均相時(shí)間分辨熒光技術(shù)課件

均相時(shí)間分辨熒光技術(shù)

張迎春Y217190001

翁德英Y217190032閆利英Y217190031戎微波均相時(shí)間分辨熒光技術(shù)張迎春Y217190001

背景簡介原理應(yīng)用展望

目錄CONCENTS原理應(yīng)用展望CONCENTS2PART01簡介PART01簡介3均相時(shí)間分辨熒光（HTRF，HomogeneousTime-ResolvedFluorescence）是用來檢測純液相體系中待測物的一種常用方法，主要用于高通量藥物篩選，是研究藥物靶標(biāo)的理想平臺(tái)。HTRF技術(shù)使用了鑭系元素（銪和鋱），從而具有非常長的半衰期；同時(shí)，鑭系元素與絡(luò)合的穴相結(jié)合，這種結(jié)合的穴狀物與其它所有使用的螯合物的產(chǎn)品相比，顯著增加了穩(wěn)定性（可耐受低pH值、金屬離子、DMSO、EDTA等）

利用長發(fā)射半衰期的稀土鑭系元素作為供體熒光團(tuán)，HTRF技術(shù)結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，F(xiàn)luorescenceResonanceEnergyTransfer）和時(shí)間分辨熒光（TRF,Time-ResolvedFluorescence）兩種技術(shù)。這種結(jié)合將TRF的低背景特點(diǎn)和FRET的均相實(shí)驗(yàn)方式融合在一起，使得HTRF技術(shù)擁有如下優(yōu)勢：實(shí)驗(yàn)方式靈活、可靠，并且具有更高的靈敏度、穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性率較低背景簡介均相時(shí)間分辨熒光（HTRF，Homoge4鑭的發(fā)現(xiàn)鑭于1839年1月，由在斯德哥爾摩的卡羅林斯卡研究所的卡爾·古斯塔法·莫桑德爾（Carl·Gustaf·Mosander）發(fā)現(xiàn)。他從在1803已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的鈰中提取了它。莫桑德爾注意到他的大多數(shù)氧化鈰樣本不可溶，而有些是可溶的，他推斷這是一種新元素的氧化物。他從鈰中提取出了第二種元素，他稱之為didymium（鐠釹混合物）。然而他沒有意識(shí)到didymium也是混合物，在1885年它被分離成了鐠和釹?？枴す潘顾āつ５聽枺–arl·Gustaf·Mosander）鑭系元素：lanthanideelement鑭以及接著發(fā)現(xiàn)的鉺、鋱打開了發(fā)現(xiàn)稀土元素的第二道大門，是發(fā)現(xiàn)稀土元素的第二階段。他們的發(fā)現(xiàn)是繼鈰和釔兩個(gè)元素后又找到稀土元素中的三個(gè)。鑭以及接著發(fā)現(xiàn)的鉺、鋱打開了發(fā)現(xiàn)稀土元素的第二道大門，是發(fā)現(xiàn)稀土元素的第二階段。他們的發(fā)現(xiàn)是繼鈰和釔兩個(gè)元素后又找到稀土元素中的三個(gè)。

鑭系元素是57～71的15種化學(xué)元素的統(tǒng)稱。包括鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿、镥，它們都是稀土元素的成員。背景簡介——鑭鑭的發(fā)現(xiàn)卡爾·古斯塔法·莫桑德爾（Carl·Gustaf·M5

CisbioBioassays最初在體外診斷方面的成就提供了豐富的免疫化驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，通過與Jean-MarieLehn教授在稀土熒光特性方面研究合作，造就了如今的HTRF技術(shù)。如今，全球各大制藥企業(yè)、藥物研究所和新藥篩選中心都將HTRF作為重要的化合物篩選方法進(jìn)行藥物研發(fā)。讓-馬里·萊恩（Jean-MarieLehn，1939年9月30日出生）是法國化學(xué)家。他于1987年與DonaldCram和CharlesPedersen因?yàn)樗难钆浜衔锏暮铣桑黄皤@得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)讓-馬里·萊恩（Jean-MarieLehn）背景簡介——穴狀配合物CisbioBioassays最初在體外診斷6

穴狀化合物的形成是將一個(gè)陽離子納入到一個(gè)立體籠中?；\能收集光然后將能量轉(zhuǎn)移到核心的鑭系元素。大環(huán)的性質(zhì)有利于跟鑭系元素緊密相連，這種不可破的連接會(huì)形成異常穩(wěn)固的復(fù)合體。穴結(jié)構(gòu)能耐受一些特殊的實(shí)驗(yàn)條件如大量存在的陽離子（Mg2+和Mn2+等）、螯合物（EDTA）、溶劑或者溫度。

從HTRF能應(yīng)用到臨床診斷就能看出它也適用于濃度高的血清在讀板前或者孵育時(shí)加入氟離子能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)對大量化合物的抗干擾性，對實(shí)驗(yàn)沒有干擾而給實(shí)驗(yàn)提供了很大的靈活性。

穴沒有光漂白性，多次讀數(shù)后信號沒有損失，因此能按照需要的次數(shù)去讀，這就給許多動(dòng)力學(xué)檢測提供了可能。專利號：USPatentUS5,527,684

由于在該結(jié)構(gòu)上的貢獻(xiàn)，讓-馬里·萊恩在1987年獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。背景簡介——穴狀配合物穴狀化合物的形成是將一個(gè)陽離子納入到一個(gè)立7PART02HTRF技術(shù)原理PART02HTRF技術(shù)原理8時(shí)間分辨熒光

熒光共振能量轉(zhuǎn)移

HTRF技術(shù)

HTRF技術(shù)特點(diǎn)

HTRF技術(shù)的主要實(shí)驗(yàn)方法

HTRF技術(shù)原理時(shí)間分辨熒光

熒9

在生物溶液或血清中的很多化合物和蛋白質(zhì)是自發(fā)熒光的，利用傳統(tǒng)的快速熒光基團(tuán)進(jìn)行檢測極大限制了實(shí)驗(yàn)靈敏度。使用長壽命的熒光基團(tuán)結(jié)合時(shí)間分辨的檢測方式（在熒光激發(fā)和發(fā)射檢測之間有一個(gè)時(shí)間延遲）可將快速熒光的干擾降到最低。

時(shí)間分辨熒光（TRF）利用稀土元素中鑭系元素的獨(dú)特性質(zhì)。在TRF中常用的鑭系元素是釤（Sm）、銪（Eu）、鋱（Tb）和鏑（Dy）。與傳統(tǒng)熒光基團(tuán)相比，它們具有大的Stoke'sshifts和非常長的發(fā)射半衰期（從微秒到毫秒），這使它們在生物學(xué)熒光應(yīng)用領(lǐng)域中日益重要。一、時(shí)間分辨熒光在生物溶液或血清中的很多化合物和蛋白質(zhì)是自10

通過直接激發(fā)使鑭系元素離子產(chǎn)生熒光是不容易的，因?yàn)檫@些離子很難吸收光子。鑭系元素必須首先與有機(jī)分子形成復(fù)合物，有機(jī)分子收集光子并通過分子內(nèi)非放射過程轉(zhuǎn)移到鑭系元素上。稀土元素螯合物和穴狀配合物是能量收集裝置的典型代表，它們收集能量并轉(zhuǎn)移到鑭系元素離子上，后者則發(fā)出其特征性的長壽命的熒光。

為了能夠成功應(yīng)用于生物學(xué)檢測中，稀土元素復(fù)合物應(yīng)該具有特定的性質(zhì)，包括穩(wěn)定性、較高的發(fā)射光產(chǎn)率，并且能夠與生物分子連接。除此之外，當(dāng)直接在生物溶液中反應(yīng)時(shí)，能夠耐受熒光淬滅就顯得尤為重要。稀土元素螯合物穩(wěn)定性較差，而且有的化合物可競爭螯合物活性基團(tuán)，當(dāng)與FRET技術(shù)結(jié)合在一起時(shí)其靈敏度也受到限制。如果稀土元素與穴狀配合物結(jié)合，許多限制因素都可去除。一、時(shí)間分辨熒光通過直接激發(fā)使鑭系元素離子產(chǎn)生熒光是不容易11

熒光共振能量轉(zhuǎn)移利用兩種熒光基團(tuán)的能量轉(zhuǎn)移，這兩種熒光基團(tuán)分別稱為能量供體（Donor）和能量受體（Acceptor）。能量供體被外來光源激發(fā)（例如氙燈或激光），如果它與能量受體比較接近，可以將能量共振轉(zhuǎn)移到在能量受體上，使其受到激發(fā)，發(fā)出特定波長的發(fā)射光。將能量供體和能量受體分別與相互作用的兩個(gè)生物分子結(jié)合，生物分子的結(jié)合可以將能量供體和能量受體拉到足夠近的距離，產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，由于能量受體的發(fā)射光來自能量轉(zhuǎn)移，所以實(shí)驗(yàn)中不需要將未結(jié)合與已結(jié)合的分子分開，即不需要洗滌步驟。這種均相的實(shí)驗(yàn)方式操作簡單，而且減少了實(shí)驗(yàn)時(shí)間和花費(fèi)。二、熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量轉(zhuǎn)移利用兩種熒光基團(tuán)的能量轉(zhuǎn)移，這兩種熒12熒光共振能量的缺點(diǎn)：然而，這些生物測定法在熒光檢測方面具有很大的缺點(diǎn)，因?yàn)樗粊碜陨⑸浼ぐl(fā)光的背景噪聲顯著抑制，并且受到樣品中共存材料熒光（熒光化合物和粉塵/線）的顯著干擾，使其變得困難以獲得高度敏感的測量而且在FRET實(shí)驗(yàn)中使用的供體和受體是快速熒光基團(tuán)，半衰期非常短，其背景熒光較強(qiáng)。解決方法：背景熒光主要來自于樣品成分，包括緩沖液、蛋白質(zhì)、化合物和細(xì)胞裂解液。檢測到的熒光強(qiáng)度必須對這些自發(fā)熒光進(jìn)行校正，極大地影響了實(shí)驗(yàn)靈敏度，并使數(shù)據(jù)分析變得復(fù)雜。背景熒光非常短暫（壽命為納秒級），可以利用時(shí)間分辨熒光方法將其去除。

二、熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量的缺點(diǎn)：二、熒光共振能量轉(zhuǎn)移13HTRF技術(shù)原理HTRF技術(shù)結(jié)合了FRET和TRF兩種技術(shù)。該技術(shù)是利用了具有穴狀結(jié)構(gòu)的Eu元素的螯和標(biāo)記物和XL665作為一個(gè)供體，是基于Eu穴狀化合物的供體與受體（第二熒光標(biāo)記物）之間的FRET。在FRET中，受體發(fā)射熒光的壽命等同與供體的發(fā)射熒光的壽命。因?yàn)镋u的熒光衰減周期較長，所以含Eu的供體會(huì)誘導(dǎo)XL665受體長時(shí)間地發(fā)射熒光，受體激發(fā)后產(chǎn)生的熒光便能持續(xù)較長時(shí)間，這樣通過TRF就可以區(qū)分那些短壽命的自身散射的熒光，這樣從短壽命熒光背景中就很容易區(qū)分出FRET信號。當(dāng)由于生物分子相互作用導(dǎo)致兩個(gè)熒光基團(tuán)接近時(shí)，在激發(fā)時(shí)被穴狀化合物捕獲的部分能量釋放，發(fā)射波長為620nm；另一部分能量轉(zhuǎn)移到受體上，發(fā)射波長為665nm。665nm的發(fā)射光僅僅由供體引起的FRET產(chǎn)生。所以，當(dāng)生物分子相互作用時(shí)，有兩個(gè)激發(fā)光620nm和665nm；當(dāng)不存在相互作用時(shí)，只有620nm一個(gè)激發(fā)光。三、HTRF技術(shù)原理HTRF技術(shù)原理三、HTRF技術(shù)原理14HTRF技術(shù)的能量供體和能量受體

HTRF的供體是銪穴狀化合物（Eu3+cryptate）（圖a）或Lumi4?鋱穴狀化合物（Tb2+cryptate）（圖b，未發(fā)表結(jié)構(gòu)），后者是近年與Lumiphore公司合作的結(jié)果，激發(fā)效率更高。兩者的能量受體均可為XL665和d2。XL665和d2

激發(fā)波長為620nm，發(fā)射波長為665nm，位于紅外光區(qū)，進(jìn)一步降低了生物溶液對實(shí)驗(yàn)的影響（生物學(xué)成分很少在紅外光區(qū)有自發(fā)熒光）。三、HTRF技術(shù)原理HTRF技術(shù)的能量供體和能量受體

H15能量受體：XL665和

第二代受體d2

XL665是一種105kDa的大型雜六聚體，經(jīng)過分離后交聯(lián)，以便在HTRF分析中獲得更好的穩(wěn)定性并保持其光物理特性。與熒光素不同，它與Eucryptates完全兼容。它是紅移的，其發(fā)射更可能遠(yuǎn)離可能的中等和復(fù)合干擾。

d2

是第二代受體，具有與XL665非常相似的一系列光物理性質(zhì)，但其特征在于比XL665小100倍的有機(jī)結(jié)構(gòu)。作為一個(gè)小得多的實(shí)體，d2限制了在XL665基TR-FRET系統(tǒng)中有時(shí)懷疑的空間位阻問題。這些近紅外受體也特別適用于均相測定，因?yàn)樗鼈兊陌l(fā)射不太可能受到典型復(fù)合篩選過程中出現(xiàn)的內(nèi)在介質(zhì)或化合物自發(fā)熒光的干擾。這些紅色受體的特性也使它們適合與鋱穴合物結(jié)合。此外，由于其發(fā)射光譜中有額外的峰，鋱隱晶質(zhì)可與熒光素等綠色受體偶聯(lián)，在520nm范圍內(nèi)發(fā)射，例如可允許設(shè)計(jì)具有兩個(gè)讀數(shù)的多重測定。三、HTRF技術(shù)原理能量受體：XL665和第二代受體d2三、HTRF技術(shù)原理16HTRF技術(shù)中鑭元素與穴狀配合物的結(jié)合HTRF中使用四種特定的熒光團(tuán)形成不同的TR-FRET系統(tǒng)。中心元素能量供體是銪穴合物。這些稀土配合物基分別具有Eu3+離子或Tb2+緊密嵌入的大環(huán)。這些離子本身不發(fā)熒光;他們需要一個(gè)光收集裝置（即籠）被激發(fā)。與其他發(fā)光鑭系元素技術(shù)中螯合物的功能類似，該籠子作為天線，允許能量收集和轉(zhuǎn)移到離子，最終以特定的熒光模式釋放該能量。特別是，這些穴狀配合物不受影響許多常規(guī)熒光團(tuán)的光漂白，并且離子幾乎與它們的大環(huán)化合物不可分離。然而，由于獨(dú)特的籠狀結(jié)構(gòu)，穴狀化合物的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于這些鑭系元素螯合物。稀土螯合物在酸性介質(zhì)中或存在二價(jià)離子如Mn2+時(shí)會(huì)解離并不穩(wěn)定，而稀土穴合物在寬范圍的化學(xué)條件下非常穩(wěn)定，如在三氟乙酸存在下的反相色譜，并且不受影響通過介質(zhì)中二價(jià)離子的存在。因此，它可以在靈敏度，測定窗口和穩(wěn)定性方面提高檢測性能，同時(shí)不會(huì)影響HTRF為檢測帶來的特性和優(yōu)勢。三、HTRF技術(shù)原理HTRF技術(shù)中鑭元素與穴狀配合物的結(jié)合三、HTRF技術(shù)原理17四、HTRF技術(shù)特點(diǎn)0302060405熒光持續(xù)時(shí)間更久低背景，化合物和培養(yǎng)基的干擾小

均相檢測，不需要洗板），操作簡單

時(shí)間選擇（時(shí)間延遲讀取測量），讀數(shù)穩(wěn)定24小時(shí)以上，甚至可達(dá)7天

校正干擾因素能抵御金屬離子對信號的影響，對酸性溶液、Mg2+、Mn2+、DMSO、EDTA比較耐受

01四、HTRF技術(shù)特點(diǎn)0302060405熒光持續(xù)時(shí)間更久低18HTRF的操作步驟HTRF實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析HTRF操作步驟非常簡單，只需要將實(shí)驗(yàn)所需試劑加進(jìn)去，然后孵育，檢測即可。HTRF采用了比值法來處理數(shù)據(jù)，可以去除溶液通透率、細(xì)胞大小、細(xì)胞數(shù)量不同引起的誤差。五、HTRF技術(shù)實(shí)驗(yàn)方法HTRF的操作步驟HTRF實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析HTRF操作步驟非常簡19PART03應(yīng)用PART03應(yīng)用2001030204G蛋白偶聯(lián)受體研究受體第二信使檢測受體配體結(jié)合胞內(nèi)信號分子檢測

激酶活性檢測胞外激酶活性檢測胞內(nèi)激酶活性檢測

抗體檢測抗體重鏈含量測定抗體輕鏈含量測定

生物標(biāo)志物檢測基于抗體的夾心法競爭法檢測

HTRF技術(shù)的應(yīng)用01030204G蛋白偶聯(lián)受體研究激酶活性檢測抗體檢測生物標(biāo)21免疫過程分析

CD16結(jié)合檢測

CD32結(jié)合檢測

CD64結(jié)合檢測

生物過程分析GST

含量測定

HIS含量測定CHO宿主蛋白含量測定

蛋白修飾蛋白甲基化蛋白乙酰化蛋白泛素化蛋白水解

相互作用分析蛋白-蛋白蛋白-多肽蛋白-DNA蛋白-RNA

05060807HTRF技術(shù)的應(yīng)用免疫過程分析生物過程分析蛋白修飾相互作用分析蛋白-蛋白0522PPT模板下載：/moban/行業(yè)PPT模板：/hangye/節(jié)日PPT模板：/jieri/PPT素材下載：/sucai/PPT背景圖片：/beijing/PPT圖表下載：/tubiao/優(yōu)秀PPT下載：/xiazai/PPT教程：/powerpoint/Word教程：/word/Excel教程：/excel/資料下載：/ziliao/PPT課件下載：/kejian/范文下載：/fanwen/試卷下載：/shiti/教案下載：/jiaoan/字體下載：/ziti/

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張迎春Y217190001

翁德英Y217190032閆利英Y217190031戎微波均相時(shí)間分辨熒光技術(shù)張迎春Y2171900024

背景簡介原理應(yīng)用展望

目錄CONCENTS原理應(yīng)用展望CONCENTS25PART01簡介PART01簡介26均相時(shí)間分辨熒光（HTRF，HomogeneousTime-ResolvedFluorescence）是用來檢測純液相體系中待測物的一種常用方法，主要用于高通量藥物篩選，是研究藥物靶標(biāo)的理想平臺(tái)。HTRF技術(shù)使用了鑭系元素（銪和鋱），從而具有非常長的半衰期；同時(shí)，鑭系元素與絡(luò)合的穴相結(jié)合，這種結(jié)合的穴狀物與其它所有使用的螯合物的產(chǎn)品相比，顯著增加了穩(wěn)定性（可耐受低pH值、金屬離子、DMSO、EDTA等）

利用長發(fā)射半衰期的稀土鑭系元素作為供體熒光團(tuán)，HTRF技術(shù)結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，F(xiàn)luorescenceResonanceEnergyTransfer）和時(shí)間分辨熒光（TRF,Time-ResolvedFluorescence）兩種技術(shù)。這種結(jié)合將TRF的低背景特點(diǎn)和FRET的均相實(shí)驗(yàn)方式融合在一起，使得HTRF技術(shù)擁有如下優(yōu)勢：實(shí)驗(yàn)方式靈活、可靠，并且具有更高的靈敏度、穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性率較低背景簡介均相時(shí)間分辨熒光（HTRF，Homoge27鑭的發(fā)現(xiàn)鑭于1839年1月，由在斯德哥爾摩的卡羅林斯卡研究所的卡爾·古斯塔法·莫桑德爾（Carl·Gustaf·Mosander）發(fā)現(xiàn)。他從在1803已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的鈰中提取了它。莫桑德爾注意到他的大多數(shù)氧化鈰樣本不可溶，而有些是可溶的，他推斷這是一種新元素的氧化物。他從鈰中提取出了第二種元素，他稱之為didymium（鐠釹混合物）。然而他沒有意識(shí)到didymium也是混合物，在1885年它被分離成了鐠和釹?？枴す潘顾āつ５聽枺–arl·Gustaf·Mosander）鑭系元素：lanthanideelement鑭以及接著發(fā)現(xiàn)的鉺、鋱打開了發(fā)現(xiàn)稀土元素的第二道大門，是發(fā)現(xiàn)稀土元素的第二階段。他們的發(fā)現(xiàn)是繼鈰和釔兩個(gè)元素后又找到稀土元素中的三個(gè)。鑭以及接著發(fā)現(xiàn)的鉺、鋱打開了發(fā)現(xiàn)稀土元素的第二道大門，是發(fā)現(xiàn)稀土元素的第二階段。他們的發(fā)現(xiàn)是繼鈰和釔兩個(gè)元素后又找到稀土元素中的三個(gè)。

鑭系元素是57～71的15種化學(xué)元素的統(tǒng)稱。包括鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿、镥，它們都是稀土元素的成員。背景簡介——鑭鑭的發(fā)現(xiàn)卡爾·古斯塔法·莫桑德爾（Carl·Gustaf·M28

CisbioBioassays最初在體外診斷方面的成就提供了豐富的免疫化驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，通過與Jean-MarieLehn教授在稀土熒光特性方面研究合作，造就了如今的HTRF技術(shù)。如今，全球各大制藥企業(yè)、藥物研究所和新藥篩選中心都將HTRF作為重要的化合物篩選方法進(jìn)行藥物研發(fā)。讓-馬里·萊恩（Jean-MarieLehn，1939年9月30日出生）是法國化學(xué)家。他于1987年與DonaldCram和CharlesPedersen因?yàn)樗难钆浜衔锏暮铣桑黄皤@得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)讓-馬里·萊恩（Jean-MarieLehn）背景簡介——穴狀配合物CisbioBioassays最初在體外診斷29

穴狀化合物的形成是將一個(gè)陽離子納入到一個(gè)立體籠中?；\能收集光然后將能量轉(zhuǎn)移到核心的鑭系元素。大環(huán)的性質(zhì)有利于跟鑭系元素緊密相連，這種不可破的連接會(huì)形成異常穩(wěn)固的復(fù)合體。穴結(jié)構(gòu)能耐受一些特殊的實(shí)驗(yàn)條件如大量存在的陽離子（Mg2+和Mn2+等）、螯合物（EDTA）、溶劑或者溫度。

從HTRF能應(yīng)用到臨床診斷就能看出它也適用于濃度高的血清在讀板前或者孵育時(shí)加入氟離子能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)對大量化合物的抗干擾性，對實(shí)驗(yàn)沒有干擾而給實(shí)驗(yàn)提供了很大的靈活性。

穴沒有光漂白性，多次讀數(shù)后信號沒有損失，因此能按照需要的次數(shù)去讀，這就給許多動(dòng)力學(xué)檢測提供了可能。專利號：USPatentUS5,527,684

由于在該結(jié)構(gòu)上的貢獻(xiàn)，讓-馬里·萊恩在1987年獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。背景簡介——穴狀配合物穴狀化合物的形成是將一個(gè)陽離子納入到一個(gè)立30PART02HTRF技術(shù)原理PART02HTRF技術(shù)原理31時(shí)間分辨熒光

熒光共振能量轉(zhuǎn)移

HTRF技術(shù)

HTRF技術(shù)特點(diǎn)

HTRF技術(shù)的主要實(shí)驗(yàn)方法

HTRF技術(shù)原理時(shí)間分辨熒光

熒32

在生物溶液或血清中的很多化合物和蛋白質(zhì)是自發(fā)熒光的，利用傳統(tǒng)的快速熒光基團(tuán)進(jìn)行檢測極大限制了實(shí)驗(yàn)靈敏度。使用長壽命的熒光基團(tuán)結(jié)合時(shí)間分辨的檢測方式（在熒光激發(fā)和發(fā)射檢測之間有一個(gè)時(shí)間延遲）可將快速熒光的干擾降到最低。

時(shí)間分辨熒光（TRF）利用稀土元素中鑭系元素的獨(dú)特性質(zhì)。在TRF中常用的鑭系元素是釤（Sm）、銪（Eu）、鋱（Tb）和鏑（Dy）。與傳統(tǒng)熒光基團(tuán)相比，它們具有大的Stoke'sshifts和非常長的發(fā)射半衰期（從微秒到毫秒），這使它們在生物學(xué)熒光應(yīng)用領(lǐng)域中日益重要。一、時(shí)間分辨熒光在生物溶液或血清中的很多化合物和蛋白質(zhì)是自33

通過直接激發(fā)使鑭系元素離子產(chǎn)生熒光是不容易的，因?yàn)檫@些離子很難吸收光子。鑭系元素必須首先與有機(jī)分子形成復(fù)合物，有機(jī)分子收集光子并通過分子內(nèi)非放射過程轉(zhuǎn)移到鑭系元素上。稀土元素螯合物和穴狀配合物是能量收集裝置的典型代表，它們收集能量并轉(zhuǎn)移到鑭系元素離子上，后者則發(fā)出其特征性的長壽命的熒光。

為了能夠成功應(yīng)用于生物學(xué)檢測中，稀土元素復(fù)合物應(yīng)該具有特定的性質(zhì)，包括穩(wěn)定性、較高的發(fā)射光產(chǎn)率，并且能夠與生物分子連接。除此之外，當(dāng)直接在生物溶液中反應(yīng)時(shí)，能夠耐受熒光淬滅就顯得尤為重要。稀土元素螯合物穩(wěn)定性較差，而且有的化合物可競爭螯合物活性基團(tuán)，當(dāng)與FRET技術(shù)結(jié)合在一起時(shí)其靈敏度也受到限制。如果稀土元素與穴狀配合物結(jié)合，許多限制因素都可去除。一、時(shí)間分辨熒光通過直接激發(fā)使鑭系元素離子產(chǎn)生熒光是不容易34

熒光共振能量轉(zhuǎn)移利用兩種熒光基團(tuán)的能量轉(zhuǎn)移，這兩種熒光基團(tuán)分別稱為能量供體（Donor）和能量受體（Acceptor）。能量供體被外來光源激發(fā)（例如氙燈或激光），如果它與能量受體比較接近，可以將能量共振轉(zhuǎn)移到在能量受體上，使其受到激發(fā)，發(fā)出特定波長的發(fā)射光。將能量供體和能量受體分別與相互作用的兩個(gè)生物分子結(jié)合，生物分子的結(jié)合可以將能量供體和能量受體拉到足夠近的距離，產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，由于能量受體的發(fā)射光來自能量轉(zhuǎn)移，所以實(shí)驗(yàn)中不需要將未結(jié)合與已結(jié)合的分子分開，即不需要洗滌步驟。這種均相的實(shí)驗(yàn)方式操作簡單，而且減少了實(shí)驗(yàn)時(shí)間和花費(fèi)。二、熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量轉(zhuǎn)移利用兩種熒光基團(tuán)的能量轉(zhuǎn)移，這兩種熒35熒光共振能量的缺點(diǎn)：然而，這些生物測定法在熒光檢測方面具有很大的缺點(diǎn)，因?yàn)樗粊碜陨⑸浼ぐl(fā)光的背景噪聲顯著抑制，并且受到樣品中共存材料熒光（熒光化合物和粉塵/線）的顯著干擾，使其變得困難以獲得高度敏感的測量而且在FRET實(shí)驗(yàn)中使用的供體和受體是快速熒光基團(tuán)，半衰期非常短，其背景熒光較強(qiáng)。解決方法：背景熒光主要來自于樣品成分，包括緩沖液、蛋白質(zhì)、化合物和細(xì)胞裂解液。檢測到的熒光強(qiáng)度必須對這些自發(fā)熒光進(jìn)行校正，極大地影響了實(shí)驗(yàn)靈敏度，并使數(shù)據(jù)分析變得復(fù)雜。背景熒光非常短暫（壽命為納秒級），可以利用時(shí)間分辨熒光方法將其去除。

二、熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量的缺點(diǎn)：二、熒光共振能量轉(zhuǎn)移36HTRF技術(shù)原理HTRF技術(shù)結(jié)合了FRET和TRF兩種技術(shù)。該技術(shù)是利用了具有穴狀結(jié)構(gòu)的Eu元素的螯和標(biāo)記物和XL665作為一個(gè)供體，是基于Eu穴狀化合物的供體與受體（第二熒光標(biāo)記物）之間的FRET。在FRET中，受體發(fā)射熒光的壽命等同與供體的發(fā)射熒光的壽命。因?yàn)镋u的熒光衰減周期較長，所以含Eu的供體會(huì)誘導(dǎo)XL665受體長時(shí)間地發(fā)射熒光，受體激發(fā)后產(chǎn)生的熒光便能持續(xù)較長時(shí)間，這樣通過TRF就可以區(qū)分那些短壽命的自身散射的熒光，這樣從短壽命熒光背景中就很容易區(qū)分出FRET信號。當(dāng)由于生物分子相互作用導(dǎo)致兩個(gè)熒光基團(tuán)接近時(shí)，在激發(fā)時(shí)被穴狀化合物捕獲的部分能量釋放，發(fā)射波長為620nm；另一部分能量轉(zhuǎn)移到受體上，發(fā)射波長為665nm。665nm的發(fā)射光僅僅由供體引起的FRET產(chǎn)生。所以，當(dāng)生物分子相互作用時(shí)，有兩個(gè)激發(fā)光620nm和665nm；當(dāng)不存在相互作用時(shí)，只有620nm一個(gè)激發(fā)光。三、HTRF技術(shù)原理HTRF技術(shù)原理三、HTRF技術(shù)原理37HTRF技術(shù)的能量供體和能量受體

HTRF的供體是銪穴狀化合物（Eu3+cryptate）（圖a）或Lumi4?鋱穴狀化合物（Tb2+cryptate）（圖b，未發(fā)表結(jié)構(gòu)），后者是近年與Lumiphore公司合作的結(jié)果，激發(fā)效率更高。兩者的能量受體均可為XL665和d2。XL665和d2

激發(fā)波長為620nm，發(fā)射波長為665nm，位于紅外光區(qū)，進(jìn)一步降低了生物溶液對實(shí)驗(yàn)的影響（生物學(xué)成分很少在紅外光區(qū)有自發(fā)熒光）。三、HTRF技術(shù)原理HTRF技術(shù)的能量供體和能量受體

H38能量受體：XL665和

第二代受體d2

XL665是一種105kDa的大型雜六聚體，經(jīng)過分離后交聯(lián)，以便在HTRF分析中獲得更好的穩(wěn)定性并保持其光物理特性。與熒光素不同，它與Eucryptates完全兼容。它是紅移的，其發(fā)射更可能遠(yuǎn)離可能的中等和復(fù)合干擾。

d2

是第二代受體，具有與XL665非常相似的一系列光物理性質(zhì)，但其特征在于比XL665小100倍的有機(jī)結(jié)構(gòu)。作為一個(gè)小得多的實(shí)體，d2限制了在XL665基TR-FRET系統(tǒng)中有時(shí)懷疑的空間位阻問題。這些近紅外受體也特別適用于均相測定，因?yàn)樗鼈兊陌l(fā)射不太可能受到典型復(fù)合篩選過程中出現(xiàn)的內(nèi)在介質(zhì)或化合物自發(fā)熒光的干擾。這些紅色受體的特性也使它們適合與鋱穴合物結(jié)合。此外，由于其發(fā)射光譜中有額外的峰，鋱隱晶質(zhì)可與熒光素等綠色受體偶聯(lián)，在520nm范圍內(nèi)發(fā)射，例如可允許設(shè)計(jì)具有兩個(gè)讀數(shù)的多重測定。三、HTRF技術(shù)原理能量受體：XL665和第二代受體d2三、HTRF技術(shù)原理39HTRF技術(shù)中鑭元素與穴狀配合物的結(jié)合HTRF中使用四種特定的熒光團(tuán)形成不同的TR-FRET系統(tǒng)。中心元素能量供體是銪穴合物。這些稀土配合物基分別具有Eu3+離子或Tb2+緊密嵌入的大環(huán)。這些離子本身不發(fā)熒光;他們需要一個(gè)光收集裝置（即籠）被激發(fā)。與其他發(fā)光鑭系元素技術(shù)中螯合物的功能類似，該籠子作為天線，允許能量收集和轉(zhuǎn)移到離子，最終以特定的熒光模式釋放該能量。特別是，這些穴狀配合物不受影響許多常規(guī)熒光團(tuán)的光漂白，并且離子幾乎與它們的大環(huán)化合物不可分離。然而，由于獨(dú)特的籠狀結(jié)構(gòu)，穴狀化合物的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于這些鑭系元素螯合物。稀土螯合物在酸性介質(zhì)中或存在二價(jià)離子如Mn2+時(shí)會(huì)解離并不穩(wěn)定，而稀土穴合物在寬范圍的化學(xué)條件下非常穩(wěn)定，如在三氟乙酸存在下的反相