氨基酸代謝控制發(fā)酵機(jī)制及育種策略課件

氨基酸代謝控制發(fā)酵機(jī)制

及育種策略

徐慶陽(yáng)中國(guó)氨基酸技術(shù)服務(wù)中心氨基酸代謝控制發(fā)酵機(jī)制

及育種策略

徐慶陽(yáng)中國(guó)氨基酸技術(shù)服務(wù)1目錄Chapter1代謝機(jī)制理論基礎(chǔ)Chapter2L-谷氨酸Chapter3L-亮氨酸Chapter4L-纈氨酸Chapter5L-異亮氨酸目錄Chapter1代謝機(jī)制理論基礎(chǔ)2Chapter1代謝機(jī)制理論基礎(chǔ)Chapter1代謝機(jī)制理論基礎(chǔ)3氨基酸發(fā)酵機(jī)制在一般情況下，微生物細(xì)胞只合成本身需要的中間代謝產(chǎn)物，嚴(yán)格防止氨基酸、核苷酸等中間物質(zhì)的大量積累。當(dāng)氨基酸或核苷酸等物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞后，微生物細(xì)胞立即停止該物質(zhì)的合成，一直到所供應(yīng)的養(yǎng)料消耗到很低濃度，微生物細(xì)胞才能重新開(kāi)始進(jìn)行該物質(zhì)的合成。微生物細(xì)胞中這種調(diào)節(jié)控制作用主要靠?jī)蓚€(gè)因素，即參與調(diào)節(jié)的有關(guān)酶的活性和酶量氨基酸發(fā)酵機(jī)制在一般情況下，微生物細(xì)胞只合成本身需要的中間4代謝控制機(jī)制的研究已經(jīng)證明，酶的生物合成受基因和代謝物的雙重控制。一方面，從DNA的分子水平上闡明了酶生物合成的控制機(jī)制，酶的合成像普通蛋白質(zhì)的合成一樣，受到結(jié)構(gòu)基因的控制，由結(jié)構(gòu)基因決定形成酶分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)；另一方面,酶的生物合成還受代謝物（酶反應(yīng)的底物、產(chǎn)物及其類似物）的控制和調(diào)節(jié)。當(dāng)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，酶的生成量可以幾倍乃至幾百倍的數(shù)量增加。相反，某些酶促反應(yīng)的產(chǎn)物，特別是終產(chǎn)物，又能產(chǎn)生阻遏作用，使酶的合成量大大減少。代謝控制機(jī)制的研究已經(jīng)證明，酶的生物合成受基因和代謝物的雙重5參與氨基酸生物合成的關(guān)鍵酶主要有12種：①磷酸果糖激酶；②檸檬酸合成酶；③N-乙酰谷氨酸激酶；④鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨基甲酰酶；⑤天冬氨酸激酶；⑥高絲氨酸脫氫酶；⑦蘇氨酸脫水酶；⑧α-乙酰乳酸合成酶；⑨DAHP（2-酮-3-脫氧-D-阿拉伯糖型庚糖酸-7-磷酸）合成酶；⑩分支酸變位酶；11預(yù)苯酸脫水酶；12預(yù)苯酸脫氫酶。參與氨基酸生物合成的關(guān)鍵酶主要有12種：①磷酸果糖激酶；②檸6一般情況下，與氨基酸生物合成途徑分支點(diǎn)有關(guān)系的分支點(diǎn)酶（branchingenzyme）可以成為關(guān)鍵酶，但關(guān)鍵酶并不都是分支點(diǎn)酶。關(guān)鍵酶的關(guān)鍵效果也只是在特定的氨基酸生物合成過(guò)程中成立，而在其他氨基酸的生物合成過(guò)程中則不成立。例如，α-乙酰乳酸合成酶在纈氨酸生物合成途徑中起主導(dǎo)性的關(guān)鍵酶作用，但在異亮氨酸的生物合成中，起主導(dǎo)性關(guān)鍵作用的卻是蘇氨酸脫水酶。該酶位于α-乙酰乳酸合成酶的前一階段，并且不是分支點(diǎn)酶。一般情況下，與氨基酸生物合成途徑分支點(diǎn)有關(guān)系的分支點(diǎn)酶（br7反饋控制與優(yōu)先合成氨基酸生物合成的基本調(diào)節(jié)機(jī)制有反饋控制（反饋?zhàn)瓒襞c反饋抑制）和在合成途徑分支點(diǎn)處的優(yōu)先合成如圖所示的反饋控制，由催化合成途徑最初反應(yīng)A→B的初始酶受終產(chǎn)物氨基酸E的反饋抑制和合成途徑上各種酶受終產(chǎn)物氨基酸E的反饋?zhàn)瓒艚M成。反饋控制與優(yōu)先合成8優(yōu)先合成底物A經(jīng)分支合成途徑生成兩種終產(chǎn)物E和G，由于a酶的酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于b酶的酶活性，結(jié)果優(yōu)先合成E。E合成達(dá)到一定濃度時(shí)，就會(huì)抑制a酶，使代謝轉(zhuǎn)向合成G。G合成達(dá)到一定濃度時(shí)就會(huì)對(duì)c酶產(chǎn)生抑制作用優(yōu)先合成底物A經(jīng)分支合成途徑生成兩種終產(chǎn)物E和G，由于a酶9平衡合成（balancedsynthesis）底物A經(jīng)分支合成途徑生成兩種終產(chǎn)物E與G，由于a酶的酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于b酶，結(jié)果優(yōu)先合成E。E過(guò)量后就會(huì)抑制a酶，使代謝轉(zhuǎn)向合成G。G過(guò)量后，就會(huì)拮抗或逆轉(zhuǎn)E的反饋抑制作用，結(jié)果代謝流又轉(zhuǎn)向合成E，如此循環(huán)平衡合成（balancedsynthesis）底物A經(jīng)分10微生物體內(nèi)代謝過(guò)程的各種生物化學(xué)反應(yīng)，都是由各種酶來(lái)催化的。按各種酶在代謝調(diào)節(jié)中作用的不同，又可將酶分為以下三類調(diào)節(jié)酶（常稱關(guān)鍵酶，與代謝調(diào)節(jié)關(guān)系密切）變構(gòu)酶：通過(guò)酶分子構(gòu)象的變化來(lái)改變酶活性的一類酶同功酶：具有同一種酶的底物專一性，但分子結(jié)構(gòu)不同的一類酶多功能酶：能夠催化兩種以上不同反應(yīng)的一類酶靜態(tài)酶一般與代謝調(diào)節(jié)關(guān)系不大的一類酶潛在酶指酶原、非活性型或與抑制劑結(jié)合的酶微生物體內(nèi)代謝過(guò)程的各種生物化學(xué)反應(yīng)，都是由各種酶來(lái)催化的。11同功酶酶I和酶Ⅱ都是催化A→B的同功酶。G過(guò)量時(shí)，酶Ⅱ停止活動(dòng)，C也不能經(jīng)過(guò)F到G與此同時(shí)，酶I活力不受影響，A可以順利地到E，從而使G過(guò)量，但并不干擾E的合成同功酶12反饋抑制與反饋?zhàn)瓒舻谋容^項(xiàng)目類型反饋?zhàn)瓒舴答佉种瓶刂茖?duì)象酶的生物合成酶的活性控制量終產(chǎn)物濃度終產(chǎn)物濃度控制的水平DNA→mRNA→酶蛋白酶蛋白的構(gòu)象變化控制裝置終產(chǎn)物與阻遏蛋白的親和力終產(chǎn)物與變構(gòu)部位的親和力控制裝置的動(dòng)作阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，通過(guò)變構(gòu)效應(yīng)，酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化不能合成mRNA形成的控制開(kāi)、關(guān)控制控制酶活性大小反應(yīng)遲緩、粗的控制迅速、精確的控制代謝途徑無(wú)定向代謝途徑和合成代謝途徑分支點(diǎn)等無(wú)定向代謝途徑和合成代謝途徑分支點(diǎn)等細(xì)胞經(jīng)濟(jì)高分子化合物(酶蛋白)低分子化合物(酶反應(yīng)生成物)反饋抑制與反饋?zhàn)瓒舻谋容^項(xiàng)目反饋?zhàn)瓒舴答佉种瓶刂茖?duì)象酶的生物13協(xié)同反饋抑制或稱多價(jià)反饋抑制當(dāng)一條代謝途徑中有兩個(gè)以上終產(chǎn)物時(shí)，任何一個(gè)終產(chǎn)物都不能單獨(dú)抑制途徑第一個(gè)共同的酶促反應(yīng)，但當(dāng)兩者同時(shí)過(guò)剩時(shí)，它們協(xié)同抑制第一個(gè)酶反應(yīng)協(xié)同反饋抑制或稱多價(jià)反饋抑制14合作反饋抑制（Cooperativefeedbackinhibition）合作反饋抑制也可稱為增效反饋抑制（Synergisticfeedbackinhibition）。這種反饋抑制不同于協(xié)同反饋抑制，也不同于積累反饋抑制當(dāng)任何一個(gè)終產(chǎn)物單獨(dú)過(guò)剩時(shí)，只部分地反饋抑制第一個(gè)酶的活性，只有當(dāng)G、E兩個(gè)終產(chǎn)物同時(shí)過(guò)剩存在時(shí)，才能引起強(qiáng)烈抑制，其抑制程度大于各自單獨(dú)存在的和合作反饋抑制（Cooperativefeedbackin15積累反饋抑制（Cumulativefeedbackinhibition）在積累反饋抑制中，每一個(gè)最終產(chǎn)物只單獨(dú)地、部分地抑制共同步驟的第一個(gè)酶，并且各最終產(chǎn)物的抑制作用互不影響。所以幾個(gè)最終產(chǎn)物同時(shí)存在時(shí)，它們的抑制作用是積累的積累反饋抑制（Cumulativefeedbackinh16順序反饋抑制(Sequentialfeedbackinhibition)順序反饋抑制的過(guò)程是：F積累，停止D→E反應(yīng)，減少F的進(jìn)一步合成，更多的D轉(zhuǎn)到G，再由G合成I或K；I積累，抑制G→H的反應(yīng)；K積累，抑制G→J的反應(yīng)，結(jié)果造成G的積累，引起G對(duì)A→B的反饋抑制，使整個(gè)途徑停止假反饋抑制(Pseudo-feedbackinhibition)假反饋抑制是指結(jié)構(gòu)類似物引起的反饋抑制順序反饋抑制(Sequentialfeedbackinh17Chapter2L-谷氨酸Chapter2L-谷氨酸18谷氨酸的生物合成途徑生成谷氨酸的主要酶反應(yīng)谷氨酸生物合成的理想途徑谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑谷氨酸的生物合成途徑生成谷氨酸的主要酶反應(yīng)19谷氨酸的生物合成包括糖酵解作用（glycolysis,EMP途徑）戊糖磷酸途徑（pentosephosphatepathway，HMP途徑）三羧酸循環(huán)（tricarboxylicacidcycle，TCA循環(huán)）乙醛酸循環(huán)(glyoxylatecycle)丙酮酸羧化支路（CO2固定反應(yīng)）等谷氨酸的生物合成包括20生成谷氨酸的主要酶反應(yīng)谷氨酸脫氫酶（GHD）所催化的還原氨基化反應(yīng)轉(zhuǎn)氨酶（AT）催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生成谷氨酸的主要酶反應(yīng)谷氨酸脫氫酶（GHD）所催化的還原氨基21谷氨酸脫氫酶（GHD）所催化的還原氨基化反應(yīng)谷氨酸脫氫酶（GHD）所催化的還原氨基化反應(yīng)22轉(zhuǎn)氨酶（AT）催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)轉(zhuǎn)氨酶（AT）催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)23谷氨酸合成酶（GS）催化的反應(yīng)生成谷氨酸的主要酶反應(yīng)谷氨酸合成酶（GS）催化的反應(yīng)生成谷氨酸的主要酶反應(yīng)24谷氨酸合成酶（GS）催化的反應(yīng)谷氨酸合成酶（GS）催化的反應(yīng)25由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途徑谷氨酸生物合成的理想途徑由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途徑谷氨酸生物合成的理想途徑26

C6H12O6+NH3+3/2O2C5H9O4N+CO2+3H2O谷氨酸生物合成的理想途徑C6H12O6+NH3+3/2O227由上述谷氨酸生物合成的理想途徑可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的總反應(yīng)方程式為：C6H12O6+NH3+1.5O2C5H9O4N+CO2+3H2O由于1摩爾葡萄糖可以生成1摩爾的谷氨酸，因此理論糖酸轉(zhuǎn)化率為81.7%。由上述谷氨酸生物合成的理想途徑可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的28谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑29葡萄糖首先經(jīng)EMP及HMP兩個(gè)途徑生成丙酮酸。其中以EMP途徑為主，生物素充足時(shí)HMP所占比例是38%，控制生物素亞適量，發(fā)酵產(chǎn)酸期，EMP所占的比例更大，HMP所占比例約為26%。生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脫氫酶系的作用下氧化脫羧生成乙酰CoA，另一部分經(jīng)CO2固定反應(yīng)生成草酰乙酸或蘋(píng)果酸，催化CO2固定反應(yīng)的酶有丙酮酸羧化酶、蘋(píng)果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。草酰乙酸與乙酰CoA在檸檬酸合成酶催化作用下，縮合成檸檬酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，檸檬酸在順烏頭酸酶的作用下生成異檸檬酸，異檸檬酸再在異檸檬酸脫氫酶的作用下生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前體。α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶作用下經(jīng)還原氨基化反應(yīng)生成谷氨酸谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑葡萄糖首先經(jīng)EMP及HMP兩個(gè)途徑生成丙酮酸。其中以EMP途30控制谷氨酸合成的重要措施α-酮戊二酸氧化能力微弱，即α-酮戊二酸脫氫酶活力微弱谷氨酸產(chǎn)生菌糖代謝的一個(gè)重要特征就是α-酮戊二酸氧化能力微弱。喪失α-酮戊二酸脫氫酶的重要性已經(jīng)用要求生物素和不分泌谷氨酸的大腸桿菌得以證明。甚至發(fā)現(xiàn)不要求生物素的一株喪失α-酮戊二酸脫氫酶的突變株，能分泌2.3g/L谷氨酸，而其親株卻什么也不分泌。谷氨酸產(chǎn)生菌的α-酮戊二酸氧化力微弱。尤其在生物素缺乏條件下，三羧酸循環(huán)到達(dá)α-酮戊二酸時(shí)，即受到阻擋。把糖代謝流阻止在α-酮戊二酸的堰上，對(duì)導(dǎo)向谷氨酸形成具有重要意義。在銨離子存在下，α-酮戊二酸因谷氨酸脫氫酶的催化作用，經(jīng)還原氨基化反應(yīng)生成谷氨酸。谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑控制谷氨酸合成的重要措施谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑31谷氨酸脫氫酶活性強(qiáng)谷氨酸脫氫酶活性強(qiáng)32細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性高谷氨酸的分泌可降低細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物的濃度，消除了谷氨酸轉(zhuǎn)化成其它代謝物的可能，減低了對(duì)谷氨酸脫氫酶的抑制，并使谷氨酸的生成途徑暢通。由生物素亞適量可造成細(xì)胞膜對(duì)產(chǎn)物的高通透性。生物素改變細(xì)胞膜通透性的機(jī)制與影響細(xì)胞膜磷脂的含量及成分有關(guān)。還可通過(guò)添加表面活性劑、高級(jí)飽和脂肪酸，或青霉素等控制細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性。通過(guò)選育溫度敏感突變株、油酸缺陷型或甘油缺陷型等突變株也可控制細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性。細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性高33CO2固定酶系活力強(qiáng)Citratesynthase,Aconitase,ICDH,GDH酶活力強(qiáng)乙醛酸循環(huán)弱異檸檬酸裂解酶活力欠缺或微弱α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱CO2固定酶系活力強(qiáng)Citratesynthase,Ac34乙醛酸循環(huán)的作用谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑乙醛酸循環(huán)途徑可看作三羧酸循環(huán)的支路和中間產(chǎn)物的補(bǔ)給途徑在菌體生長(zhǎng)期之后，進(jìn)入谷氨酸生成期，為了大量生成、積累谷氨酸，最好沒(méi)有異檸檬酸裂解酶催化反應(yīng)，封閉乙醛酸循環(huán)乙醛酸循環(huán)的作用谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑乙醛酸循環(huán)途徑可看作三羧35谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制優(yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié)糖代謝的調(diào)節(jié)氮代謝的調(diào)節(jié)谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制優(yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié)36優(yōu)先合成黃色短桿菌中谷氨酸的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制α-酮戊二酸合成后由于α-酮戊二酸脫氫酶活性微弱，谷氨酸脫氫酶的活力很強(qiáng)，故優(yōu)先合成谷氨酸。優(yōu)先合成黃色短桿菌中谷氨酸的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制α-酮戊二酸合成后由37反饋調(diào)節(jié)黃色短桿菌中谷氨酸的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制1-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2-檸檬酸合成酶3-異檸檬酸脫氫酶4-α-酮戊二酸脫氫酶5-谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)黃色短桿菌中谷氨酸的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制1-磷酸烯醇式丙酮酸38優(yōu)先合成

谷氨酸比天冬氨酸優(yōu)先合成，谷氨酸合成過(guò)量后，就會(huì)抑制和阻遏自身的合成途徑，使代謝轉(zhuǎn)向合成天冬氨酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的調(diào)節(jié)

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO2固定反應(yīng)的關(guān)鍵酶，受天冬氨酸的反饋抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反饋?zhàn)瓒魞?yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié)優(yōu)先合成優(yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié)39檸檬酸合成酶的調(diào)節(jié)

檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，除受能荷調(diào)節(jié)外，還受谷氨酸的反饋?zhàn)瓒艉蜑躅^酸的反饋抑制異檸檬酸脫氫酶的調(diào)節(jié)

細(xì)胞內(nèi)α-酮戊二酸的量與異檸檬酸的量需維持平衡，當(dāng)α-酮戊二酸過(guò)量時(shí)對(duì)異檸檬酸脫氫酶發(fā)生反饋抑制作用，停止合成α-酮戊二酸優(yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié)檸檬酸合成酶的調(diào)節(jié)優(yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié)40α-酮戊二酸脫氫酶的調(diào)節(jié)

在谷氨酸產(chǎn)生菌中，α-酮戊二酸脫氫酶活性微弱谷氨酸脫氫酶的調(diào)節(jié)

谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶存在著反饋抑制和反饋?zhàn)瓒艄劝彼岜忍於彼醿?yōu)先合成，谷氨酸合成過(guò)量后，就會(huì)抑制和阻遏自身的合成途徑，使代謝轉(zhuǎn)向合成天冬氨酸。α-酮戊二酸合成后由于α-酮戊二酸脫氫酶活性微弱，谷氨酸脫氫酶的活力很強(qiáng)，故優(yōu)先合成谷氨酸優(yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié)α-酮戊二酸脫氫酶的調(diào)節(jié)優(yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié)41糖代謝的調(diào)節(jié)能荷細(xì)胞所處的能量狀態(tài)用ATP、ADP和AMP之間的關(guān)系來(lái)表示，稱為能荷（energycharge）能荷值在0和1之間變動(dòng)。已知大多數(shù)細(xì)胞的能荷處于0.80到0.95之間，處于一種動(dòng)態(tài)平衡）糖代謝的調(diào)節(jié)能荷能荷值在0和1之間變動(dòng)。已知大多數(shù)細(xì)胞的42糖代謝的調(diào)節(jié)能荷控制能量生成代謝系的調(diào)節(jié)如圖所示，當(dāng)生物體內(nèi)即能荷降低，就會(huì)激活某些催化糖類分解的酶或解除ATP對(duì)這些酶的抑制（如糖元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶等），并抑制糖元合成的酶（如糖元合成酶、果糖-1,6-二磷酸酯酶等），從而加速糖酵解、TCA循環(huán)產(chǎn)生能量，通過(guò)氧化磷酸化作用生成ATP。當(dāng)能荷高時(shí)，就會(huì)抑制糖元降解、糖酵解和TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶，如糖元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶，并激活糖類合成的酶，如糖元合成酶和果糖-1,6-二磷酸酯酶，從而抑制糖的分解，加速糖元的合成。

1-磷酸果糖激酶2-果糖1,6-二磷酸酯酶3-檸檬酸合成酶4-異檸檬酸脫氫酶5-反丁烯二酸酶6-乙酰CoA羧化酶7-糖原磷酸化酶8-糖原合成酶糖代謝的調(diào)節(jié)能荷控制能量生成代謝系的調(diào)節(jié)如圖所示，當(dāng)生物體內(nèi)43糖代謝的調(diào)節(jié)生物素對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)生物素對(duì)糖代謝速率的影響

生物素對(duì)糖代謝速率的影響，主要是影響糖降解速率，而不是影響EMP與HMP途徑的比率。在生物素充足條件下，丙酮酸以后的氧化活性雖然也有提高，但由于糖降解速率顯著提高，打破了糖降解速率與丙酮酸氧化速率之間的平衡，丙酮酸趨于生成乳酸的反應(yīng)，因而會(huì)引起乳酸的溢出生物素對(duì)CO2固定反應(yīng)的影響生物素是丙酮酸羧化酶的輔酶，參與CO2固定反應(yīng)，據(jù)報(bào)道，生物素大過(guò)量時(shí)（100g/L以上），CO2固定反應(yīng)可提高30%糖代謝的調(diào)節(jié)生物素對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)44糖代謝的調(diào)節(jié)生物素對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)生物素對(duì)乙醛酸循環(huán)的影響乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶異檸檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，為醋酸所誘導(dǎo)以葡萄糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時(shí)，通過(guò)控制生物素亞適量，幾乎看不到異檸檬酸裂解酶的活性。原因是丙酮酸氧化能力下降，醋酸的生成速度慢，所以為醋酸所誘導(dǎo)形成的異檸檬酸裂解酶就很少由于異檸檬酸裂解酶受琥珀酸阻遏，在生物素亞適量條件下，因琥珀酸氧化能力降低而積累的琥珀酸就會(huì)反饋抑制該酶的活性，并阻遏該酶的合成，乙醛酸循環(huán)基本上是封閉的，代謝流向異檸檬酸→α-酮戊二酸→谷氨酸的方向高效率地移動(dòng)糖代謝的調(diào)節(jié)生物素對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)45氮代謝的調(diào)節(jié)控制谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵之一就是降低蛋白質(zhì)的合成能力，使合成的谷氨酸不去轉(zhuǎn)化成其它氨基酸和參與蛋白質(zhì)的合成在生物素亞適量時(shí)，幾乎沒(méi)有異檸檬酸裂解酶活力，琥珀酸氧化力弱，蘋(píng)果酸和草酰乙酸脫羧反應(yīng)停滯，同時(shí)又由于完全氧化降低的結(jié)果，使ATP形成量減少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成活動(dòng)停滯，在銨離子適量存在下，使得菌體生成積累谷氨酸生成的谷氨酸也不通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用生成其它氨基酸和合成蛋白質(zhì)在生物素充足條件下，異檸檬酸裂解酶活力增強(qiáng)，琥珀酸氧化力增強(qiáng)，丙酮酸氧化力加強(qiáng)，乙醛酸循環(huán)的比例增加，草酸乙酸、蘋(píng)果酸脫羧反應(yīng)增強(qiáng)，蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)，谷氨酸減少，合成的谷氨酸通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用生成的其它氨基酸量增加氮代謝的調(diào)節(jié)控制谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵之一就是降低蛋白質(zhì)的合成能力46谷氨酸細(xì)胞膜滲透性的控制細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)控制細(xì)胞膜滲透性的方法谷氨酸細(xì)胞膜滲透性的控制細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)47氨基酸代謝控制發(fā)酵機(jī)制及育種策略課件48細(xì)胞膜的脂質(zhì)主要是磷脂，每一個(gè)磷脂分子由一個(gè)帶正電荷且能溶于水的極性頭和一個(gè)不帶電荷、不溶于水的非極性尾所構(gòu)成,極性頭朝向膜的內(nèi)外兩個(gè)表面，呈親水性；而非極性的疏水尾則埋藏在膜的內(nèi)層，從而形成一個(gè)磷脂雙分子層。膜內(nèi)的蛋白質(zhì)有的是酶，有的是攜帶胞外物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的載體蛋白，鑲嵌或埋在脂質(zhì)雙層內(nèi)或附著在它的表面，主要分為嵌入蛋白和表在蛋白。有的嵌入蛋白是糖蛋白，它的糖鏈主要朝向外表面。細(xì)胞膜是一個(gè)選擇性半滲透性膜，它的重要生理功能是控制細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的運(yùn)送和交換，是細(xì)胞同外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換和信息交流的接觸面。通過(guò)改變細(xì)胞膜的組成成分可改變膜的滲透性。細(xì)胞膜的脂質(zhì)主要是磷脂，每一個(gè)磷脂分子由一個(gè)帶正電荷且能溶于49控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成生物素缺陷型使用生物素缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，通過(guò)限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的濃度控制脂肪酸生物合成，從而控制磷脂的合成作用機(jī)制：生物素作為催化脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶，參與了脂肪酸的合成，進(jìn)而影響磷脂的合成。當(dāng)磷脂合成減少到正常量的一半左右時(shí)，細(xì)胞變形，谷氨酸向膜外漏出，積累于發(fā)酵液中控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成50控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成添加表面活性劑使用生物素過(guò)量的原料（如糖蜜等）發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時(shí)，通過(guò)添加表面活性劑（如吐溫60）或是高級(jí)飽和脂肪酸（C16～18）及其親水聚醇酯類，同樣能清除滲透障礙物，大量積累谷氨酸作用機(jī)制：表面活性劑、高級(jí)飽和脂肪酸的作用，并不在于它的表面效果，而是在不飽和脂肪酸的合成過(guò)程中，作為生物素的拮抗物具有抑制脂肪酸的合成作用。通過(guò)拮抗脂肪酸的生物合成，導(dǎo)致磷脂合成不足，結(jié)果形成磷脂不足的細(xì)胞膜，提高了細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的滲透性控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成51控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成油酸缺陷型使用油酸缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，通過(guò)限制發(fā)酸培養(yǎng)基中油酸的濃度而控制磷脂的合成。作用機(jī)制：由于油酸缺陷突變株阻斷了油酸的后期合成，喪失了自身合成油酸的能力；即喪失脂肪酸生物合成能力，必須由外界供給油酸，才能生長(zhǎng)。故油酸含量的多少，直接影響到磷脂合成量的多少和細(xì)胞膜的滲透性；通過(guò)控制油酸亞適量，使磷脂合成量減少到正常量的1/2左右時(shí)，細(xì)胞變形，谷氨酸分泌于細(xì)胞外控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成52控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成甘油缺陷型使用甘油缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，通過(guò)限制發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油的濃度而控制磷脂的合成作用機(jī)制：甘油缺陷突變株的遺傳阻礙是喪失α-磷酸甘油脫氫酶，所以自身不能合成α-磷酸甘油和磷脂，必須由外界供給甘油才能生長(zhǎng)。在甘油限量供應(yīng)下，由于控制了細(xì)胞膜中與滲透性有直接關(guān)系的磷脂含量，從而使谷氨酸得以積累控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成53控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成溫度敏感突變株溫度敏感突變株是通過(guò)誘變得到的在低溫下生長(zhǎng)，而在高溫下卻不能生長(zhǎng)繁殖的突變株。利用溫度敏感突變株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時(shí)，由于僅控制溫度就能實(shí)現(xiàn)谷氨酸生產(chǎn)，所以又把這種新工藝稱為物理控制方法。作用機(jī)制：溫度敏感突變株的突變位置是發(fā)生在決定與谷氨酸分泌有密切關(guān)系的細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)基因上，發(fā)生堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，這樣為基因所指導(dǎo)譯出的酶，在高溫時(shí)失活，導(dǎo)致細(xì)胞膜某些結(jié)構(gòu)的改變控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成54控制細(xì)胞壁的合成通過(guò)控制細(xì)胞壁的合成，形成不完全的細(xì)胞壁，進(jìn)而導(dǎo)致形成不完全的細(xì)胞膜，間接控制細(xì)胞膜通透性。這可以通過(guò)在發(fā)酵對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的早期，添加青霉素或頭孢霉素C等抗生素來(lái)實(shí)現(xiàn)。作用機(jī)制：添加青霉素是抑制谷氨酸產(chǎn)生菌細(xì)胞壁的后期合成，主要是抑制糖肽轉(zhuǎn)肽酶，影響細(xì)胞壁糖肽的生物合成控制細(xì)胞壁的合成通過(guò)控制細(xì)胞壁的合成，形成不完全的細(xì)胞壁，進(jìn)55日常菌種工作定期分純

一般1～2個(gè)月分純—次，把產(chǎn)酸高、生長(zhǎng)快、無(wú)噬菌體感染的菌株挑選出來(lái)小劑量誘變刺激用紫外線(10～20s)、通電、激光等輕微處理，可以淘汰生長(zhǎng)微弱的菌株，并能激發(fā)溶原性噬菌體，使挑選出來(lái)的菌是產(chǎn)酸高、生長(zhǎng)旺盛、無(wú)噬菌體感染的優(yōu)良菌株高產(chǎn)菌制做安瓿管通過(guò)誘變育種或分純挑出來(lái)的高產(chǎn)菌株，要馬上做安瓿管，防止菌種變異日常菌種工作定期分純56谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種策略（進(jìn)通節(jié)堵出）選育耐高滲透壓菌種選育不分解利用谷氨酸的突變株選育細(xì)胞膜滲透性好的突變株選育強(qiáng)化CO2固定反應(yīng)的突變株選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株選育強(qiáng)化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到-酮戊二酸代謝的突變株選育解除谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株選育強(qiáng)化能量代謝的突變株選育減弱HMP途徑后段酶活性的突變株谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種策略（進(jìn)通節(jié)堵出）選育耐高滲透壓菌種57選育耐高滲透壓菌種耐高糖突變株選育在含20％～30％葡萄糖的平板上生長(zhǎng)好的突變株耐高谷氨酸突變株選育在含15％～20％味精的平板上生長(zhǎng)好的突變株耐高糖、高谷氨酸突變株選育在含20％葡萄糖和15％味精的平板上生長(zhǎng)好的突變株選育耐高滲透壓菌種耐高糖突變株58選育不分解利用谷氨酸的突變株谷氨酸發(fā)酵，目的是積累谷氨酸如果菌種一邊合成谷氨酸，一邊分解利用谷氨酸，就達(dá)不到積累谷氨酸的目的所以必須使菌種不能分解利用谷氨酸，切斷-酮戊二酸繼續(xù)向下氧化的反應(yīng)，即選育以谷氨酸為唯一碳源菌體不長(zhǎng)或生長(zhǎng)微弱的突變株選育不分解利用谷氨酸的突變株谷氨酸發(fā)酵，目的是積累谷氨酸59選育細(xì)胞膜滲透性好的突變株

谷氨酸產(chǎn)生菌細(xì)胞膜滲透性的改變是發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸的關(guān)鍵抗Vp類衍生物

據(jù)有關(guān)資料報(bào)道，抗Vp類衍生物如香豆素、蘆丁等能遺傳性地改變細(xì)胞膜的滲透性選育溶菌酶敏感性突變株選育二氨基庚二酸缺陷突變株選育溫度敏感突變株選育細(xì)胞膜滲透性好的突變株谷氨酸產(chǎn)生菌細(xì)胞膜滲透性的改60選育強(qiáng)化CO2固定反應(yīng)的突變株選育以琥珀酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快、大的菌株以琥珀酸為唯一碳源，菌體要想生長(zhǎng)，碳代謝必須走四碳二羧酸的脫羧反應(yīng)。菌休生長(zhǎng)越快，四碳二羧酸的脫羧反應(yīng)越強(qiáng)，而四碳二羧酸的脫羧反應(yīng)與二氧化碳固定反應(yīng)是相同酶所催化的，所以以琥珀酸為唯一碳源，菌體長(zhǎng)得越好，二氧化碳固定反應(yīng)越強(qiáng)選育氟丙酮酸敏感性突變株氟丙酮酸是丙酮酸脫氫酶的抑制劑，菌種對(duì)氟丙酮酸越敏感，說(shuō)明菌種丙酮酸向乙酰CoA的轉(zhuǎn)化反應(yīng)越弱，相對(duì)地CO2固定反應(yīng)比例也就越大選育丙酮酸缺陷、天冬氨酸缺陷突變株克隆丙酮酸羧化酶基因選育強(qiáng)化CO2固定反應(yīng)的突變株選育以琥珀酸為唯一碳源的培養(yǎng)基61選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株選育琥珀酸敏感型突變株琥珀酸是乙醛酸循環(huán)關(guān)鍵酶異檸檬酸裂解酶的阻遏物，菌種對(duì)琥珀酸越敏感，異檸檬酸裂解酶的合成能力越弱，乙醛酸循環(huán)就越弱

選育不利用乙酸的突變株利用基因工程技術(shù)，使異檸檬酸裂解酶活力降低選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株選育琥珀酸敏感型突變株62選育強(qiáng)化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到-酮戊二酸代謝的突變株選育檸檬酸合成酶強(qiáng)的突變株檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，強(qiáng)化該酶能加強(qiáng)谷氨酸的生物合成

選育抗氟乙酸、氟化鈉、氮絲氨酸和氟檸檬酸等突變株抗氟乙酸、氟化鈉、氮絲氨酸和氟檸檬酸都是烏頭酸酶的抑制劑，抗這些物質(zhì)的突變株，可強(qiáng)化烏頭酸酶的活力

選育強(qiáng)化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到-酮戊二酸代謝的突變株選育檸63選育解除谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株選育耐高谷氨酸的突變株選育谷氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株，如谷氨酸氧肟酸鹽抗性突變株選育谷氨酰胺抗性突變株選育解除谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株選育耐高谷氨酸的64選育強(qiáng)化能量代謝的突變株

谷氨酸高產(chǎn)菌的兩個(gè)顯著持點(diǎn)：-酮戊二酸繼續(xù)向下氧化的能力缺陷和乙醛酸循環(huán)弱，使能量代謝受阻；TCA循環(huán)前一階段的代謝減慢。強(qiáng)化能量代謝，可補(bǔ)救上述兩點(diǎn)不足，使TCA循環(huán)前一段代謝加強(qiáng)，谷氨酸合成的速度加快

選育呼吸抑制劑抗性突變株可選育丙二酸、氧化丙二酸、氰化鉀、氰化鈉抗性突變株

選育ADP磷酸化抑制劑抗性突變株可選育2,4-二硝基酚、羥胺、砷、胍等抗性突變株

選育抑制能量代謝的抗生素的抗性突變株可選育纈氨霉素、寡霉素等抗性突變株

選育強(qiáng)化能量代謝的突變株65選育減弱HMP途徑后段酶活性的突變株選育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促進(jìn)生長(zhǎng)的突變株選育抗嘌呤、嘧啶類似物的突變株選育抗核苷酸類抗生素突變抹，如德夸菌素、狹雷素C抗性突變株選育減弱HMP途徑后段酶活性的突變株選育莽草酸缺陷型或添加芳66Chapter3L-亮氨酸

Chapter3L-亮氨酸

67L-亮氨酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制L-亮氨酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制68丙酮酸是合成L-纈氨酸和L-亮氨酸的共同前體物，α-酮基異戊酸是合成L-纈氨酸的直接前體物，又是合成L-亮氨酸間接前體物。催化丙酮酸生成α-酮基異戊酸的酶系，與催化α-酮基丁酸生成α-酮基-β-甲基戊酸的酶系是相同的，這些酶的合成均受到三種支鏈氨基酸的協(xié)同反饋?zhàn)瓒?。其中的乙酰羥基酸合成酶是由丙酮酸合成α-酮基異戊酸的關(guān)鍵（限速）酶，還受到L-纈氨酸的反饋抑制。在由α-酮基異戊酸合成L-亮氨酸過(guò)程中，α-異丙基蘋(píng)果酸合成酶是關(guān)鍵（限速）酶，受到L-亮氨酸的反饋抑制和阻遏。乙酰羥基酸合成酶對(duì)α-酮基丁酸的親和力比對(duì)丙酮酸的高。α-異丙基蘋(píng)果酸合成酶對(duì)α-酮基異戊酸的親和力比支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶對(duì)α-酮基異戊酸的親和力約高十倍。所以，三種支鏈氨基酸生物合成的優(yōu)先順序?yàn)楫惲涟彼?、亮氨酸、纈氨酸。據(jù)此可知，在α-酮基丁酸之前減弱或切斷異亮氨酸的代謝流，對(duì)亮氨酸的優(yōu)先合成有重要作用。丙酮酸是合成L-纈氨酸和L-亮氨酸的共同前體物，α-酮基異戊69L-亮氨酸產(chǎn)生菌的育種策略出發(fā)菌株的選擇目前棒桿菌屬、短桿菌屬的L-亮氨酸生物合成途徑及其調(diào)節(jié)機(jī)制已弄清，以鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonellatyphimurium）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum）、粘質(zhì)賽氏桿菌（Serratiamarcescens）、乳糖發(fā)酵短桿菌（Brevibacteriumlactofermentum）、鈍齒棒桿菌（Corynebacteriumcrenatum）、黃色短桿菌（Brevibacteriumflavum）為出發(fā)菌株，均有選育出L-亮氨酸高產(chǎn)菌的文獻(xiàn)報(bào)道

L-亮氨酸產(chǎn)生菌的育種策略出發(fā)菌株的選擇70切斷進(jìn)一步代謝途徑要大量積累L-亮氨酸，需切斷或減弱亮氨酸進(jìn)一步向下代謝的途徑，使合成的亮氨酸不再被消耗，如選育以L-亮氨酸為唯一碳源不能生長(zhǎng)或生長(zhǎng)微弱的突變株切斷進(jìn)一步代謝途徑71解除反饋抑制與阻遏解除三種支鏈氨基酸對(duì)生物合成途徑上的乙酰羥基酸合成酶等3個(gè)共用酶的協(xié)同反饋?zhàn)瓒糇饔媒獬齃-纈氨酸對(duì)乙酰羥基酸合成酶的反饋抑制作用解除L-亮氨酸對(duì)α-異丙基蘋(píng)果酸合成酶的反饋抑制和阻遏作用以上可通過(guò)使菌體帶上L-亮氨酸和L-纈氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性標(biāo)記(如：2-TAr、α-ABr、β-HLr、Valr等遺傳標(biāo)記)來(lái)實(shí)現(xiàn)解除反饋抑制與阻遏解除三種支鏈氨基酸對(duì)生物合成途徑上的乙酰72減弱或切斷支路代謝，并增加前體物的合成選育異亮氨酸缺陷突變株來(lái)解除3個(gè)共用酶受所到的反饋?zhàn)瓒暨x育磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力減弱、天冬氨酸族氨基酸缺陷等突變株，可增大L-亮氨酸生物合成代謝流，節(jié)約碳源，從而有利于L-亮氨酸產(chǎn)量的提高。選育以琥珀酸為唯一碳源生長(zhǎng)微弱的突變株，即可獲得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力減弱的突變株減弱或切斷支路代謝，并增加前體物的合成選育異亮氨酸缺陷突變73改變菌體的正常代謝篩選磺胺胍抗性標(biāo)記（SGr）菌株，在氨基酸產(chǎn)生菌選育上具有普遍提高產(chǎn)酸能力的作用，關(guān)于其詳細(xì)機(jī)制，尚未見(jiàn)到令人信服的報(bào)道。一般認(rèn)為，磺胺胍是細(xì)菌的生長(zhǎng)因子-對(duì)氨基苯甲酸（PAPA）的結(jié)構(gòu)類似物，而PAPA是葉酸的一個(gè)組分，不少細(xì)菌要求外界提供PAPA以合成其代謝中必不可少的輔酶-四氫葉酸，因而二者起競(jìng)爭(zhēng)性拮抗作用。一旦菌株帶有磺胺胍抗性標(biāo)記，菌體的正常代謝發(fā)生改變，從而導(dǎo)致像氨基酸這樣的代謝產(chǎn)物大量的積累改變菌體的正常代謝篩選磺胺胍抗性標(biāo)記（SGr）菌株，在氨基酸74改變菌體的正常代謝篩選利福平抗性（Rifr）菌株有利于L-亮氨酸產(chǎn)量提高，其機(jī)制尚不清楚，可能是通過(guò)改變菌體的正常代謝，使像氨基酸這類的代謝產(chǎn)物大量的積累。利福平為半合成廣譜抗菌素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌以及結(jié)核分支桿菌均有明顯抗菌效應(yīng)。抗菌機(jī)理是：通過(guò)與細(xì)菌RNA聚合酶的β亞基結(jié)合，抑制細(xì)菌RNA聚合酶的活性，妨礙細(xì)菌RNA轉(zhuǎn)錄的啟始。但是RNA轉(zhuǎn)錄一旦開(kāi)始，利福平則不起作用改變菌體的正常代謝篩選利福平抗性（Rifr）菌株有利于L-亮75利用基因工程技術(shù)構(gòu)建L-亮氨酸工程菌基因工程技術(shù)主要通過(guò)目的基因擴(kuò)增，增加生物合成途徑中的限速酶，以提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。從L-亮氨酸生物合成途徑及代謝調(diào)節(jié)機(jī)制可知，α-異丙基蘋(píng)果酸合成酶是L-亮氨酸生物合成途徑中真正意義上的限速酶，將編碼該酶的基因克隆到L-亮氨酸產(chǎn)生菌中，增加該酶的數(shù)量，以解除其“瓶頸”的限速作用，從而提高L-亮氨酸的產(chǎn)量利用基因工程技術(shù)構(gòu)建L-亮氨酸工程菌76綜合以上分析，可以推理出L-亮氨酸高產(chǎn)菌可以帶有的遺傳標(biāo)記為天冬氨酸族氨基酸缺陷，如：蛋氨酸缺陷（Met-）、異亮氨酸缺陷（Ile-）等；脯氨酸或丙氨酸缺陷（Ala-）；結(jié)構(gòu)類似物抗性，如：2-噻唑丙氨酸抗性（2-TAr）、α-氨基丁酸抗性(α-ABr)、β-羥基亮氨酸抗性（β-HLr）、亮氨酸氧肟酸鹽抗性（LeuHxr）或纈氨酸抗性（Valr）、磺胺胍抗性(SGr)和利福平抗性(Rifr)等綜合以上分析，可以推理出L-亮氨酸高產(chǎn)菌可以帶有的遺傳標(biāo)記為77氨基酸代謝控制發(fā)酵機(jī)制及育種策略課件78Chapter4L-纈氨酸Chapter4L-纈氨酸79L-纈氨酸的生物合成途徑L-纈氨酸的生物合成途徑80代謝調(diào)節(jié)機(jī)制丙酮酸是L-纈氨酸的直接前體物，催化丙酮酸生成α-乙酰異戊酸的酶系，與催化α-酮基丁酸生成α-酮基-β-甲基戊酸的酶系是相同的。這些酶的合成均受到三種分支鏈氨基酸的協(xié)同阻遏。其中α-乙酰乳酸合成酶是L-纈氨酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，受到L-纈氨酸的反饋抑制。L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸生物合成途徑中的最后一步轉(zhuǎn)氨反應(yīng)都是由同一種轉(zhuǎn)氨酶催化完成的。代謝調(diào)節(jié)機(jī)制81L-纈氨酸高產(chǎn)菌株的育種思路出發(fā)菌株的選擇:目前，世界上利用發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸的出發(fā)菌株有北京棒桿菌（Corynebacteriumpekineise），谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutacium），乳糖發(fā)酵短桿菌[34](Brevibacteriumlactofermentum)，大腸桿菌（Escherichiacoli），黃色短桿菌（Brevibacteriumflavum），粘質(zhì)賽氏桿菌（Serratiamarcescens），芽孢桿菌屬（Bacillus）和埃希氏菌屬（Escherichia）的菌株等，這些菌株均可以作為選育L-纈氨酸生產(chǎn)菌的出發(fā)菌株L-纈氨酸高產(chǎn)菌株的育種思路出發(fā)菌株的選擇:目前，世界上82切斷或改變平行代謝途徑L-纈氨酸和L-異亮氨酸的生物合成途徑是平行進(jìn)行的，L-纈氨酸、L-亮氨酸與L-異亮氨酸的生物合成途徑中共用了三種酶：即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸異構(gòu)還原酶和二羥基脫水酶。選育L-亮氨酸、L-異亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株可以使用于合成三種氨基酸的共用酶系完全用于L-纈氨酸的生物合成，進(jìn)而提高L-纈氨酸的產(chǎn)量。α-酮基異戊酸是合成L-纈氨酸和L-亮氨酸的共同前體物。切斷L-亮氨酸的合成途徑不僅可以節(jié)省碳源而且解除了菌體生成L-纈氨酸酶系的反饋抑制和多價(jià)阻遏，使α-異丙基蘋(píng)果酸合成酶脫敏，顯著提高L-纈氨酸的產(chǎn)量切斷或改變平行代謝途徑L-纈氨酸和L-異亮氨酸的生物合成途83解除菌體自身的反饋調(diào)節(jié)L-纈氨酸合成中的第一個(gè)限速酶—乙酰乳酸合成酶受L-纈氨酸的反饋抑制，同時(shí)L-纈氨酸和L-異亮氨酸的合成酶系受三個(gè)末端：即L-纈氨酸、L-異亮氨酸和L-亮氨酸的多價(jià)阻遏。如果解除乙酰乳酸合成酶的反饋抑制和L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸生物酶系的多價(jià)阻遏，必將大大提高L-纈氨酸的積累?？蛇x育L-纈氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株來(lái)解除L-纈氨酸的反饋調(diào)節(jié)。常用的L-纈氨酸結(jié)構(gòu)類似物有2-噻唑丙氨酸（2-TA）、α-氨基丁酸（α-AB）、氟亮氨酸、正L-纈氨酸等解除菌體自身的反饋調(diào)節(jié)L-纈氨酸合成中的第一個(gè)限速酶—乙酰乳84增加前體物質(zhì)的合成L-纈氨酸生物合成的前體物質(zhì)是丙酮酸，為了積累更多的L-纈氨酸，必須提高丙酮酸的產(chǎn)量，可以選育以琥珀酸為唯一碳源生長(zhǎng)慢、丙氨酸缺陷型以及氟丙酮敏感突變株來(lái)達(dá)到目的增加前體物質(zhì)的合成L-纈氨酸生物合成的前體物質(zhì)是丙酮酸，為85切斷進(jìn)一步代謝途徑要積累大量L-纈氨酸，需切斷或減弱L-纈氨酸進(jìn)一步向下的代謝途徑，使積累的L-纈氨酸不再消耗，可通過(guò)選育不能以L-纈氨酸為唯一碳源生長(zhǎng)，即喪失L-纈氨酸分解能力的突變株來(lái)實(shí)現(xiàn)切斷進(jìn)一步代謝途徑86選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株當(dāng)一個(gè)菌株由于突變而失去某一遺傳性狀之后，經(jīng)過(guò)回復(fù)突變可以再回復(fù)其原有遺傳性狀，這是因?yàn)楫?dāng)某一結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變后，結(jié)構(gòu)基因所編碼的酶就因結(jié)構(gòu)的改變而失活。而經(jīng)過(guò)第二次回復(fù)突變后，該酶的活性中心結(jié)構(gòu)就可以復(fù)原，而調(diào)節(jié)部位結(jié)構(gòu)常常并沒(méi)有回復(fù)，結(jié)果是酶恢復(fù)了活性，但是反饋抑制卻已解除或并不怎么嚴(yán)重因此可以利用選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株來(lái)提高發(fā)酵目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，例如選育α-乙酰乳酸合成酶缺陷突變株的回復(fù)突變株可以解除L-纈氨酸的反饋抑制以及L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸引起的多價(jià)阻遏選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株當(dāng)一個(gè)菌株由于突變而失去某一遺傳性87利用基因工程技術(shù)構(gòu)建L-纈氨酸工程菌

Hoechst和Marquardt等將來(lái)源于大腸桿菌ATCC11303的ilvE基因片段克隆到pBR322質(zhì)粒中，ilvE基因主要編碼L-纈氨酸轉(zhuǎn)氨基酶，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DG30中，所構(gòu)建的工程菌株可以高產(chǎn)L-纈氨酸。Mitsubishi與味之素公司的科研人員等將棒桿菌中編碼乙酰氧肟酸基因的一段特殊的DNA序列插入到質(zhì)粒載體中，再將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到棒桿菌中，所構(gòu)建的工程菌可以高產(chǎn)L-纈氨酸利用基因工程技術(shù)構(gòu)建L-纈氨酸工程菌

Hoechst和Mar88育種標(biāo)記育種目的備注Leu-切斷L-亮氨酸的支路代謝。Ile-切斷L-異亮氨酸的支路代謝。2-TAr解除L-纈氨酸對(duì)乙酰羥基酸合成酶的反饋抑制作用；2-TA是L-亮氨酸和L-纈氨酸的結(jié)構(gòu)類似物。α-ABr解除L-纈氨酸對(duì)乙酰羥基酸合成酶的反饋抑制作用。α-AB是L-纈氨酸的結(jié)構(gòu)類似物。SGr增強(qiáng)菌體必需生長(zhǎng)因子四氫葉酸的生物合成，從而促進(jìn)氨基酸的生物合成。SG是對(duì)氨基苯甲酸的結(jié)構(gòu)類似物。育種標(biāo)記育種目的備注Leu-切斷L-亮氨酸的支路代謝89Chapter5L-異亮氨酸Chapter5L-異亮氨酸90L-異亮氨酸的生物合成途徑及代謝調(diào)節(jié)機(jī)制

L-異亮氨酸的生物合成途徑及代謝調(diào)節(jié)機(jī)制

91L-異亮氨酸的生物合成途徑

葡萄糖經(jīng)酵解途徑生成磷酸烯醇式丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸經(jīng)二氧化碳固定反應(yīng)生成四碳二羧酸，經(jīng)氨基化反應(yīng)生成天冬氨酸；天冬氨酸在天冬氨酸激酶催化作用下，生成天冬氨酸半醛；天冬氨酸半醛在高絲氨酸脫氫酶的催化下生成高絲氨酸；高絲氨酸在高絲氨酸激酶的催化下生成蘇氨酸，蘇氨酸經(jīng)蘇氨酸脫氨酶、乙酰羥基酸合成酶和支鏈氨基酸谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶的催化作用，生成L-異亮氨酸。L-異亮氨酸的生物合成途徑

葡萄糖經(jīng)酵解途徑生成磷酸烯醇式丙92L-異亮氨酸的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制微生物合成L-異亮氨酸由于有正常的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，故不能過(guò)量合成，正常的反饋調(diào)節(jié)包括：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反饋抑制天冬氨酸激酶受蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同反饋抑制高絲氨酸脫氫酶受蘇氨酸的反饋抑制和蛋氨酸的反饋?zhàn)瓒籼K氨酸脫氨酶受L-異亮氨酸的反饋抑制乙酰羥基酸合成酶受纈氨酸的反饋抑制分支鏈氨基酸合成酶受三種支鏈氨基酸（L-異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸）的多價(jià)阻遏細(xì)胞內(nèi)蘇氨酸水平的調(diào)節(jié)作用等。L-異亮氨酸的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制微生物合成L-異亮氨酸由于有正常的93L-異亮氨酸產(chǎn)生菌常規(guī)育種思路

L-異亮氨酸產(chǎn)生菌應(yīng)具備的生化特征根據(jù)L-異亮氨酸生物合成途徑及代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，L-異亮氨酸高產(chǎn)菌應(yīng)具備以下生化特征：CO2固定反應(yīng)能力強(qiáng)天冬氨酸合成酶能力強(qiáng)天冬氨酸激酶活力強(qiáng)高絲氨酸脫氫酶活力強(qiáng)蘇氨酸脫氨酶活力強(qiáng)乙酰羥基酸合成酶活力強(qiáng)二氫吡啶-2，6-二羧酸合成酶活力微弱或喪失琥珀酰高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶活力微弱或喪失谷氨酸脫氫酶活力弱。L-異亮氨酸產(chǎn)生菌常規(guī)育種思路

L-異亮氨酸產(chǎn)生菌應(yīng)具備的94切斷或減弱支路代謝

切斷或減弱蛋氨酸的合成支路。蛋氨酸比蘇氨酸優(yōu)先合成，蛋氨酸合成過(guò)量后才使代謝轉(zhuǎn)向合成蘇氨酸，進(jìn)一步合成L-異亮氨酸，因此切斷或減弱蛋氨酸的合成支路有利于高產(chǎn)L-異亮氨酸?？蛇x育蛋氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型Met-或MetL(滲漏突變)切斷或減弱支路代謝

切斷或減弱蛋氨酸的合成支路。蛋氨酸比蘇氨95切斷或削弱賴氨酸合成支路。由圖可以看出，選育賴氨酸缺陷型或滲漏突變株，即切斷或減弱由天冬氨酸半醛（ASA）向賴氨酸的合成支路。一方面可以起到節(jié)省碳源的作用，另一方面可以解除其對(duì)天冬氨酸激酶(AK)的反饋抑制，使代謝流更加流暢，造成異亮氨酸的前體物蘇氨酸大量積累，從而使異亮氨酸的積累量提高切斷或削弱賴氨酸合成支路。由圖可以看出，選育賴氨酸缺陷型或滲96切斷或減弱亮氨酸合成支路。選育亮氨酸缺陷或滲漏突變株，既可以解除亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸對(duì)分支鏈氨基酸生物合成酶系的多價(jià)阻遏，又可以避免不利于異亮氨酸精制操作的副產(chǎn)物氨基酸—正纈氨酸和高異亮氨酸的生成，從而有利于目的產(chǎn)物異亮氨酸的積累。這些副生氨基酸由α-酮丁酸、α-酮-β-甲基戊酸經(jīng)亮氨酸生物合成途徑生成，為亮氨酸所調(diào)節(jié)。所以，對(duì)于異亮氨酸生產(chǎn)菌株來(lái)說(shuō)，如能增加亮氨酸缺陷這一遺傳標(biāo)記，就可以不生成正纈氨酸和高異亮氨酸，從而達(dá)到改良生產(chǎn)菌株的目的切斷或減弱亮氨酸合成支路。選育亮氨酸缺陷或滲漏突變株，既可以97解除菌體自身反饋調(diào)節(jié)

a.選育抗結(jié)構(gòu)類似物突變株選育蘇氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株，如α-氨基-β-羥基戊酸（AHV）抗性、蘇氨酸氧肟酸鹽（ThrHx）抗性突變株，可解除蘇氨酸對(duì)高絲氨酸脫氫酶的反饋抑制。選育賴氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株，如S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)抗性突變株，可解除賴氨酸和蘇氨酸對(duì)天冬氨酸激酶的協(xié)同反饋抑制。選育異亮氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株。蘇氨酸脫氨酶是異亮氨酸生物合成途經(jīng)中的關(guān)鍵酶，受異亮氨酸的反饋抑制。選育α-氨基丁酸抗性（α-ABr）、異亮氨酸氧肟酸鹽抗性(IleHxr)、硫代異亮氨酸抗性(S-Iler)、三氟代亮氨酸抗性(TFLr)、α-噻唑丙氨酸抗性(α-TAr)、鄰甲基-L-蘇氨酸抗性(OMTr)、β-羥基亮氨酸抗性(β-HLr)、α-溴丁酸抗性及D-蘇氨酸抗性突變株，可以遺傳性地解除異亮氨酸對(duì)蘇氨酸脫氨酶的反饋調(diào)節(jié)，從而有利于異亮氨酸的積累。選育蛋氨酸的結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株，如乙硫氨酸（Eth）抗性突變株，可解除蛋氨酸對(duì)高絲氨酸脫氫酶的反饋?zhàn)瓒糇饔?。選育纈氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株，可解除支鏈氨基酸對(duì)乙酰羥基酸合成酶的協(xié)同反饋?zhàn)瓒艉屠i氨酸對(duì)乙酰羥基酸合成酶的反饋抑制。解除菌體自身反饋調(diào)節(jié)

a.選育抗結(jié)構(gòu)類似物突變株98增加前體物的合成增加前體物蘇氨酸的合成增加天冬氨酸的合成增加前體物的合成增加前體物蘇氨酸的合成99切斷進(jìn)一步代謝途徑要大量積累異亮氨酸，需要切斷或減弱異亮氨酸進(jìn)一步向下代謝的途徑，使積累的異亮氨酸不再被消耗。據(jù)報(bào)道，選育不能以異亮氨酸為唯一碳源生長(zhǎng)，即喪失異亮氨酸分解能力的突變株，有助于異亮氨酸的大量積累。切斷進(jìn)一步代謝途徑100謝謝謝謝101氨基酸代謝控制發(fā)酵機(jī)制

及育種策略

徐慶陽(yáng)中國(guó)氨基酸技術(shù)服務(wù)中心氨基酸代謝控制發(fā)酵機(jī)制

及育種策略

徐慶陽(yáng)中國(guó)氨基酸技術(shù)服務(wù)102目錄Chapter1代謝機(jī)制理論基礎(chǔ)Chapter2L-谷氨酸Chapter3L-亮氨酸Chapter4L-纈氨酸Chapter5L-異亮氨酸目錄Chapter1代謝機(jī)制理論基礎(chǔ)103Chapter1代謝機(jī)制理論基礎(chǔ)Chapter1代謝機(jī)制理論基礎(chǔ)104氨基酸發(fā)酵機(jī)制在一般情況下，微生物細(xì)胞只合成本身需要的中間代謝產(chǎn)物，嚴(yán)格防止氨基酸、核苷酸等中間物質(zhì)的大量積累。當(dāng)氨基酸或核苷酸等物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞后，微生物細(xì)胞立即停止該物質(zhì)的合成，一直到所供應(yīng)的養(yǎng)料消耗到很低濃度，微生物細(xì)胞才能重新開(kāi)始進(jìn)行該物質(zhì)的合成。微生物細(xì)胞中這種調(diào)節(jié)控制作用主要靠?jī)蓚€(gè)因素，即參與調(diào)節(jié)的有關(guān)酶的活性和酶量氨基酸發(fā)酵機(jī)制在一般情況下，微生物細(xì)胞只合成本身需要的中間105代謝控制機(jī)制的研究已經(jīng)證明，酶的生物合成受基因和代謝物的雙重控制。一方面，從DNA的分子水平上闡明了酶生物合成的控制機(jī)制，酶的合成像普通蛋白質(zhì)的合成一樣，受到結(jié)構(gòu)基因的控制，由結(jié)構(gòu)基因決定形成酶分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)；另一方面,酶的生物合成還受代謝物（酶反應(yīng)的底物、產(chǎn)物及其類似物）的控制和調(diào)節(jié)。當(dāng)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，酶的生成量可以幾倍乃至幾百倍的數(shù)量增加。相反，某些酶促反應(yīng)的產(chǎn)物，特別是終產(chǎn)物，又能產(chǎn)生阻遏作用，使酶的合成量大大減少。代謝控制機(jī)制的研究已經(jīng)證明，酶的生物合成受基因和代謝物的雙重106參與氨基酸生物合成的關(guān)鍵酶主要有12種：①磷酸果糖激酶；②檸檬酸合成酶；③N-乙酰谷氨酸激酶；④鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨基甲酰酶；⑤天冬氨酸激酶；⑥高絲氨酸脫氫酶；⑦蘇氨酸脫水酶；⑧α-乙酰乳酸合成酶；⑨DAHP（2-酮-3-脫氧-D-阿拉伯糖型庚糖酸-7-磷酸）合成酶；⑩分支酸變位酶；11預(yù)苯酸脫水酶；12預(yù)苯酸脫氫酶。參與氨基酸生物合成的關(guān)鍵酶主要有12種：①磷酸果糖激酶；②檸107一般情況下，與氨基酸生物合成途徑分支點(diǎn)有關(guān)系的分支點(diǎn)酶（branchingenzyme）可以成為關(guān)鍵酶，但關(guān)鍵酶并不都是分支點(diǎn)酶。關(guān)鍵酶的關(guān)鍵效果也只是在特定的氨基酸生物合成過(guò)程中成立，而在其他氨基酸的生物合成過(guò)程中則不成立。例如，α-乙酰乳酸合成酶在纈氨酸生物合成途徑中起主導(dǎo)性的關(guān)鍵酶作用，但在異亮氨酸的生物合成中，起主導(dǎo)性關(guān)鍵作用的卻是蘇氨酸脫水酶。該酶位于α-乙酰乳酸合成酶的前一階段，并且不是分支點(diǎn)酶。一般情況下，與氨基酸生物合成途徑分支點(diǎn)有關(guān)系的分支點(diǎn)酶（br108反饋控制與優(yōu)先合成氨基酸生物合成的基本調(diào)節(jié)機(jī)制有反饋控制（反饋?zhàn)瓒襞c反饋抑制）和在合成途徑分支點(diǎn)處的優(yōu)先合成如圖所示的反饋控制，由催化合成途徑最初反應(yīng)A→B的初始酶受終產(chǎn)物氨基酸E的反饋抑制和合成途徑上各種酶受終產(chǎn)物氨基酸E的反饋?zhàn)瓒艚M成。反饋控制與優(yōu)先合成109優(yōu)先合成底物A經(jīng)分支合成途徑生成兩種終產(chǎn)物E和G，由于a酶的酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于b酶的酶活性，結(jié)果優(yōu)先合成E。E合成達(dá)到一定濃度時(shí)，就會(huì)抑制a酶，使代謝轉(zhuǎn)向合成G。G合成達(dá)到一定濃度時(shí)就會(huì)對(duì)c酶產(chǎn)生抑制作用優(yōu)先合成底物A經(jīng)分支合成途徑生成兩種終產(chǎn)物E和G，由于a酶110平衡合成（balancedsynthesis）底物A經(jīng)分支合成途徑生成兩種終產(chǎn)物E與G，由于a酶的酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于b酶，結(jié)果優(yōu)先合成E。E過(guò)量后就會(huì)抑制a酶，使代謝轉(zhuǎn)向合成G。G過(guò)量后，就會(huì)拮抗或逆轉(zhuǎn)E的反饋抑制作用，結(jié)果代謝流又轉(zhuǎn)向合成E，如此循環(huán)平衡合成（balancedsynthesis）底物A經(jīng)分111微生物體內(nèi)代謝過(guò)程的各種生物化學(xué)反應(yīng)，都是由各種酶來(lái)催化的。按各種酶在代謝調(diào)節(jié)中作用的不同，又可將酶分為以下三類調(diào)節(jié)酶（常稱關(guān)鍵酶，與代謝調(diào)節(jié)關(guān)系密切）變構(gòu)酶：通過(guò)酶分子構(gòu)象的變化來(lái)改變酶活性的一類酶同功酶：具有同一種酶的底物專一性，但分子結(jié)構(gòu)不同的一類酶多功能酶：能夠催化兩種以上不同反應(yīng)的一類酶靜態(tài)酶一般與代謝調(diào)節(jié)關(guān)系不大的一類酶潛在酶指酶原、非活性型或與抑制劑結(jié)合的酶微生物體內(nèi)代謝過(guò)程的各種生物化學(xué)反應(yīng)，都是由各種酶來(lái)催化的。112同功酶酶I和酶Ⅱ都是催化A→B的同功酶。G過(guò)量時(shí)，酶Ⅱ停止活動(dòng)，C也不能經(jīng)過(guò)F到G與此同時(shí)，酶I活力不受影響，A可以順利地到E，從而使G過(guò)量，但并不干擾E的合成同功酶113反饋抑制與反饋?zhàn)瓒舻谋容^項(xiàng)目類型反饋?zhàn)瓒舴答佉种瓶刂茖?duì)象酶的生物合成酶的活性控制量終產(chǎn)物濃度終產(chǎn)物濃度控制的水平DNA→mRNA→酶蛋白酶蛋白的構(gòu)象變化控制裝置終產(chǎn)物與阻遏蛋白的親和力終產(chǎn)物與變構(gòu)部位的親和力控制裝置的動(dòng)作阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，通過(guò)變構(gòu)效應(yīng)，酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化不能合成mRNA形成的控制開(kāi)、關(guān)控制控制酶活性大小反應(yīng)遲緩、粗的控制迅速、精確的控制代謝途徑無(wú)定向代謝途徑和合成代謝途徑分支點(diǎn)等無(wú)定向代謝途徑和合成代謝途徑分支點(diǎn)等細(xì)胞經(jīng)濟(jì)高分子化合物(酶蛋白)低分子化合物(酶反應(yīng)生成物)反饋抑制與反饋?zhàn)瓒舻谋容^項(xiàng)目反饋?zhàn)瓒舴答佉种瓶刂茖?duì)象酶的生物114協(xié)同反饋抑制或稱多價(jià)反饋抑制當(dāng)一條代謝途徑中有兩個(gè)以上終產(chǎn)物時(shí)，任何一個(gè)終產(chǎn)物都不能單獨(dú)抑制途徑第一個(gè)共同的酶促反應(yīng)，但當(dāng)兩者同時(shí)過(guò)剩時(shí)，它們協(xié)同抑制第一個(gè)酶反應(yīng)協(xié)同反饋抑制或稱多價(jià)反饋抑制115合作反饋抑制（Cooperativefeedbackinhibition）合作反饋抑制也可稱為增效反饋抑制（Synergisticfeedbackinhibition）。這種反饋抑制不同于協(xié)同反饋抑制，也不同于積累反饋抑制當(dāng)任何一個(gè)終產(chǎn)物單獨(dú)過(guò)剩時(shí)，只部分地反饋抑制第一個(gè)酶的活性，只有當(dāng)G、E兩個(gè)終產(chǎn)物同時(shí)過(guò)剩存在時(shí)，才能引起強(qiáng)烈抑制，其抑制程度大于各自單獨(dú)存在的和合作反饋抑制（Cooperativefeedbackin116積累反饋抑制（Cumulativefeedbackinhibition）在積累反饋抑制中，每一個(gè)最終產(chǎn)物只單獨(dú)地、部分地抑制共同步驟的第一個(gè)酶，并且各最終產(chǎn)物的抑制作用互不影響。所以幾個(gè)最終產(chǎn)物同時(shí)存在時(shí)，它們的抑制作用是積累的積累反饋抑制（Cumulativefeedbackinh117順序反饋抑制(Sequentialfeedbackinhibition)順序反饋抑制的過(guò)程是：F積累，停止D→E反應(yīng)，減少F的進(jìn)一步合成，更多的D轉(zhuǎn)到G，再由G合成I或K；I積累，抑制G→H的反應(yīng)；K積累，抑制G→J的反應(yīng)，結(jié)果造成G的積累，引起G對(duì)A→B的反饋抑制，使整個(gè)途徑停止假反饋抑制(Pseudo-feedbackinhibition)假反饋抑制是指結(jié)構(gòu)類似物引起的反饋抑制順序反饋抑制(Sequentialfeedbackinh118Chapter2L-谷氨酸Chapter2L-谷氨酸119谷氨酸的生物合成途徑生成谷氨酸的主要酶反應(yīng)谷氨酸生物合成的理想途徑谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑谷氨酸的生物合成途徑生成谷氨酸的主要酶反應(yīng)120谷氨酸的生物合成包括糖酵解作用（glycolysis,EMP途徑）戊糖磷酸途徑（pentosephosphatepathway，HMP途徑）三羧酸循環(huán)（tricarboxylicacidcycle，TCA循環(huán)）乙醛酸循環(huán)(glyoxylatecycle)丙酮酸羧化支路（CO2固定反應(yīng)）等谷氨酸的生物合成包括121生成谷氨酸的主要酶反應(yīng)谷氨酸脫氫酶（GHD）所催化的還原氨基化反應(yīng)轉(zhuǎn)氨酶（AT）催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生成谷氨酸的主要酶反應(yīng)谷氨酸脫氫酶（GHD）所催化的還原氨基122谷氨酸脫氫酶（GHD）所催化的還原氨基化反應(yīng)谷氨酸脫氫酶（GHD）所催化的還原氨基化反應(yīng)123轉(zhuǎn)氨酶（AT）催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)轉(zhuǎn)氨酶（AT）催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)124谷氨酸合成酶（GS）催化的反應(yīng)生成谷氨酸的主要酶反應(yīng)谷氨酸合成酶（GS）催化的反應(yīng)生成谷氨酸的主要酶反應(yīng)125谷氨酸合成酶（GS）催化的反應(yīng)谷氨酸合成酶（GS）催化的反應(yīng)126由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途徑谷氨酸生物合成的理想途徑由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途徑谷氨酸生物合成的理想途徑127

C6H12O6+NH3+3/2O2C5H9O4N+CO2+3H2O谷氨酸生物合成的理想途徑C6H12O6+NH3+3/2O2128由上述谷氨酸生物合成的理想途徑可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的總反應(yīng)方程式為：C6H12O6+NH3+1.5O2C5H9O4N+CO2+3H2O由于1摩爾葡萄糖可以生成1摩爾的谷氨酸，因此理論糖酸轉(zhuǎn)化率為81.7%。由上述谷氨酸生物合成的理想途徑可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的129谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑130葡萄糖首先經(jīng)EMP及HMP兩個(gè)途徑生成丙酮酸。其中以EMP途徑為主，生物素充足時(shí)HMP所占比例是38%，控制生物素亞適量，發(fā)酵產(chǎn)酸期，EMP所占的比例更大，HMP所占比例約為26%。生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脫氫酶系的作用下氧化脫羧生成乙酰CoA，另一部分經(jīng)CO2固定反應(yīng)生成草酰乙酸或蘋(píng)果酸，催化CO2固定反應(yīng)的酶有丙酮酸羧化酶、蘋(píng)果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。草酰乙酸與乙酰CoA在檸檬酸合成酶催化作用下，縮合成檸檬酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，檸檬酸在順烏頭酸酶的作用下生成異檸檬酸，異檸檬酸再在異檸檬酸脫氫酶的作用下生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前體。α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶作用下經(jīng)還原氨基化反應(yīng)生成谷氨酸谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑葡萄糖首先經(jīng)EMP及HMP兩個(gè)途徑生成丙酮酸。其中以EMP途131控制谷氨酸合成的重要措施α-酮戊二酸氧化能力微弱，即α-酮戊二酸脫氫酶活力微弱谷氨酸產(chǎn)生菌糖代謝的一個(gè)重要特征就是α-酮戊二酸氧化能力微弱。喪失α-酮戊二酸脫氫酶的重要性已經(jīng)用要求生物素和不分泌谷氨酸的大腸桿菌得以證明。甚至發(fā)現(xiàn)不要求生物素的一株喪失α-酮戊二酸脫氫酶的突變株，能分泌2.3g/L谷氨酸，而其親株卻什么也不分泌。谷氨酸產(chǎn)生菌的α-酮戊二酸氧化力微弱。尤其在生物素缺乏條件下，三羧酸循環(huán)到達(dá)α-酮戊二酸時(shí)，即受到阻擋。把糖代謝流阻止在α-酮戊二酸的堰上，對(duì)導(dǎo)向谷氨酸形成具有重要意義。在銨離子存在下，α-酮戊二酸因谷氨酸脫氫酶的催化作用，經(jīng)還原氨基化反應(yīng)生成谷氨酸。谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑控制谷氨酸合成的重要措施谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑132谷氨酸脫氫酶活性強(qiáng)谷氨酸脫氫酶活性強(qiáng)133細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性高谷氨酸的分泌可降低細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物的濃度，消除了谷氨酸轉(zhuǎn)化成其它代謝物的可能，減低了對(duì)谷氨酸脫氫酶的抑制，并使谷氨酸的生成途徑暢通。由生物素亞適量可造成細(xì)胞膜對(duì)產(chǎn)物的高通透性。生物素改變細(xì)胞膜通透性的機(jī)制與影響細(xì)胞膜磷脂的含量及成分有關(guān)。還可通過(guò)添加表面活性劑、高級(jí)飽和脂肪酸，或青霉素等控制細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性。通過(guò)選育溫度敏感突變株、油酸缺陷型或甘油缺陷型等突變株也可控制細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性。細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性高134CO2固定酶系活力強(qiáng)Citratesynthase,Aconitase,ICDH,GDH酶活力強(qiáng)乙醛酸循環(huán)弱異檸檬酸裂解酶活力欠缺或微弱α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱CO2固定酶系活力強(qiáng)Citratesynthase,Ac135乙醛酸循環(huán)的作用谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑乙醛酸循環(huán)途徑可看作三羧酸循環(huán)的支路和中間產(chǎn)物的補(bǔ)給途徑在菌體生長(zhǎng)期之后，進(jìn)入谷氨酸生成期，為了大量生成、積累谷氨酸，最好沒(méi)有異檸檬酸裂解酶催化反應(yīng)，封閉乙醛酸循環(huán)乙醛酸循環(huán)的作用谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑乙醛酸循環(huán)途徑可看作三羧136谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制優(yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié)糖代謝的調(diào)節(jié)氮代謝的調(diào)節(jié)谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制優(yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié)137優(yōu)先合成黃色短桿菌中谷氨酸的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制α-酮戊二酸合成后由于α-酮戊二酸脫氫酶活性微弱，谷氨酸脫氫酶的活力很強(qiáng)，故優(yōu)先合成谷氨酸。優(yōu)先合成黃色短桿菌中谷氨酸的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制α-酮戊二酸合成后由138反饋調(diào)節(jié)黃色短桿菌中谷氨酸的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制1-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2-檸檬酸合成酶3-異檸檬酸脫氫酶4-α-酮戊二酸脫氫酶5-谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)黃色短桿菌中谷氨酸的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制1-磷酸烯醇式丙酮酸139優(yōu)先合成

谷氨酸比天冬氨酸優(yōu)先合成，谷氨酸合成過(guò)量后，就會(huì)抑制和阻遏自身的合成途徑，使代謝轉(zhuǎn)向合成天冬氨酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的調(diào)節(jié)

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO2固定反應(yīng)的關(guān)鍵酶，受天冬氨酸的反饋抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反饋?zhàn)瓒魞?yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié)優(yōu)先合成優(yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié)140檸檬酸合成酶的調(diào)節(jié)

檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，除受能荷調(diào)節(jié)外，還受谷氨酸的反饋?zhàn)瓒艉蜑躅^酸的反饋抑制異檸檬酸脫氫酶的調(diào)節(jié)

細(xì)胞內(nèi)α-酮戊二酸的量與異檸檬酸的量需維持平衡，當(dāng)α-酮戊二酸過(guò)量時(shí)對(duì)異檸檬酸脫氫酶發(fā)生反饋抑制作用，停止合成α-酮戊二酸優(yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié)檸檬酸合成酶的調(diào)節(jié)優(yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié)141α-酮戊二酸脫氫酶的調(diào)節(jié)

在谷氨酸產(chǎn)生菌中，α-酮戊二酸脫氫酶活性微弱谷氨酸脫氫酶的調(diào)節(jié)

谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶存在著反饋抑制和反饋?zhàn)瓒艄劝彼岜忍於彼醿?yōu)先合成，谷氨酸合成過(guò)量后，就會(huì)抑制和阻遏自身的合成途徑，使代謝轉(zhuǎn)向合成天冬氨酸。α-酮戊二酸合成后由于α-酮戊二酸脫氫酶活性微弱，谷氨酸脫氫酶的活力很強(qiáng)，故優(yōu)先合成谷氨酸優(yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié)α-酮戊二酸脫氫酶的調(diào)節(jié)優(yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié)142糖代謝的調(diào)節(jié)能荷細(xì)胞所處的能量狀態(tài)用ATP、ADP和AMP之間的關(guān)系來(lái)表示，稱為能荷（energycharge）能荷值在0和1之間變動(dòng)。已知大多數(shù)細(xì)胞的能荷處于0.80到0.95之間，處于一種動(dòng)態(tài)平衡）糖代謝的調(diào)節(jié)能荷能荷值在0和1之間變動(dòng)。已知大多數(shù)細(xì)胞的143糖代謝的調(diào)節(jié)能荷控制能量生成代謝系的調(diào)節(jié)如圖所示，當(dāng)生物體內(nèi)即能荷降低，就會(huì)激活某些催化糖類分解的酶或解除ATP對(duì)這些酶的抑制（如糖元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶等），并抑制糖元合成的酶（如糖元合成酶、果糖-1,6-二磷酸酯酶等），從而加速糖酵解、TCA循環(huán)產(chǎn)生能量，通過(guò)氧化磷酸化作用生成ATP。當(dāng)能荷高時(shí)，就會(huì)抑制糖元降解、糖酵解和TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶，如糖元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶，并激活糖類合成的酶，如糖元合成酶和果糖-1,6-二磷酸酯酶，從而抑制糖的分解，加速糖元的合成。

1-磷酸果糖激酶2-果糖1,6-二磷酸酯酶3-檸檬酸合成酶4-異檸檬酸脫氫酶5-反丁烯二酸酶6-乙酰CoA羧化酶7-糖原磷酸化酶8-糖原合成酶糖代謝的調(diào)節(jié)能荷控制能量生成代謝系的調(diào)節(jié)如圖所示，當(dāng)生物體內(nèi)144糖代謝的調(diào)節(jié)生物素對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)生物素對(duì)糖代謝速率的影響

生物素對(duì)糖代謝速率的影響，主要是影響糖降解速率，而不是影響EMP與HMP途徑的比率。在生物素充足條件下，丙酮酸以后的氧化活性雖然也有提高，但由于糖降解速率顯著提高，打破了糖降解速率與丙酮酸氧化速率之間的平衡，丙酮酸趨于生成乳酸的反應(yīng)，因而會(huì)引起乳酸的溢出生物素對(duì)CO2固定反應(yīng)的影響生物素是丙酮酸羧化酶的輔酶，參與CO2固定反應(yīng)，據(jù)報(bào)道，生物素大過(guò)量時(shí)（100g/L以上），CO2固定反應(yīng)可提高30%糖代謝的調(diào)節(jié)生物素對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)145糖代謝的調(diào)節(jié)生物素對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)生物素對(duì)乙醛酸循環(huán)的影響乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶異檸檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，為醋酸所誘導(dǎo)以葡萄糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時(shí)，通過(guò)控制生物素亞適量，幾乎看不到異檸檬酸裂解酶的活性。原因是丙酮酸氧化能力下降，醋酸的生成速度慢，所以為醋酸所誘導(dǎo)形成的異檸檬酸裂解酶就很少由于異檸檬酸裂解酶受琥珀酸阻遏，在生物素亞適量條件下，因琥珀酸氧化能力降低而積累的琥珀酸就會(huì)反饋抑制該酶的活性，并阻遏該酶的合成，乙醛酸循環(huán)基本上是封閉的，代謝流向異檸檬酸→α-酮戊二酸→谷氨酸的方向高效率地移動(dòng)糖代謝的調(diào)節(jié)生物素對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)146氮代謝的調(diào)節(jié)控制谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵之一就是降低蛋白質(zhì)的合成能力，使合成的谷氨酸不去轉(zhuǎn)化成其它氨基酸和參與蛋白質(zhì)的合成在生物素亞適量時(shí)，幾乎沒(méi)有異檸檬酸裂解酶活力，琥珀酸氧化力弱，蘋(píng)果酸和草酰乙酸脫羧反應(yīng)停滯，同時(shí)又由于完全氧化降低的結(jié)果，使ATP形成量減少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成活動(dòng)停滯，在銨離子適量存在下，使得菌體生成積累谷氨酸生成的谷氨酸也不通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用生成其它氨基酸和合成蛋白質(zhì)在生物素充足條件下，異檸檬酸裂解酶活力增強(qiáng)，琥珀酸氧化力增強(qiáng)，丙酮酸氧化力加強(qiáng)，乙醛酸循環(huán)的比例增加，草酸乙酸、蘋(píng)果酸脫羧反應(yīng)增強(qiáng)，蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)，谷氨酸減少，合成的谷氨酸通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用生成的其它氨基酸量增加氮代謝的調(diào)節(jié)控制谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵之一就是降低蛋白質(zhì)的合成能力147谷氨酸細(xì)胞膜滲透性的控制細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)控制細(xì)胞膜滲透性的方法谷氨酸細(xì)胞膜滲透性的控制細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)148氨基酸代謝控制發(fā)酵機(jī)制及育種策略課件149細(xì)胞膜的脂質(zhì)主要是磷脂，每一個(gè)磷脂分子由一個(gè)帶正電荷且能溶于水的極性頭和一個(gè)不帶電荷、不溶于水的非極性尾所構(gòu)成,極性頭朝向膜的內(nèi)外兩個(gè)表面，呈親水性；而非極性的疏水尾則埋藏在膜的內(nèi)層，從而形成一個(gè)磷脂雙分子層。膜內(nèi)的蛋白質(zhì)有的是酶，有的是攜帶胞外物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的載體蛋白，鑲嵌或埋在脂質(zhì)雙層內(nèi)或附著在它的表面，主要分為嵌入蛋白和表在蛋白。有的嵌入蛋白是糖蛋白，它的糖鏈主要朝向外表面。細(xì)胞膜是一個(gè)選擇性半滲透性膜，它的重要生理功能是控制細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的運(yùn)送和交換，是細(xì)胞同外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換和信息交流的接觸面。通過(guò)改變細(xì)胞膜的組成成分可改變膜的滲透性。細(xì)胞膜的脂質(zhì)主要是磷脂，每一個(gè)磷脂分子由一個(gè)帶正電荷且能溶于150控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成生物素缺陷型使用生物素缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，通過(guò)限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的濃度控制脂肪酸生物合成，從而控制磷脂的合成作用機(jī)制：生物素作為催化脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶，參與了脂肪酸的合成，進(jìn)而影響磷脂的合成。當(dāng)磷脂合成減少到正常量的一半左右時(shí)，細(xì)胞變形，谷氨酸向膜外漏出，積累于發(fā)酵液中控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成151控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成添加表面活性劑使用生物素過(guò)量的原料（如糖蜜等）發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時(shí)，通過(guò)添加表面活性劑（如吐溫60）或是高級(jí)飽和脂肪酸（C16～18）及其親水聚醇酯類，同樣能清除滲透障礙物，大量積累谷氨酸作用機(jī)制：表面活性劑、高級(jí)飽和脂肪酸的作用，并不在于它的表面效果，而是在不飽和脂肪酸的合成過(guò)程中，作為生物素的拮抗物具有抑制脂肪酸的合成作用。通過(guò)拮抗脂肪酸的生物合成，導(dǎo)致磷脂合成不足，結(jié)果形成磷脂不足的細(xì)胞膜，提高了細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的滲透性控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成152控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成油酸缺陷型使用油酸缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，通過(guò)限制發(fā)酸培養(yǎng)基中油酸的濃度而控制磷脂的合成。作用機(jī)制：由于油酸缺陷突變株阻斷了油酸的后期合成，喪失了自身合成油酸的能力；即喪失脂肪酸生物合成能力，必須由外界供給油酸，才能生長(zhǎng)。故油酸含量的多少，直接影響到磷脂合成量的多少和細(xì)胞膜的滲透性；通過(guò)控制油酸亞適量，使磷脂合成量減少到正常量的1/2左右時(shí)，細(xì)胞變形，谷氨酸分泌于細(xì)胞外控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成153控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成甘油缺陷型使用甘油缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，通過(guò)限制發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油的濃度而控制磷脂的合成作用機(jī)制：甘油缺陷突變株的遺傳阻礙是喪失α-磷酸甘油脫氫酶，所以自身不能合成α-磷酸甘油和磷脂，必須由外界供給甘油才能生長(zhǎng)。在甘油限量供應(yīng)下，由于控制了細(xì)胞膜中與滲透性有直接關(guān)系的磷脂含量，從而使谷氨酸得以積累控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成154控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成溫度敏感突變株溫度敏感突變株是通過(guò)誘變得到的在低溫下生長(zhǎng)，而在高溫下卻不能生長(zhǎng)繁殖的突變株。利用溫度敏感突變株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時(shí)，由于僅控制溫度就能實(shí)現(xiàn)谷氨酸生產(chǎn)，所以又把這種新工藝稱為物理控制方法。作用機(jī)制：溫度敏感突變株的突變位置是發(fā)生在決定與谷氨酸分泌有密切關(guān)系的細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)基因上，發(fā)生堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，這樣為基因所指導(dǎo)譯出的酶，在高溫時(shí)失活，導(dǎo)致細(xì)胞膜某些結(jié)構(gòu)的改變控制細(xì)胞膜滲透性的方法控制磷脂的合成155控制細(xì)胞壁的合成通過(guò)控制細(xì)胞壁的合成，形成不完全的細(xì)胞壁，進(jìn)而導(dǎo)致形成不完全的細(xì)胞膜，間接控制細(xì)胞膜通透性。這可以通過(guò)在發(fā)酵對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的早期，添加青霉素或頭孢霉素C等抗生素來(lái)實(shí)現(xiàn)。作用機(jī)制：添加青霉素是抑制谷氨酸產(chǎn)生菌細(xì)胞壁的后期合成，主要是抑制糖肽轉(zhuǎn)肽酶，影響細(xì)胞壁糖肽的生物合成控制細(xì)胞壁的合成通過(guò)控制細(xì)胞壁的合成，形成不完全的細(xì)胞壁，進(jìn)156日常菌種工作定期分純

一般1～2個(gè)月分純—次，把產(chǎn)酸高、生長(zhǎng)快、無(wú)噬菌體感染的菌株挑選出來(lái)小劑量誘變刺激用紫外線(10～20s)、通電、激光等輕微處理，可以淘汰生長(zhǎng)微弱的菌株，并能激發(fā)溶原性噬菌體，使挑選出來(lái)的菌是產(chǎn)酸高、生長(zhǎng)旺盛、無(wú)噬菌體感染的優(yōu)良菌株高產(chǎn)菌制做安瓿管通過(guò)誘變育種或分純挑出