制藥用水微生物檢查方法的驗證課件

微生物檢查方法驗證微生物檢查方法驗證1

介紹內(nèi)容

一、微生物的基礎(chǔ)知識二、微生物檢查方法驗證

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微生物基礎(chǔ)知識

微生物（microorganism,microbe）是一些肉眼看不見的微小生物的總稱。微生物（microorganism）包括細(xì)菌、支原體、螺旋體、衣原體、立克次體、病毒及真菌（霉菌、酵母菌和放線菌）等。微生物基礎(chǔ)知識微生物（3

微生物的特點

種類多分布廣迄今為止，我們知道的微生物約有10萬種，目前已知的種類只占地球上實際存在的微生物總數(shù)的20%。微生物的特點種類多4

微生物的特點

各體小，面積大物體的表面積和體積之比稱為表面積大腸埃希菌的表面積是人的30萬倍。

微生物的特點各5

微生物的特點吸收多轉(zhuǎn)化快如大腸埃希菌在合適條件下，每小時可以消耗相當(dāng)于自身重量2000倍的數(shù)量，而人體則需要40年之久。

微生物的特點吸6

微生物的特點適應(yīng)強易變異多數(shù)細(xì)菌能耐0～－196℃的低溫；硫細(xì)菌可在250～300℃的高溫條件下正常生長；一些嗜鹽細(xì)菌甚至能在飽和鹽水中正常生活；產(chǎn)芽孢細(xì)菌和真菌孢子在干燥條件下能保藏幾十年、幾百年。微生物的特點適7微生物的類群和形態(tài)結(jié)構(gòu)

微生物按其結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及生活習(xí)性等分為三大類：原核細(xì)胞型：細(xì)菌、放線菌、支原體、衣原體、立克次氏體、螺旋體等真核細(xì)胞型：真菌非細(xì)胞型：病毒噬菌體

微生物的類群和形態(tài)結(jié)構(gòu)微生物按其結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及8細(xì)菌的繁殖

細(xì)菌（bacterium）屬于原核細(xì)胞型微生物，其特點是具有細(xì)胞壁、原始的核質(zhì)，以二分裂方式繁殖。細(xì)菌的9

細(xì)菌的形態(tài)

⒈細(xì)菌體積微小，是無色半透明的，用肉眼直接觀察難以看到，其結(jié)構(gòu)和形狀須經(jīng)過顯微鏡放大數(shù)百倍至上千倍才能觀察。⒉一般以微米（μm）作為測量單位。⒊在細(xì)菌學(xué)中，按其形態(tài)可分為球菌、桿菌、弧菌和螺桿菌。⒋經(jīng)革蘭染色法（Gramstain）可將細(xì)菌分成兩大類：即革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-）。

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真菌（fungus；eumycetes）是具有真核和細(xì)胞壁的生物。種類很多，已報道的種超過10萬個。大多是由纖細(xì)管狀菌絲構(gòu)成的菌絲體。許多菌絲在一起統(tǒng)稱菌絲體。菌絲體在基質(zhì)上生長的形態(tài)稱為菌落。真菌（fungus；eumycetes）11

真菌的形態(tài)具有多樣性，大小不一，大的用肉眼可以看到，小的用普通光學(xué)顯微鏡放大數(shù)倍乃至千倍方可觀察到。其形態(tài)分單細(xì)胞、多細(xì)胞，單細(xì)胞呈圓形或卵圓形，如酵母菌（yeast）。多細(xì)胞由菌絲和孢子組成，并交織成團。真菌的形態(tài)具有多樣性，大小不一，大的用肉眼可以看到，小12

藥品污染常見的真菌

毛霉屬、根霉屬、曲霉屬、青霉屬、木霉屬一、毛霉屬（MucorMicheliexFries）

毛霉屬在自然界分布很廣，常用于發(fā)酵工業(yè)。并引起水分高的糧食及食品的霉?fàn)€變質(zhì)。藥品污染常見的真菌毛霉屬、根霉屬、曲霉13根霉屬（RhizopusEhrenberg）

根霉屬廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，在潮濕的糧食及食品上能迅速蔓延生長，引起糧食及食品的腐爛。根霉屬（RhizopusEhrenberg）根霉屬廣泛14曲霉屬（Aspergillus）

曲霉屬的菌絲無色、淡色或表面凝聚有色物質(zhì)，為有隔的多細(xì)胞。本屬的常見產(chǎn)毒霉菌有8個種，具有強烈的致癌性。

曲霉屬（Aspergillus）15

青霉屬菌絲無色或有色，為有隔的多細(xì)胞。分生孢子梗從菌絲垂直生出，無足細(xì)胞，頂端不膨大，無頂囊，產(chǎn)生一輪至數(shù)輪分叉，在最后一級分枝的小梗上，長出成串的分生孢子，形似掃帚狀，稱為帚狀枝。本屬的常見產(chǎn)毒霉菌有9個種，其中展青霉可產(chǎn)生展青霉素，是一種神經(jīng)毒素，并具有致畸、致突變和致癌性；

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霉菌菌落形態(tài)霉菌菌落形態(tài)17

霉菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上的形態(tài)霉菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上的形態(tài)18

酵母菌顯微鏡下形態(tài)酵母菌顯微鏡下形態(tài)19

微生物檢查法微生物限度檢查方法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。檢查方法多用平皿法、薄膜過濾法、涂抹法和MPN法。

微生物檢查法微生20檢查方法的驗證

試驗環(huán)境

無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行。檢驗依據(jù)單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進行潔凈度驗證。-2010版藥典

檢查方法的驗證21

隔離系統(tǒng)的應(yīng)用

應(yīng)用隔離系統(tǒng)重要的目的⒈是保護產(chǎn)品免受外源性污染保證無菌實驗結(jié)果的可靠性，實現(xiàn)一次檢出的要求。⒉是保護操作人員安全。隔離系統(tǒng)應(yīng)按相關(guān)的要求進行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對試驗環(huán)境進行監(jiān)控。隔離系統(tǒng)的應(yīng)用22

方法驗證的必要性⒈為保證檢驗結(jié)果的可靠性，真實性，選擇正確的檢驗方法是至關(guān)重要的。因此試驗前必須對選擇的方法進行驗證。⒉證明所采用的方法是適宜的，確認(rèn)所采用的方法適宜于被檢供試品的微生物污染的檢驗。

方法驗證的必要性23

檢驗結(jié)果的影響因素⒈供試品的組分抑菌劑、增溶劑、乳化劑及抗氧化劑，這些組分在一定濃度下對微生物起一定的抑制作用也可對污染菌造成損傷。⒉環(huán)境影響不同類型的微生物及不同的存活狀態(tài)對環(huán)境的抗性是不同的。⒊檢驗方法⒋檢驗條件如培養(yǎng)基的質(zhì)量、檢驗人員的操作誤差等。檢驗結(jié)果的影響因素⒈供試品24

試驗全方面驗證

如試驗環(huán)境，培養(yǎng)基，供試液的制備，滅菌方法等全部進行驗證。當(dāng)驗證試驗符合要求時，就可認(rèn)為在該試驗條件下該供試品對微生物無抑菌作用或抑菌作用可忽略不計，供試品檢驗結(jié)果可真實的體現(xiàn)。試驗全方面驗證25

驗證方法菌液制備50～100cfu/ml。驗證方法試驗組、菌液組、供試品對照組、釋劑對照組。結(jié)果判斷供試品組、對照組、稀釋劑對照組的菌回收率均不低70%。驗證方法菌液制備50～100cfu/ml。26

驗證方法

⑴按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進行。⑵對各試驗菌的回收率應(yīng)逐一進行驗證。⑶驗證試驗至少應(yīng)進行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。驗證方法27試驗菌株大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草桿菌。菌液制備

同計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。試驗菌株大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、28

（1）試驗組

①平皿法

取最低稀釋級供試液1ml和50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基(平行制備2個平皿)，按平皿法測定其菌數(shù)。

②薄膜過濾法

取最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。（1）試驗組29（2）菌液組所加的試驗菌數(shù)。（3）供試品對照組測定供試品本底菌數(shù)。（4）稀釋劑對照組用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗菌按試驗組測定其菌數(shù)?？疾旃┰囈褐苽溥^程中微生物受影響的程度。（2）菌液組所加的試驗菌數(shù)。30謝謝謝謝31微生物檢查方法驗證微生物檢查方法驗證32

介紹內(nèi)容

一、微生物的基礎(chǔ)知識二、微生物檢查方法驗證

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微生物基礎(chǔ)知識

微生物（microorganism,microbe）是一些肉眼看不見的微小生物的總稱。微生物（microorganism）包括細(xì)菌、支原體、螺旋體、衣原體、立克次體、病毒及真菌（霉菌、酵母菌和放線菌）等。微生物基礎(chǔ)知識微生物（34

微生物的特點

種類多分布廣迄今為止，我們知道的微生物約有10萬種，目前已知的種類只占地球上實際存在的微生物總數(shù)的20%。微生物的特點種類多35

微生物的特點

各體小，面積大物體的表面積和體積之比稱為表面積大腸埃希菌的表面積是人的30萬倍。

微生物的特點各36

微生物的特點吸收多轉(zhuǎn)化快如大腸埃希菌在合適條件下，每小時可以消耗相當(dāng)于自身重量2000倍的數(shù)量，而人體則需要40年之久。

微生物的特點吸37

微生物的特點適應(yīng)強易變異多數(shù)細(xì)菌能耐0～－196℃的低溫；硫細(xì)菌可在250～300℃的高溫條件下正常生長；一些嗜鹽細(xì)菌甚至能在飽和鹽水中正常生活；產(chǎn)芽孢細(xì)菌和真菌孢子在干燥條件下能保藏幾十年、幾百年。微生物的特點適38微生物的類群和形態(tài)結(jié)構(gòu)

微生物按其結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及生活習(xí)性等分為三大類：原核細(xì)胞型：細(xì)菌、放線菌、支原體、衣原體、立克次氏體、螺旋體等真核細(xì)胞型：真菌非細(xì)胞型：病毒噬菌體

微生物的類群和形態(tài)結(jié)構(gòu)微生物按其結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及39細(xì)菌的繁殖

細(xì)菌（bacterium）屬于原核細(xì)胞型微生物，其特點是具有細(xì)胞壁、原始的核質(zhì)，以二分裂方式繁殖。細(xì)菌的40

細(xì)菌的形態(tài)

⒈細(xì)菌體積微小，是無色半透明的，用肉眼直接觀察難以看到，其結(jié)構(gòu)和形狀須經(jīng)過顯微鏡放大數(shù)百倍至上千倍才能觀察。⒉一般以微米（μm）作為測量單位。⒊在細(xì)菌學(xué)中，按其形態(tài)可分為球菌、桿菌、弧菌和螺桿菌。⒋經(jīng)革蘭染色法（Gramstain）可將細(xì)菌分成兩大類：即革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-）。

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真菌（fungus；eumycetes）是具有真核和細(xì)胞壁的生物。種類很多，已報道的種超過10萬個。大多是由纖細(xì)管狀菌絲構(gòu)成的菌絲體。許多菌絲在一起統(tǒng)稱菌絲體。菌絲體在基質(zhì)上生長的形態(tài)稱為菌落。真菌（fungus；eumycetes）42

真菌的形態(tài)具有多樣性，大小不一，大的用肉眼可以看到，小的用普通光學(xué)顯微鏡放大數(shù)倍乃至千倍方可觀察到。其形態(tài)分單細(xì)胞、多細(xì)胞，單細(xì)胞呈圓形或卵圓形，如酵母菌（yeast）。多細(xì)胞由菌絲和孢子組成，并交織成團。真菌的形態(tài)具有多樣性，大小不一，大的用肉眼可以看到，小43

藥品污染常見的真菌

毛霉屬、根霉屬、曲霉屬、青霉屬、木霉屬一、毛霉屬（MucorMicheliexFries）

毛霉屬在自然界分布很廣，常用于發(fā)酵工業(yè)。并引起水分高的糧食及食品的霉?fàn)€變質(zhì)。藥品污染常見的真菌毛霉屬、根霉屬、曲霉44根霉屬（RhizopusEhrenberg）

根霉屬廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，在潮濕的糧食及食品上能迅速蔓延生長，引起糧食及食品的腐爛。根霉屬（RhizopusEhrenberg）根霉屬廣泛45曲霉屬（Aspergillus）

曲霉屬的菌絲無色、淡色或表面凝聚有色物質(zhì)，為有隔的多細(xì)胞。本屬的常見產(chǎn)毒霉菌有8個種，具有強烈的致癌性。

曲霉屬（Aspergillus）46

青霉屬菌絲無色或有色，為有隔的多細(xì)胞。分生孢子梗從菌絲垂直生出，無足細(xì)胞，頂端不膨大，無頂囊，產(chǎn)生一輪至數(shù)輪分叉，在最后一級分枝的小梗上，長出成串的分生孢子，形似掃帚狀，稱為帚狀枝。本屬的常見產(chǎn)毒霉菌有9個種，其中展青霉可產(chǎn)生展青霉素，是一種神經(jīng)毒素，并具有致畸、致突變和致癌性；

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霉菌菌落形態(tài)霉菌菌落形態(tài)48

霉菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上的形態(tài)霉菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上的形態(tài)49

酵母菌顯微鏡下形態(tài)酵母菌顯微鏡下形態(tài)50

微生物檢查法微生物限度檢查方法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。檢查方法多用平皿法、薄膜過濾法、涂抹法和MPN法。

微生物檢查法微生51檢查方法的驗證

試驗環(huán)境

無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行。檢驗依據(jù)單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進行潔凈度驗證。-2010版藥典

檢查方法的驗證52

隔離系統(tǒng)的應(yīng)用

應(yīng)用隔離系統(tǒng)重要的目的⒈是保護產(chǎn)品免受外源性污染保證無菌實驗結(jié)果的可靠性，實現(xiàn)一次檢出的要求。⒉是保護操作人員安全。隔離系統(tǒng)應(yīng)按相關(guān)的要求進行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對試驗環(huán)境進行監(jiān)控。隔離系統(tǒng)的應(yīng)用53

方法驗證的必要性⒈為保證檢驗結(jié)果的可靠性，真實性，選擇正確的檢驗方法是至關(guān)重要的。因此試驗前必須對選擇的方法進行驗證。⒉證明所采用的方法是適宜的，確認(rèn)所采用的方法適宜于被檢供試品的微生物污染的檢驗。

方法驗證的必要性54

檢驗結(jié)果的影響因素⒈供試品的組分抑菌劑、增溶劑、乳化劑及抗氧化劑，這些組分在一定濃度下對微生物起一定的抑制作用也可對污染菌造成損傷。⒉環(huán)境影響不同類型的微生物及不同的存活狀態(tài)對環(huán)境的抗性是不同的。⒊檢驗方法⒋檢驗條件如培養(yǎng)基的質(zhì)