新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究課件

新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究

新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究1目的:闡明新藥在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的過程和特點(diǎn)。ADME新藥研發(fā)的重要環(huán)節(jié)，要求研究?jī)?nèi)容與藥物的分類有關(guān)。目的:闡明新藥在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的過程和特點(diǎn)。2《藥品注冊(cè)管理辦法》（局令第28號(hào)）中藥、天然藥物注冊(cè)28.動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)資料及文獻(xiàn)資料化學(xué)藥品注冊(cè)22.復(fù)方制劑中多種成份藥效、毒性、藥代動(dòng)力學(xué)相互影響的試驗(yàn)資料及文獻(xiàn)資料27.非臨床藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)資料及文獻(xiàn)資料21.動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)資料及文獻(xiàn)資料

27.復(fù)方制劑中多種組份藥效、毒性、藥代動(dòng)力學(xué)相互影響的試驗(yàn)資料及文獻(xiàn)資料生物制品注冊(cè)申報(bào)資料要求《藥品注冊(cè)管理辦法》（局令第28號(hào)）中藥、天然藥物注冊(cè)28.3一、生物樣品分析技術(shù)的特點(diǎn)與要求

生物樣品：全血、血漿、血清、糞便、尿液、膽汁或其他

特點(diǎn)：藥物濃度低g/ml,ng/ml,fg/ml

干擾物質(zhì)多

取樣量少

個(gè)體的差異大

靈敏、專一、精確、可靠的生物樣品定量分析方法?

一、生物樣品分析技術(shù)的特點(diǎn)與要求生物樣品：全血、血漿、血4生物樣品分析方法的建立和確證

1.生物樣品分析方法的選擇和建立

（3）放射性核素標(biāo)記法：標(biāo)記核素有3H、14C、125I。藥物分布和排泄研究，物料平衡研究。125I。蛋白質(zhì)類分析1)色譜法：HPLC、GC、LC-MS、LC-MS/MS，GC-MS等，大多數(shù)藥物的分析2）免疫學(xué)方法：放射免疫、酶聯(lián)免疫、熒光免疫等，主要用于蛋白質(zhì)/多肽類物質(zhì)檢測(cè)；（4）微生物學(xué)方法，主要用于抗生素類藥物的測(cè)定生物樣品分析方法的建立和確證1.生物樣品分析方法的選擇和52．生物樣品分析方法的確證（MethodValidation）及技術(shù)要求（1）特異性(Specificity)

測(cè)定的物質(zhì)是受試藥品的原形藥物或特定活性代謝物，生物樣品所含內(nèi)源性和外源性物質(zhì)及其相應(yīng)代謝物不得干擾對(duì)樣品的測(cè)定

如何證明？考察6個(gè)不同來源空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加對(duì)照物質(zhì)色譜圖（注明濃度）及用藥后的生物樣品色譜圖反映分析方法的特異性2．生物樣品分析方法的確證（MethodValidatio6如何保證？措施生物樣品處理直接沉淀處理蛋白等液-液提取液固提取除雜質(zhì)樣品富集如何保證？措施生物樣品處理直接沉淀處理蛋白等液-液提取液固7分離條件優(yōu)化

色譜柱的選擇流動(dòng)相的選擇檢測(cè)條件優(yōu)化紫外檢測(cè)器熒光檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器：MS，MS/MS其他分離條件優(yōu)化色譜柱的選擇流動(dòng)相的選擇檢測(cè)條件優(yōu)化紫外檢測(cè)器8新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究課件9新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究課件10（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍（CalibrationCurve）

原理：待測(cè)物質(zhì)的濃度與響應(yīng)的相關(guān)性，用回歸分析方法獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，提供標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程和相關(guān)系數(shù)，說明其線性相關(guān)程度標(biāo)準(zhǔn)曲線高低濃度范圍為定量范圍，在定量范圍內(nèi)濃度測(cè)定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗(yàn)要求的精密度和準(zhǔn)確度

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍（CalibrationCurve11如何做？

少6個(gè)濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)使用與待測(cè)樣品相同的生物介質(zhì)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量范圍要能覆蓋全部待測(cè)樣品濃度，不允許將定量范圍外推求算未知樣品的濃度。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)隨行空白生物樣品，但計(jì)算時(shí)不包括該點(diǎn)。至少5條

如何做？少6個(gè)濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)使用與待測(cè)樣品相同的生物12實(shí)例1左旋泮托拉唑血漿中標(biāo)準(zhǔn)曲線取空白大鼠血漿90l，加10l不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,使血漿中左旋泮托拉唑濃度分別為0、0.156、0.312、0.625、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00和40.00g/ml，按“血漿樣品的處理過程”項(xiàng)下操作，記錄樣品和內(nèi)標(biāo)峰面積。實(shí)例1左旋泮托拉唑血漿中標(biāo)準(zhǔn)曲線13利用樣品濃度C對(duì)樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比R作直線回歸，得左旋泮托拉唑回歸方程R=0.777C+0.023，線性范圍0.156～40.00g/ml，最低檢測(cè)濃度0.156g/ml。利用樣品濃度C對(duì)樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比R作直線回歸，得左旋泮托拉14左旋泮托拉唑血樣方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)曲線

左旋泮托拉唑血樣方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)曲線15（3）定量下限（LowerLimitofquantitation，LLOQ）定量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)

要求至少能滿足測(cè)定3～5個(gè)半衰期時(shí)樣品中的藥物濃度，或Cmax的1/10～1/20時(shí)的藥物濃度，其準(zhǔn)確度應(yīng)在真實(shí)濃度的80%～120%范圍內(nèi)，RSD應(yīng)小于20%。應(yīng)由至少5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)試結(jié)果證明

（3）定量下限（LowerLimitofquant16（4）精密度與準(zhǔn)確度(PrecisionandAccuracy)

要求選擇高中低3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品同時(shí)進(jìn)行方法的精密度和準(zhǔn)確度考察。低濃度選擇在定量下限（LLOQ）附近，其濃度在LLOQ的3倍以內(nèi)；高濃度接近于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限，通常大于工作曲線最高濃度80%中間選一個(gè)濃度

（4）精密度與準(zhǔn)確度(PrecisionandAc17每一濃度每批至少測(cè)定5個(gè)樣品，批內(nèi)變異連續(xù)測(cè)定3個(gè)分析批批間變異變異：RSD一般應(yīng)小于15%，在LLOQ附近RSD應(yīng)小于20%。要求：準(zhǔn)確度：一般應(yīng)在85%～115%范圍內(nèi)，在LLOQ附近應(yīng)在80%～120%范圍內(nèi)

每一濃度每批至少測(cè)定5個(gè)樣品，批內(nèi)變異變異：RSD一般應(yīng)小18左旋泮托拉唑批內(nèi)和批間變異取空白血漿100l，加入標(biāo)準(zhǔn)品，使單一對(duì)映體濃度分別為0.312，2.50和20.00g/ml，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作，記錄樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值R，代入當(dāng)日工作曲線中算得濃度，以此作為精密度指標(biāo)。測(cè)得批內(nèi)變異和連續(xù)3天內(nèi)的批間變異(n=5)，結(jié)果見下表。左旋泮托拉唑批內(nèi)和批間變異19新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究課件20新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究課件21（5）樣品穩(wěn)定性(Stability)根據(jù)具體情況，對(duì)含藥生物樣品在室溫、冷凍和凍融條件下以及不同存放時(shí)間進(jìn)行穩(wěn)定性考察，以確定生物樣品的存放條件和時(shí)間。還應(yīng)注意儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性以及樣品處理后的溶液中分析物的穩(wěn)定性。WHY（5）樣品穩(wěn)定性(Stability)根據(jù)具體情況，對(duì)22長(zhǎng)期凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)反復(fù)凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)

室溫放置6h穩(wěn)定性試驗(yàn)進(jìn)樣瓶放置24h穩(wěn)定性試驗(yàn)

樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

其他長(zhǎng)期凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)反復(fù)凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)室溫放置6h穩(wěn)定23（6）回收率(Recovery)

高、中、低3個(gè)濃度的提取回收率，高、中、低3個(gè)濃度的提取回收率應(yīng)大于70%

濃度設(shè)定要求同變異分析（6）回收率(Recovery)高、中、低3個(gè)濃度的提24左旋泮托拉唑方法回收率EP管加入90μL空白血漿，加入10μL標(biāo)準(zhǔn)品，使單一對(duì)映體濃度分別為0.312，2.50和20.00g/ml，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下的方法操作，記錄樣品峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積(A1)；另取EP管加入10μL6.25,50和400g/ml消旋泮托拉唑標(biāo)準(zhǔn)品，再加入內(nèi)標(biāo)10μL，揮干后100μL甲醇復(fù)溶，離心，取上清進(jìn)樣，記錄樣品峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積(A2)。以峰面積的比值(A1/A2*100%)求得血漿中左旋和右旋泮托拉唑和內(nèi)標(biāo)的回收率。每個(gè)濃度處理5份樣品，結(jié)果見表

左旋泮托拉唑方法回收率25（7）介質(zhì)效應(yīng)(MediumEffect)：由于樣品中存在干擾物質(zhì)，對(duì)響應(yīng)造成的直接或間接的影響。LC-MSLC-MS/MS

大鼠的空白血漿，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下的方法操作，揮干后加入10μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)液，揮干，加入100μL復(fù)溶液，使最終濃度相當(dāng)于QC樣品濃度，每個(gè)濃度進(jìn)樣5次，記峰面積為A1；另取10μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)液，揮干，加入100μL復(fù)溶液，使終濃度相當(dāng)于QC樣品濃度，即排除空白血漿基質(zhì)的干擾，每個(gè)濃度進(jìn)樣5次，記峰面積為A2。（7）介質(zhì)效應(yīng)(MediumEffect)：由于樣品中存26如果A1/A2<85或>115%，表明有基質(zhì)效應(yīng)存在不符合要求如果A1/A2<85或>115%，表明有基質(zhì)效應(yīng)存在27（8)方法學(xué)質(zhì)控(Qualitycontrol,QC)

由獨(dú)立的人員配制不同濃度的質(zhì)控樣品對(duì)分析方法進(jìn)行考核。對(duì)操作者單盲高、中、低三個(gè)濃度的質(zhì)控樣品利用隨行工作曲線求得測(cè)定結(jié)果每份樣品重復(fù)6次質(zhì)控樣品測(cè)定結(jié)果的偏差一般應(yīng)小于15%，低濃度一般應(yīng)小于20％。2/3樣品應(yīng)符合要求（8)方法學(xué)質(zhì)控(Qualitycontrol,QC)28生物樣品測(cè)定1）隨行工作曲線2）伴隨質(zhì)控樣本高中低3種濃度質(zhì)控樣品數(shù)大于未知樣品總數(shù)的5%。質(zhì)控樣本合理布控3）未知濃度樣本的信號(hào)代入方程，計(jì)算相應(yīng)樣品的濃度，如超過高限應(yīng)采用相應(yīng)的空白介質(zhì)稀釋后重新測(cè)定。對(duì)于濃度低于定量下限的樣品，應(yīng)以零值計(jì)算對(duì)于稀釋應(yīng)考慮稀釋效應(yīng)生物樣品測(cè)定29新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究的內(nèi)容和方法

1.實(shí)驗(yàn)藥品2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物盡可能與藥效學(xué)和毒理學(xué)研究所用的動(dòng)物一致清醒狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)，最好從同一動(dòng)物多次采樣實(shí)驗(yàn)所用的藥品應(yīng)與藥效學(xué)和毒理學(xué)研究使用的藥品相一致創(chuàng)新藥應(yīng)選用兩種或兩種以上的動(dòng)物，其中一種為嚙齒類動(dòng)物；另一種為非嚙齒類動(dòng)物，

特殊要求雌雄動(dòng)物兼用

新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究的內(nèi)容和方法1.實(shí)驗(yàn)藥品2.實(shí)303.劑量選擇三個(gè)劑量

藥效學(xué)和毒理學(xué)研究中所用的劑量，其高劑量最好接近最小中毒劑量，中劑量相當(dāng)于有效劑量，體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過程是否屬于線性？4.給藥方式和途徑

應(yīng)盡可能與擬定的臨床用藥一致參考藥效/毒理？

3.劑量選擇三個(gè)劑量藥效學(xué)和毒理學(xué)研究中所用的劑量，其高劑31新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究課件32AUC比：1：3.9：11；劑量比：1：7：50ln-ln圖斜率偏離1！

AUC比：1：3.9：11；劑量比：1：7：50ln-l33AUC比：1：3.9：11；劑量比：1：7：50ln-ln圖斜率偏離1！

AUC比：1：3.9：11；劑量比：1：7：50ln-l34二、臨床前藥動(dòng)學(xué)研究方法和內(nèi)容

1．血藥濃度-時(shí)間曲線

動(dòng)物數(shù)的確定

不少于5個(gè)，通常6只雄雌各半如有性別差異，增加動(dòng)物數(shù)如用于單性動(dòng)物，可采用臨床擬用的性別的動(dòng)物采樣點(diǎn)的確定

整個(gè)采樣時(shí)間至少應(yīng)持續(xù)到3～5個(gè)半衰期，或持續(xù)到血藥峰濃度Cmax的1/10～1/20。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上合理布點(diǎn)二、臨床前藥動(dòng)學(xué)研究方法和內(nèi)容1．血藥濃度-時(shí)間曲線動(dòng)物35給藥劑量和途徑

三個(gè)劑量組

口服給藥，一般應(yīng)在給藥前應(yīng)禁食12小時(shí)以上，以排除食物對(duì)藥物吸收的影響

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的估算

模型法矩量法選擇一合適劑量中劑量多次給藥達(dá)穩(wěn)態(tài)蓄積情況給藥劑量和途徑三個(gè)劑量組口服給藥，一般應(yīng)在給藥前應(yīng)禁食136藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的估算

模型法矩量法模型選擇，參數(shù)估算AUC，Tmax，Cmax，T1/2，MRT藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的估算模型法矩量法模型選擇，參數(shù)估算AUC，T37估算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)時(shí)需要考慮的問題1）模型選擇

系列Ti,Ci

AIC=nln(Re)+2m模型選擇的相對(duì)性Re的量綱問題估算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)時(shí)需要考慮的問題1）模型選擇系列Ti38n=10,onem=2n=10,twom=4Re=0.1(ug/ml)^2=10000(ng/ml)^2onetwoReAICAIC0.1(ug/ml)^2-19.03-15.0310000（ng/ml)^2119.13123.13n=10,onem=2onetwoRe39濃度高占的比重大2）權(quán)重問題

濃度高占的比重大2）權(quán)重問題40結(jié)合臨床應(yīng)用實(shí)際,合理地選擇權(quán)重系數(shù)權(quán)重:竊富濟(jì)貧考慮:安全性峰濃度有效性:最低有效濃度參數(shù)的實(shí)際意義和臨床價(jià)值臨床給藥間隔結(jié)合臨床應(yīng)用實(shí)際,合理地選擇權(quán)重系數(shù)權(quán)重:竊富濟(jì)貧考慮:41血藥濃度的測(cè)定準(zhǔn)確性誤差要求在規(guī)定范圍內(nèi)高濃度15%中濃度15%低濃度20%血藥濃度的測(cè)定準(zhǔn)確性誤差要求在規(guī)定范圍內(nèi)42實(shí)例最后點(diǎn)濃度正誤差20%,結(jié)果實(shí)例最后點(diǎn)濃度正誤差20%,結(jié)果433）末端項(xiàng)半衰期的求算問題lnCt線性回歸時(shí)間點(diǎn)選擇取點(diǎn)不同結(jié)果不同,上述結(jié)果(似乎均滿足線性非參數(shù)法3）末端項(xiàng)半衰期的求算問題lnCt線性回歸時(shí)間點(diǎn)選擇444）初值的選擇程序存在初值依賴性擬合參數(shù)的實(shí)際意義速率常數(shù)和系數(shù)應(yīng)為>0參數(shù)應(yīng)有合理的解釋!!半衰期值不會(huì)大于取樣時(shí)間長(zhǎng)度4）初值的選擇程序存在初值依賴性擬合參數(shù)的實(shí)際意義速率常數(shù)和45包括線性動(dòng)力學(xué)，非線性動(dòng)力學(xué)判定？有無性別差異？多劑量：穩(wěn)態(tài)情況，蓄積情況等？自身誘導(dǎo)？結(jié)果分析與結(jié)論包括線性動(dòng)力學(xué)，非線性動(dòng)力學(xué)判定？有無性別差異？結(jié)果分析與結(jié)462．藥物的吸收吸收速度Cmax和Tmax吸收的程度AUC生物利用度吸收機(jī)理創(chuàng)新藥物invivoInvitroCaco-2模型2．藥物的吸收吸收速度Cmax和Tmax吸收的程度47Transwell小室示意圖一般認(rèn)為Papp>10-6cm/s的藥物吸收較好，Papp<10-7cm/s的藥物吸收很差Transwell小室示意圖一般認(rèn)為Papp>10-6cm/483．藥物的分布一個(gè)劑量選3個(gè)時(shí)間點(diǎn)考慮吸收分布，消除動(dòng)物數(shù)同血藥濃度組織：生命器官，藥物分布，毒性/藥效靶器官3．藥物的分布一個(gè)劑量選3個(gè)時(shí)間點(diǎn)考慮吸收分布，消除動(dòng)物49血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)

血漿蛋白：人/動(dòng)物種屬差異性藥物濃度：結(jié)合血漿中藥物濃度3-4個(gè)濃度。線性結(jié)合？合適方法：平衡透析法，超濾法等需要注意：非特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性高蛋白結(jié)合率藥物：藥物相互作用？血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)血漿蛋白：人/動(dòng)物種屬差異性藥物濃505．藥物的排泄動(dòng)物：大鼠或小鼠糞，尿，膽汁給藥后，動(dòng)物放入代謝籠中，不同時(shí)間段收集尿與糞至排泄完全，測(cè)定尿和糞中總藥物排泄量，計(jì)算排泄分?jǐn)?shù)（尿或糞中累積排泄量/給藥計(jì)量）藥物的尿和糞排泄5．藥物的排泄動(dòng)物：大鼠或小鼠糞，尿，膽汁給藥后，動(dòng)物放入代51膽汁排泄一般用大鼠在乙醚麻醉下作膽管插管引流，待動(dòng)物清醒后，以預(yù)先確定的途徑給藥，并以合適的時(shí)間間隔分段收集膽汁，記錄膽汁體積，取一部分樣品進(jìn)行藥物測(cè)定，計(jì)算藥物經(jīng)膽汁排泄的速率及總排泄量

結(jié)合尿、糞和膽汁中的排泄量，計(jì)算藥物原型排泄分?jǐn)?shù)膽汁排泄一般用大鼠在乙醚麻醉下作膽管插管引流，待動(dòng)物清醒后，52藥物代謝研究在體研究：動(dòng)物給藥或采用合適的方法分析尿，膽汁或血漿中代謝產(chǎn)物生成情況通常采用LC-MS/MS或LC-TOF/MS對(duì)可能的代謝產(chǎn)物進(jìn)行初版鑒定，推斷可能的代謝途徑和半定量分析?？赡艿脑?，化學(xué)合成或收集尿，分析代謝物，進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)確定。藥物代謝研究在體研究：動(dòng)物給藥或采用合適的方法分析尿，膽汁或53離體實(shí)驗(yàn)肝微粒體：I相代謝和葡萄糖醛酸結(jié)合肝微粒體與待測(cè)藥物在輔因子存在情況下，共溫孵后，測(cè)定反應(yīng)體系中代謝物的生成情況，結(jié)合在體結(jié)果進(jìn)一步分析其可能的代謝物和代謝途徑創(chuàng)新藥物：幾種種屬動(dòng)物肝微粒體代謝酶的比較藥物代謝及代謝途徑胞漿，微粒體，S9，肝細(xì)胞（原代或冷凍）離體實(shí)驗(yàn)肝微粒體：I相代謝和葡萄糖醛酸結(jié)合肝微粒體與待測(cè)藥54肝微粒體代謝穩(wěn)定性代謝產(chǎn)物尋找介導(dǎo)代謝酶亞型鑒定藥物相互作用其他？動(dòng)物種屬間比較定量/定性肝微粒體代謝穩(wěn)定性代謝產(chǎn)物尋找介導(dǎo)代謝酶亞型鑒定藥物相互作用55參與藥物代謝酶研究肝微粒體與待測(cè)藥物在輔因子存在和酶特異性抑制劑情況下，共溫孵后，測(cè)定反應(yīng)體系中代謝物的生成情況，與無抑制劑結(jié)果比較。肝微粒體結(jié)合進(jìn)一步用克隆酶/重組酶確認(rèn)參與藥物代謝酶研究肝微粒體與待測(cè)藥物在輔因子存在和酶特異性抑56新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究課件57實(shí)例去氧鬼臼毒素代謝初步試驗(yàn)（人肝和大鼠肝微粒體）去氧鬼臼毒素在人肝微粒體代謝實(shí)例去氧鬼臼毒素代謝初步試驗(yàn)（人肝和大鼠肝微粒體）去氧鬼臼毒58肝微粒體三種代謝物形成大鼠肝微粒體中溫孵肝微粒體三種代謝物形成大鼠肝微粒體中溫孵59幾種酶抑制劑對(duì)代謝物M1，M2和M7形成的影響大鼠肝微粒體參與去氧鬼臼毒素代謝酶分析

大鼠肝微粒體0.5mg/ml,終止溫孵時(shí)間為2min,DPT底物濃度為50M幾種酶抑制劑對(duì)代謝物M1，M2和M7形成的影響大鼠肝微粒體參60藥物相互作用在體：雞尾酒法探針混合物與待測(cè)定藥物合用單用或多次用藥后，測(cè)定探針?biāo)幬锏拇x動(dòng)力學(xué)行為變化藥物相互作用在體：雞尾酒法探針混合物與待測(cè)定藥物合用單用或多61新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究課件62離體實(shí)驗(yàn)代謝抑制：可逆性抑制，機(jī)制性抑制酶活性探針

離體實(shí)驗(yàn)代謝抑制：可逆性抑制，機(jī)制性抑制酶活性探針63新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究課件64可逆性抑制（競(jìng)爭(zhēng)性抑制）實(shí)驗(yàn)：肝微粒體、抑制劑、探針以及輔因子（NADPH）共溫孵，測(cè)定產(chǎn)物的生成

機(jī)制性抑制：肝微粒體、抑制劑以及輔因子（NADPH）共溫孵一段時(shí)間后，在測(cè)定酶活性（與探針溫孵），測(cè)定產(chǎn)物的生成測(cè)定產(chǎn)物的生成特點(diǎn)酶活性抑制強(qiáng)弱與抑制劑濃度，預(yù)溫孵時(shí)間有關(guān)可逆性抑制（競(jìng)爭(zhēng)性抑制）實(shí)驗(yàn)：肝微粒體、抑制劑、探針以及輔因65新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究課件66酶活性誘導(dǎo)：人肝CYP1A2，2B6和3A4人肝與待測(cè)藥物共培養(yǎng)72h,測(cè)定相應(yīng)酶活性或基因表達(dá)，陽性對(duì)照酶活性誘導(dǎo)：人肝CYP1A2，2B6和3A4人肝與待測(cè)藥物67新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究課件68決策樹決策樹69三、新的緩、控釋制劑的臨床前研究的內(nèi)容與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

參比制劑的選擇

給藥的劑量和途徑

三、新的緩、控釋制劑的臨床前研究的內(nèi)容與方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選70研究的內(nèi)容和方法多劑量研究

單劑量研究

研究的內(nèi)容和方法多劑量研究單劑量研究71新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究

新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究72目的:闡明新藥在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的過程和特點(diǎn)。ADME新藥研發(fā)的重要環(huán)節(jié)，要求研究?jī)?nèi)容與藥物的分類有關(guān)。目的:闡明新藥在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的過程和特點(diǎn)。73《藥品注冊(cè)管理辦法》（局令第28號(hào)）中藥、天然藥物注冊(cè)28.動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)資料及文獻(xiàn)資料化學(xué)藥品注冊(cè)22.復(fù)方制劑中多種成份藥效、毒性、藥代動(dòng)力學(xué)相互影響的試驗(yàn)資料及文獻(xiàn)資料27.非臨床藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)資料及文獻(xiàn)資料21.動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)資料及文獻(xiàn)資料

27.復(fù)方制劑中多種組份藥效、毒性、藥代動(dòng)力學(xué)相互影響的試驗(yàn)資料及文獻(xiàn)資料生物制品注冊(cè)申報(bào)資料要求《藥品注冊(cè)管理辦法》（局令第28號(hào)）中藥、天然藥物注冊(cè)28.74一、生物樣品分析技術(shù)的特點(diǎn)與要求

生物樣品：全血、血漿、血清、糞便、尿液、膽汁或其他

特點(diǎn)：藥物濃度低g/ml,ng/ml,fg/ml

干擾物質(zhì)多

取樣量少

個(gè)體的差異大

靈敏、專一、精確、可靠的生物樣品定量分析方法?

一、生物樣品分析技術(shù)的特點(diǎn)與要求生物樣品：全血、血漿、血75生物樣品分析方法的建立和確證

1.生物樣品分析方法的選擇和建立

（3）放射性核素標(biāo)記法：標(biāo)記核素有3H、14C、125I。藥物分布和排泄研究，物料平衡研究。125I。蛋白質(zhì)類分析1)色譜法：HPLC、GC、LC-MS、LC-MS/MS，GC-MS等，大多數(shù)藥物的分析2）免疫學(xué)方法：放射免疫、酶聯(lián)免疫、熒光免疫等，主要用于蛋白質(zhì)/多肽類物質(zhì)檢測(cè)；（4）微生物學(xué)方法，主要用于抗生素類藥物的測(cè)定生物樣品分析方法的建立和確證1.生物樣品分析方法的選擇和762．生物樣品分析方法的確證（MethodValidation）及技術(shù)要求（1）特異性(Specificity)

測(cè)定的物質(zhì)是受試藥品的原形藥物或特定活性代謝物，生物樣品所含內(nèi)源性和外源性物質(zhì)及其相應(yīng)代謝物不得干擾對(duì)樣品的測(cè)定

如何證明？考察6個(gè)不同來源空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加對(duì)照物質(zhì)色譜圖（注明濃度）及用藥后的生物樣品色譜圖反映分析方法的特異性2．生物樣品分析方法的確證（MethodValidatio77如何保證？措施生物樣品處理直接沉淀處理蛋白等液-液提取液固提取除雜質(zhì)樣品富集如何保證？措施生物樣品處理直接沉淀處理蛋白等液-液提取液固78分離條件優(yōu)化

色譜柱的選擇流動(dòng)相的選擇檢測(cè)條件優(yōu)化紫外檢測(cè)器熒光檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器：MS，MS/MS其他分離條件優(yōu)化色譜柱的選擇流動(dòng)相的選擇檢測(cè)條件優(yōu)化紫外檢測(cè)器79新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究課件80新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究課件81（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍（CalibrationCurve）

原理：待測(cè)物質(zhì)的濃度與響應(yīng)的相關(guān)性，用回歸分析方法獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，提供標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程和相關(guān)系數(shù)，說明其線性相關(guān)程度標(biāo)準(zhǔn)曲線高低濃度范圍為定量范圍，在定量范圍內(nèi)濃度測(cè)定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗(yàn)要求的精密度和準(zhǔn)確度

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍（CalibrationCurve82如何做？

少6個(gè)濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)使用與待測(cè)樣品相同的生物介質(zhì)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量范圍要能覆蓋全部待測(cè)樣品濃度，不允許將定量范圍外推求算未知樣品的濃度。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)隨行空白生物樣品，但計(jì)算時(shí)不包括該點(diǎn)。至少5條

如何做？少6個(gè)濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)使用與待測(cè)樣品相同的生物83實(shí)例1左旋泮托拉唑血漿中標(biāo)準(zhǔn)曲線取空白大鼠血漿90l，加10l不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,使血漿中左旋泮托拉唑濃度分別為0、0.156、0.312、0.625、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00和40.00g/ml，按“血漿樣品的處理過程”項(xiàng)下操作，記錄樣品和內(nèi)標(biāo)峰面積。實(shí)例1左旋泮托拉唑血漿中標(biāo)準(zhǔn)曲線84利用樣品濃度C對(duì)樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比R作直線回歸，得左旋泮托拉唑回歸方程R=0.777C+0.023，線性范圍0.156～40.00g/ml，最低檢測(cè)濃度0.156g/ml。利用樣品濃度C對(duì)樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比R作直線回歸，得左旋泮托拉85左旋泮托拉唑血樣方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)曲線

左旋泮托拉唑血樣方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)曲線86（3）定量下限（LowerLimitofquantitation，LLOQ）定量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)

要求至少能滿足測(cè)定3～5個(gè)半衰期時(shí)樣品中的藥物濃度，或Cmax的1/10～1/20時(shí)的藥物濃度，其準(zhǔn)確度應(yīng)在真實(shí)濃度的80%～120%范圍內(nèi)，RSD應(yīng)小于20%。應(yīng)由至少5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)試結(jié)果證明

（3）定量下限（LowerLimitofquant87（4）精密度與準(zhǔn)確度(PrecisionandAccuracy)

要求選擇高中低3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品同時(shí)進(jìn)行方法的精密度和準(zhǔn)確度考察。低濃度選擇在定量下限（LLOQ）附近，其濃度在LLOQ的3倍以內(nèi)；高濃度接近于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限，通常大于工作曲線最高濃度80%中間選一個(gè)濃度

（4）精密度與準(zhǔn)確度(PrecisionandAc88每一濃度每批至少測(cè)定5個(gè)樣品，批內(nèi)變異連續(xù)測(cè)定3個(gè)分析批批間變異變異：RSD一般應(yīng)小于15%，在LLOQ附近RSD應(yīng)小于20%。要求：準(zhǔn)確度：一般應(yīng)在85%～115%范圍內(nèi)，在LLOQ附近應(yīng)在80%～120%范圍內(nèi)

每一濃度每批至少測(cè)定5個(gè)樣品，批內(nèi)變異變異：RSD一般應(yīng)小89左旋泮托拉唑批內(nèi)和批間變異取空白血漿100l，加入標(biāo)準(zhǔn)品，使單一對(duì)映體濃度分別為0.312，2.50和20.00g/ml，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作，記錄樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值R，代入當(dāng)日工作曲線中算得濃度，以此作為精密度指標(biāo)。測(cè)得批內(nèi)變異和連續(xù)3天內(nèi)的批間變異(n=5)，結(jié)果見下表。左旋泮托拉唑批內(nèi)和批間變異90新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究課件91新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究課件92（5）樣品穩(wěn)定性(Stability)根據(jù)具體情況，對(duì)含藥生物樣品在室溫、冷凍和凍融條件下以及不同存放時(shí)間進(jìn)行穩(wěn)定性考察，以確定生物樣品的存放條件和時(shí)間。還應(yīng)注意儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性以及樣品處理后的溶液中分析物的穩(wěn)定性。WHY（5）樣品穩(wěn)定性(Stability)根據(jù)具體情況，對(duì)93長(zhǎng)期凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)反復(fù)凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)

室溫放置6h穩(wěn)定性試驗(yàn)進(jìn)樣瓶放置24h穩(wěn)定性試驗(yàn)

樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

其他長(zhǎng)期凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)反復(fù)凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)室溫放置6h穩(wěn)定94（6）回收率(Recovery)

高、中、低3個(gè)濃度的提取回收率，高、中、低3個(gè)濃度的提取回收率應(yīng)大于70%

濃度設(shè)定要求同變異分析（6）回收率(Recovery)高、中、低3個(gè)濃度的提95左旋泮托拉唑方法回收率EP管加入90μL空白血漿，加入10μL標(biāo)準(zhǔn)品，使單一對(duì)映體濃度分別為0.312，2.50和20.00g/ml，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下的方法操作，記錄樣品峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積(A1)；另取EP管加入10μL6.25,50和400g/ml消旋泮托拉唑標(biāo)準(zhǔn)品，再加入內(nèi)標(biāo)10μL，揮干后100μL甲醇復(fù)溶，離心，取上清進(jìn)樣，記錄樣品峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積(A2)。以峰面積的比值(A1/A2*100%)求得血漿中左旋和右旋泮托拉唑和內(nèi)標(biāo)的回收率。每個(gè)濃度處理5份樣品，結(jié)果見表

左旋泮托拉唑方法回收率96（7）介質(zhì)效應(yīng)(MediumEffect)：由于樣品中存在干擾物質(zhì)，對(duì)響應(yīng)造成的直接或間接的影響。LC-MSLC-MS/MS

大鼠的空白血漿，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下的方法操作，揮干后加入10μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)液，揮干，加入100μL復(fù)溶液，使最終濃度相當(dāng)于QC樣品濃度，每個(gè)濃度進(jìn)樣5次，記峰面積為A1；另取10μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)液，揮干，加入100μL復(fù)溶液，使終濃度相當(dāng)于QC樣品濃度，即排除空白血漿基質(zhì)的干擾，每個(gè)濃度進(jìn)樣5次，記峰面積為A2。（7）介質(zhì)效應(yīng)(MediumEffect)：由于樣品中存97如果A1/A2<85或>115%，表明有基質(zhì)效應(yīng)存在不符合要求如果A1/A2<85或>115%，表明有基質(zhì)效應(yīng)存在98（8)方法學(xué)質(zhì)控(Qualitycontrol,QC)

由獨(dú)立的人員配制不同濃度的質(zhì)控樣品對(duì)分析方法進(jìn)行考核。對(duì)操作者單盲高、中、低三個(gè)濃度的質(zhì)控樣品利用隨行工作曲線求得測(cè)定結(jié)果每份樣品重復(fù)6次質(zhì)控樣品測(cè)定結(jié)果的偏差一般應(yīng)小于15%，低濃度一般應(yīng)小于20％。2/3樣品應(yīng)符合要求（8)方法學(xué)質(zhì)控(Qualitycontrol,QC)99生物樣品測(cè)定1）隨行工作曲線2）伴隨質(zhì)控樣本高中低3種濃度質(zhì)控樣品數(shù)大于未知樣品總數(shù)的5%。質(zhì)控樣本合理布控3）未知濃度樣本的信號(hào)代入方程，計(jì)算相應(yīng)樣品的濃度，如超過高限應(yīng)采用相應(yīng)的空白介質(zhì)稀釋后重新測(cè)定。對(duì)于濃度低于定量下限的樣品，應(yīng)以零值計(jì)算對(duì)于稀釋應(yīng)考慮稀釋效應(yīng)生物樣品測(cè)定100新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究的內(nèi)容和方法

1.實(shí)驗(yàn)藥品2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物盡可能與藥效學(xué)和毒理學(xué)研究所用的動(dòng)物一致清醒狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)，最好從同一動(dòng)物多次采樣實(shí)驗(yàn)所用的藥品應(yīng)與藥效學(xué)和毒理學(xué)研究使用的藥品相一致創(chuàng)新藥應(yīng)選用兩種或兩種以上的動(dòng)物，其中一種為嚙齒類動(dòng)物；另一種為非嚙齒類動(dòng)物，

特殊要求雌雄動(dòng)物兼用

新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究的內(nèi)容和方法1.實(shí)驗(yàn)藥品2.實(shí)1013.劑量選擇三個(gè)劑量

藥效學(xué)和毒理學(xué)研究中所用的劑量，其高劑量最好接近最小中毒劑量，中劑量相當(dāng)于有效劑量，體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過程是否屬于線性？4.給藥方式和途徑

應(yīng)盡可能與擬定的臨床用藥一致參考藥效/毒理？

3.劑量選擇三個(gè)劑量藥效學(xué)和毒理學(xué)研究中所用的劑量，其高劑102新藥臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究課件103AUC比：1：3.9：11；劑量比：1：7：50ln-ln圖斜率偏離1！

AUC比：1：3.9：11；劑量比：1：7：50ln-l104AUC比：1：3.9：11；劑量比：1：7：50ln-ln圖斜率偏離1！

AUC比：1：3.9：11；劑量比：1：7：50ln-l105二、臨床前藥動(dòng)學(xué)研究方法和內(nèi)容

1．血藥濃度-時(shí)間曲線

動(dòng)物數(shù)的確定

不少于5個(gè)，通常6只雄雌各半如有性別差異，增加動(dòng)物數(shù)如用于單性動(dòng)物，可采用臨床擬用的性別的動(dòng)物采樣點(diǎn)的確定

整個(gè)采樣時(shí)間至少應(yīng)持續(xù)到3～5個(gè)半衰期，或持續(xù)到血藥峰濃度Cmax的1/10～1/20。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上合理布點(diǎn)二、臨床前藥動(dòng)學(xué)研究方法和內(nèi)容1．血藥濃度-時(shí)間曲線動(dòng)物106給藥劑量和途徑

三個(gè)劑量組

口服給藥，一般應(yīng)在給藥前應(yīng)禁食12小時(shí)以上，以排除食物對(duì)藥物吸收的影響

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的估算

模型法矩量法選擇一合適劑量中劑量多次給藥達(dá)穩(wěn)態(tài)蓄積情況給藥劑量和途徑三個(gè)劑量組口服給藥，一般應(yīng)在給藥前應(yīng)禁食1107藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的估算

模型法矩量法模型選擇，參數(shù)估算AUC，Tmax，Cmax，T1/2，MRT藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的估算模型法矩量法模型選擇，參數(shù)估算AUC，T108估算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)時(shí)需要考慮的問題1）模型選擇

系列Ti,Ci

AIC=nln(Re)+2m模型選擇的相對(duì)性Re的量綱問題估算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)時(shí)需要考慮的問題1）模型選擇系列Ti109n=10,onem=2n=10,twom=4Re=0.1(ug/ml)^2=10000(ng/ml)^2onetwoReAICAIC0.1(ug/ml)^2-19.03-15.0310000（ng/ml)^2119.13123.13n=10,onem=2onetwoRe110濃度高占的比重大2）權(quán)重問題

濃度高占的比重大2）權(quán)重問題111結(jié)合臨床應(yīng)用實(shí)際,合理地選擇權(quán)重系數(shù)權(quán)重:竊富濟(jì)貧考慮:安全性峰濃度有效性:最低有效濃度參數(shù)的實(shí)際意義和臨床價(jià)值臨床給藥間隔結(jié)合臨床應(yīng)用實(shí)際,合理地選擇權(quán)重系數(shù)權(quán)重:竊富濟(jì)貧考慮:112血藥濃度的測(cè)定準(zhǔn)確性誤差要求在規(guī)定范圍內(nèi)高濃度15%中濃度15%低濃度20%血藥濃度的測(cè)定準(zhǔn)確性誤差要求在規(guī)定范圍內(nèi)113實(shí)例最后點(diǎn)濃度正誤差20%,結(jié)果實(shí)例最后點(diǎn)濃度正誤差20%,結(jié)果1143）末端項(xiàng)半衰期的求算問題lnCt線性回歸時(shí)間點(diǎn)選擇取點(diǎn)不同結(jié)果不同,上述結(jié)果(似乎均滿足線性非參數(shù)法3）末端項(xiàng)半衰期的求算問題lnCt線性回歸時(shí)間點(diǎn)選擇1154）初值的選擇程序存在初值依賴性擬合參數(shù)的實(shí)際意義速率常數(shù)和系數(shù)應(yīng)為>0參數(shù)應(yīng)有合理的解釋!!半衰期值不會(huì)大于取樣時(shí)間長(zhǎng)度4）初值的選擇程序存在初值依賴性擬合參數(shù)的實(shí)際意義速率常數(shù)和116包括線性動(dòng)力學(xué)，非線性動(dòng)力學(xué)判定？有無性別差異？多劑量：穩(wěn)態(tài)情況，蓄積情況等？自身誘導(dǎo)？結(jié)果分析與結(jié)論包括線性動(dòng)力學(xué)，非線性動(dòng)力學(xué)判定？有無性別差異？結(jié)果分析與結(jié)1172．藥物的吸收吸收速度Cmax和Tmax吸收的程度AUC生物利用度吸收機(jī)理創(chuàng)新藥物invivoInvitroCaco-2模型2．藥物的吸收吸收速度Cmax和Tmax吸收的程度118Transwell小室示意圖一般認(rèn)為Papp>10-6cm/s的藥物吸收較好，Papp<10-7cm/s的藥物吸收很差Transwell小室示意圖一般認(rèn)為Papp>10-6cm/1193．藥物的分布一個(gè)劑量選3個(gè)時(shí)間點(diǎn)考慮吸收分布，消除動(dòng)物數(shù)同血藥濃度組織：生命器官，藥物分布，毒性/藥效靶器官3．藥物的分布一個(gè)劑量選3個(gè)時(shí)間點(diǎn)考慮吸收分布，消除動(dòng)物120血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)

血漿蛋白：人/動(dòng)物種屬差異性藥物濃度：結(jié)合血漿中藥物濃度3-4個(gè)濃度。線性結(jié)合？合適方法：平衡透析法，超濾法等需要注意：非特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性高蛋白結(jié)合率藥物：藥物相互作用？血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)血漿蛋白：人/動(dòng)物種屬差異性藥物濃1215．藥物的排泄動(dòng)物：大鼠或小鼠糞，尿，膽汁給藥后，動(dòng)物放入代謝籠中，不同時(shí)間段收集尿與糞至排泄完全，測(cè)定尿和糞中總藥物排泄量，計(jì)算排泄分?jǐn)?shù)（尿或糞中累積排泄量/給藥計(jì)量）藥物的尿和糞排泄5．藥物的排泄動(dòng)物：大鼠或小鼠糞，尿，膽汁給藥后，動(dòng)物放入代122膽汁排泄一般用大鼠在乙醚麻醉下作膽管插管引流，待動(dòng)物清醒后，以預(yù)先確定的途徑給藥，并以合適的時(shí)間間隔分段收集