCR技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用課件TAIL－PCR一般分為3次反應(yīng)

，第1次PCR反應(yīng)由5次高特異性反應(yīng)、1次低特異性反應(yīng)、10次較低特異性反應(yīng)和12次熱不對稱的超級循環(huán)構(gòu)成。通過5次高特異性的反應(yīng)，使sp1與已知的序列(載體或T-DNA等)退火并延伸,提高目標(biāo)序列的濃度。1次低特異性的反應(yīng)使簡并引物結(jié)合到較多的目標(biāo)序列上，10次較低特異性的反應(yīng)使兩種引物均能與模板退火,隨后進(jìn)行12次TAIL循環(huán)(即高特異性和低特異性循環(huán)交替)。經(jīng)過上述反應(yīng)得到了不同濃度的3種類型的產(chǎn)物：特異性產(chǎn)物(Ⅰ型)和非特異性產(chǎn)物(Ⅱ型和Ⅲ型)。

TAIL－PCR一般分為3次反應(yīng)，第1次PCR反應(yīng)第2次反應(yīng)則將第一級反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋一定

倍數(shù)后作為模板，通過10次熱不對稱的超級循環(huán)，使特異性的產(chǎn)物被選擇性地?cái)U(kuò)增，而非特異性的產(chǎn)物被壓制到極低的含量。第3次反應(yīng)又將第2次反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋一定倍數(shù)后作為模板，一般設(shè)置為普通的PCR反應(yīng)或熱不對稱的超級循環(huán)。通過上述3次PCR反應(yīng)可獲得與已知序列鄰近的目標(biāo)序列。

第2次反應(yīng)則將第一級反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋一定倍數(shù)后作為模板，通過反應(yīng)

循環(huán)數(shù)

溫度

時(shí)間(s)溫度

時(shí)間

(s)

溫度

時(shí)間

(s)

第一輪19360956059430636072150

19430*7215010943044607215012943063607215094306360721509430446072150172300第二輪1094306360721509430636072150943063607215094304460721501