第19章藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)課件

第十九章

藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)第十九章

藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)1第一節(jié)生物藥物制造的生物化學(xué)基礎(chǔ)一、生物藥物制備方法的特點(diǎn)（1）目的物存在于組成非常復(fù)雜的生物材料中（2）目的物在生物材料中含量極微（3）生物活性成分離開生物體后，易變性破壞（4）生物藥物制造工藝設(shè)計(jì)理論性不強(qiáng)（5）生物制藥工藝多采用“逐級(jí)分離”法（6）生物藥物的均一性檢測(cè)與化學(xué)上純度概念不完全相同。第一節(jié)生物藥物制造的生物化學(xué)基礎(chǔ)一、生物藥物制備方法的特點(diǎn)2生物藥物分離的主要原理：1.根據(jù)不同組分分配率的差別進(jìn)行分離

萃取分配層析吸附層析鹽析結(jié)晶生物藥物分離的主要原理：1.根據(jù)不同組分分配率的差別進(jìn)行分32.根據(jù)生物大分子的特性①根據(jù)分子形狀和分子大小不同：差速離心、超離心、膜分離透析、超濾、凝膠過濾②根據(jù)分子電離性質(zhì)（帶電性）不同：離子交換法、電泳法、等電聚焦法③根據(jù)分子極性大小與溶解度不同：溶液提取法、逆流分配法、分配層析法、鹽析法④根據(jù)配基特異性不同親和層析法2.根據(jù)生物大分子的特性4二、生物合成技術(shù)生物合成是利用生物細(xì)胞的代謝反應(yīng)（更多的是利用微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)）來合成化學(xué)方法難于合成的藥物或藥物中間體。二、生物合成技術(shù)5微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng):是利用微生物的代謝作用來進(jìn)行某些化學(xué)反應(yīng)，確切地說就是利用微生物代謝過程中某種酶對(duì)底物進(jìn)行催化反應(yīng)，以生成所需要的活性物質(zhì)。微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng):6

半合成藥物是指一個(gè)藥物其部分結(jié)構(gòu)由天然資源得到，然后用化學(xué)合成法制得最終產(chǎn)品或應(yīng)用微生物轉(zhuǎn)化將化學(xué)合成的中間產(chǎn)物，通過某些生物合成步驟來解決藥物合成中難于進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，從而獲得最終有效化合物。半合成藥物是指一個(gè)藥物其部分結(jié)構(gòu)由天然資源得到7第19章藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)課件8三、生物技術(shù)

生物技術(shù)（biotechnology）又稱生物工程（bioengineering），是利用生物有機(jī)體（動(dòng)物、植物和微生物）或其組成部分（包括器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞器等）發(fā)展新產(chǎn)品或新工藝的一種技術(shù)體系。三、生物技術(shù)生物技術(shù)（biotech9

基因工程細(xì)胞工程酶工程發(fā)酵工程

生物技術(shù)生物技術(shù)10重組DNA技術(shù)（基因工程）基本原理：目的基因的獲取重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞目的基因與載體的拼接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選工程菌（或細(xì)胞）的大量培養(yǎng)與目的蛋白的生產(chǎn)

重組DNA技術(shù)（基因工程）基本原理：目的基因的獲取重組DNA11（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)

（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法12（二）基因載體的選用定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA（二）基因載體的選用定義常用載體13載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；14質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn)

能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn)15第19章藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)課件16（三）限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ（三）限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictio17BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC18（四）重組體的構(gòu)建即外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接（四）重組體的構(gòu)建1.粘性末端連接19BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCT4DNA連接酶GATC202.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端2.平端連接21目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體223.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。3.同聚物加尾連接235′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′3′載體DNA5′3′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶24受體菌條件

安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)（五）重組DNA導(dǎo)入受體菌受體菌條件導(dǎo)入方式（五）重組DNA導(dǎo)入受體菌25（六）重組體的篩選1.重組體的表型進(jìn)行篩選

抗藥性標(biāo)記篩選、營(yíng)養(yǎng)素的依賴篩選2.限制酶切圖譜分析鑒定3.利用核酸雜交技術(shù)進(jìn)行鑒定（六）重組體的篩選26(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇目錄(插入失活法)目錄27組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體標(biāo)志補(bǔ)救組氨酸缺陷無組氨酸酵母咪唑甘油磷促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體28重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為

小結(jié)分分離目的基因

切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌

篩篩選重組體

重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基29DNA重組技術(shù)的主要應(yīng)用：1.運(yùn)用DNA重組技術(shù)大量生產(chǎn)基因工程藥物。2.定向改造生物的基因結(jié)構(gòu)，構(gòu)建高產(chǎn)菌株，用于改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)。3.用于基礎(chǔ)研究，用于基因結(jié)構(gòu)與基因組功能的調(diào)節(jié)研究，用于分子雜交等。DNA重組技術(shù)的主要應(yīng)用：1.運(yùn)用DNA重組技術(shù)大量生產(chǎn)基因30第二節(jié)

藥物質(zhì)量控制的生物化學(xué)基礎(chǔ)第二節(jié)

藥物質(zhì)量控制的生物化學(xué)基礎(chǔ)31一、藥物質(zhì)量控制的常用生化分析法（一）免疫分析法1.免疫擴(kuò)散法2.免疫電泳法3.放射免疫測(cè)定法（RIA）4.酶聯(lián)免疫測(cè)定法（ELISA）就是讓抗體或抗原與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過顯色來檢測(cè)。一、藥物質(zhì)量控制的常用生化分析法（一）免疫分析法4.酶聯(lián)32（二）電泳分析法（二）電泳分析法33第19章藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)課件34（三）酶法分析（三）酶法分析351.終止反應(yīng)法2.連續(xù)測(cè)定法3.循環(huán)放大分析法1.終止反應(yīng)法36二、生物藥物質(zhì)量控制的生化分析方法（一）多肽與蛋白質(zhì)類藥物的主要分析方法1.蛋白質(zhì)藥物的純度分析聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)SDS毛細(xì)管電泳(CE)等電聚焦(IEF)高效液相色譜法(HPLC)二、生物藥物質(zhì)量控制的生化分析方法（一）多肽與蛋白質(zhì)類藥物372.多肽與蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定使用較多的是超速離心法，凝膠層析法和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法等。超速離心法凝膠層析法2.多肽與蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定超速離心法凝膠層析法38SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法393.蛋白質(zhì)的定量測(cè)定（1）物理性質(zhì)：紫外分光光度法，折射率法，比濁法。（2）化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法，雙縮脲比色法，F(xiàn)olin-酚法，BCA法。（3）染色性質(zhì)：考馬斯亮蘭G-250結(jié)合法、銀染、金染。（4）其他：熒光激發(fā)。3.蛋白質(zhì)的定量測(cè)定404.膠體金比色法膠體金是一種帶負(fù)電荷的疏水性膠體，加入蛋白質(zhì)后，紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，595nm處測(cè)定樣品的吸收值，計(jì)算含量。4.膠體金比色法415.生物質(zhì)譜法：多肽和蛋白質(zhì)的分子量可用MALDI/MS（基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜法）或ESI/MS（電噴霧離子化質(zhì)譜法）直接測(cè)定，用質(zhì)譜法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量簡(jiǎn)便，快速、靈敏、準(zhǔn)確。5.生物質(zhì)譜法：42（二）核酸類藥物的主要分析方法1.紫外分光光度法：測(cè)定RNA與DNA含量260nm2.地衣酚顯色法測(cè)定RNA含量3，5-二羥甲苯3.二苯胺法測(cè)定DNA含量（二）核酸類藥物的主要分析方法1.紫外分光光度法：43（三）酶類藥物的分析酶類藥物的主要質(zhì)量指標(biāo)是它的催化活力。（四）重組DNA藥物中的可能雜質(zhì)檢查

1.外源性DNA2.宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)3.二聚體或多聚體的測(cè)定4.降解產(chǎn)物的測(cè)定（三）酶類藥物的分析（四）重組DNA藥物中的可能雜質(zhì)檢查44第三節(jié)

藥理學(xué)研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)第三節(jié)

藥理學(xué)研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)45神經(jīng)遞質(zhì)又稱突觸分泌信號(hào)(synapticsignal)特點(diǎn)由神經(jīng)元細(xì)胞分泌；通過突觸間隙到達(dá)下一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞；作用時(shí)間較短。例如：乙酰膽堿、去甲腎上腺素等一、藥物作用的生物化學(xué)基礎(chǔ)（一）神經(jīng)傳導(dǎo)與神經(jīng)遞質(zhì)神經(jīng)遞質(zhì)又稱突觸分泌信號(hào)(synapticsignal)特46乙酰膽堿受體功能模式圖1.受體-離子通道型（二）受體的結(jié)構(gòu)與功能乙酰膽堿受體功能模式圖1.受體-離子通道型（二）受體的結(jié)構(gòu)47※G蛋白(guanylatebindingprotein)是一類和GTP或GDP相結(jié)合、位于細(xì)胞膜胞漿面的外周蛋白，由、、三個(gè)亞基組成。有兩種構(gòu)象：非活化型；活化型2．受體-G蛋白-效應(yīng)蛋白型※G蛋白(guanylatebindingprotei48RＲHACγαβGDPαGTPβγ腺苷酸環(huán)化酶ACATPcAMPRＲHACγαβGDPαGTPβγ腺苷酸環(huán)化酶ACATPcA49與配體結(jié)合后具有酪氨酸蛋白激酶活性，如胰島素受體insulingrowthfactorreceptor,IGF-R

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGF-R)。與配體結(jié)合后具有酪氨酸蛋白激酶活性，如胰島素受體insul504．受體-轉(zhuǎn)錄因子型高度可變區(qū)位于N端，具有轉(zhuǎn)錄活性DNA結(jié)合區(qū)含有鋅指結(jié)構(gòu)激素結(jié)合區(qū)位于C端，結(jié)合激素、熱休克蛋白，使受體二聚化，激活轉(zhuǎn)錄鉸鏈區(qū)4．受體-轉(zhuǎn)錄因子型高度可變區(qū)位于N端，具有轉(zhuǎn)錄活性DNA結(jié)51第19章藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)課件52（三）跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）不同種類的受體使用由共同組分構(gòu)成的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)（2）在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中不同類型的磷酸化同時(shí)起作用（三）跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)53（四）細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與藥物研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的激動(dòng)劑和抑制劑是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)藥物的研究出發(fā)點(diǎn)，尤其是各種蛋白激酶的抑制劑更是被廣泛用做母體藥物進(jìn)行抗腫瘤新藥。（四）細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與藥物研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的激動(dòng)劑54信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)干擾藥物的藥效和副作用

取決于：一、它所干擾的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在體內(nèi)是否廣泛存在，如果廣泛存在各細(xì)胞內(nèi)，副作用難以控制。二、藥物自身的選擇性，對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的選擇性越高，副作用越小。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)干擾藥物的藥效和副作用

取決于：一、它所干擾的信號(hào)轉(zhuǎn)55（五）藥物作用的靶酶藥物對(duì)靶酶的作用：

調(diào)節(jié)酶量調(diào)節(jié)酶活力（五）藥物作用的靶酶56酶抑制劑應(yīng)用臨床的條件：（1）被抑制的靶酶所催化的生化反應(yīng)與某種疾病的發(fā)生有關(guān)，具有治療作用。（2）酶抑制劑具有特異性。（3）具有某種藥動(dòng)學(xué)特征，能到達(dá)作用部位、具有合理、可預(yù)見的量效關(guān)系和作用持續(xù)時(shí)間。（4）對(duì)人體毒性小，療效指數(shù)高。（5）應(yīng)符合藥品標(biāo)準(zhǔn)。酶抑制劑應(yīng)用臨床的條件：（1）被抑制的靶酶所催化的生化反應(yīng)與57（六）細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子1.細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子類2.細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子類（六）細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子58（七）細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)

細(xì)胞凋亡是某些生理或病理?xiàng)l件下，細(xì)胞接受到某種信號(hào)所觸發(fā)的并按一定程序進(jìn)行的主動(dòng)、緩慢的死亡過程。

生化特征：（1）DNA片段化（2）谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、鈣蛋白酶激活：如磷脂酰絲氨酸顯露（3）一些特殊蛋白質(zhì)、RNA的產(chǎn)生和合成（七）細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)細(xì)胞凋亡是某些生理或病59二、新藥篩選的生物化學(xué)方法（一）放射配基受體結(jié)合法（RRA）二、新藥篩選的生物化學(xué)方法（一）放射配基受體結(jié)合法（RRA）60（二）酶學(xué)實(shí)驗(yàn)法

肝臟細(xì)胞色素P450系統(tǒng)（三）膜功能研究方法

1.鈣調(diào)蛋白-紅細(xì)胞膜的制備及鈣調(diào)蛋白功能測(cè)定2.心肌細(xì)胞膜的制備與功能測(cè)定（二）酶學(xué)實(shí)驗(yàn)法（三）膜功能研究方法61（四）生化代謝功能分析法1.降血糖藥物實(shí)驗(yàn)法2.調(diào)血脂藥及抗動(dòng)脈粥樣硬化藥實(shí)驗(yàn)法3.凝血藥和抗凝血藥實(shí)驗(yàn)法（五）逆向藥理學(xué)基因→受體→藥物（四）生化代謝功能分析法（五）逆向藥理學(xué)62一、酶與藥物設(shè)計(jì)二、受體與藥物設(shè)計(jì)（一）受體介導(dǎo)的靶向藥物設(shè)計(jì)（二）藥物與受體結(jié)合的構(gòu)象分析1．同源分子法2．歸納法3．演繹法4．比較分子力場(chǎng)分析法第四節(jié)與藥物設(shè)計(jì)有關(guān)的生物化學(xué)原理一、酶與藥物設(shè)計(jì)第四節(jié)與藥物設(shè)計(jì)有關(guān)的生物化學(xué)原理63三、藥物代謝轉(zhuǎn)化與前體藥物設(shè)計(jì)

研究藥物代謝的主要目的是確定藥物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化的途徑，并定量地確定每一代謝途徑及其中間體的藥理活性。三、藥物代謝轉(zhuǎn)化與前體藥物設(shè)計(jì)64四、生物大分子的結(jié)構(gòu)模擬與藥物設(shè)計(jì)生物大分子結(jié)構(gòu)模擬的藥物設(shè)計(jì)有兩個(gè)熱點(diǎn)：

1．應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造具有明顯生物功能的天然蛋白質(zhì)分子，以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能為基礎(chǔ)，通過分子設(shè)計(jì)和有控制的基因修飾以及基因合成對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造，構(gòu)建最終性能比天然蛋白質(zhì)更加符合人類需要的新型活性蛋白。

2．基于生物大分子的結(jié)構(gòu)知識(shí)進(jìn)行的藥物設(shè)計(jì)。四、生物大分子的結(jié)構(gòu)模擬與藥物設(shè)計(jì)生物大分子結(jié)構(gòu)模擬的藥物設(shè)65五、藥物基因組學(xué)與藥物研究

藥物基因組學(xué)（Pharmacogenomics）是研究影響藥物作用，藥物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、清除等基因差異的學(xué)科即決定藥物作用行為和作用敏感性的相關(guān)基因組科學(xué)，它是以提高藥物療效與安全性為目的，對(duì)臨床用藥具有重要指導(dǎo)作用。五、藥物基因組學(xué)與藥物研究藥物基因組學(xué)（66藥物基因組學(xué)在藥學(xué)的應(yīng)用：（1）檢測(cè)、評(píng)估個(gè)體對(duì)某種藥物的適用程度，使藥物的有效性達(dá)到最大化。（2）檢測(cè)藥物應(yīng)答基因的多態(tài)性，依據(jù)個(gè)體的遺傳差異實(shí)現(xiàn)差異個(gè)性化用藥。（3）確定疾病發(fā)生相關(guān)基因，篩選新的藥物作用靶點(diǎn)。（4）研究藥物代謝酶基因譜及藥物產(chǎn)生毒副反應(yīng)的相關(guān)基因，提高新藥開發(fā)命中率，增強(qiáng)藥物療效和安全性，縮短開發(fā)周期，降低研究開發(fā)成本。藥物基因組學(xué)在藥學(xué)的應(yīng)用：（1）檢測(cè)、評(píng)估個(gè)體對(duì)某種藥物的適67六、系統(tǒng)生物學(xué)與藥物發(fā)現(xiàn)研究

系統(tǒng)生物學(xué)是一門假說驅(qū)動(dòng)（hypothesis-drive）的科學(xué)，是利用基因組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及其他多種組學(xué)技術(shù)綜合獲得的全球性數(shù)據(jù)進(jìn)行定量的、綜合的、動(dòng)態(tài)的研究學(xué)科。六、系統(tǒng)生物學(xué)與藥物發(fā)現(xiàn)研究68

系統(tǒng)生物學(xué)是解決藥物發(fā)現(xiàn)研究中所遇到的一些挑戰(zhàn)性問題的有效途徑：（1）加速藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)過程。（2）藥物作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與確證。（3）發(fā)現(xiàn)代表性標(biāo)志物。（4）建立個(gè)性化用藥方案。系統(tǒng)生物學(xué)是解決藥物發(fā)現(xiàn)研究中所遇到的一69第十九章

藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)第十九章

藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)70第一節(jié)生物藥物制造的生物化學(xué)基礎(chǔ)一、生物藥物制備方法的特點(diǎn)（1）目的物存在于組成非常復(fù)雜的生物材料中（2）目的物在生物材料中含量極微（3）生物活性成分離開生物體后，易變性破壞（4）生物藥物制造工藝設(shè)計(jì)理論性不強(qiáng)（5）生物制藥工藝多采用“逐級(jí)分離”法（6）生物藥物的均一性檢測(cè)與化學(xué)上純度概念不完全相同。第一節(jié)生物藥物制造的生物化學(xué)基礎(chǔ)一、生物藥物制備方法的特點(diǎn)71生物藥物分離的主要原理：1.根據(jù)不同組分分配率的差別進(jìn)行分離

萃取分配層析吸附層析鹽析結(jié)晶生物藥物分離的主要原理：1.根據(jù)不同組分分配率的差別進(jìn)行分722.根據(jù)生物大分子的特性①根據(jù)分子形狀和分子大小不同：差速離心、超離心、膜分離透析、超濾、凝膠過濾②根據(jù)分子電離性質(zhì)（帶電性）不同：離子交換法、電泳法、等電聚焦法③根據(jù)分子極性大小與溶解度不同：溶液提取法、逆流分配法、分配層析法、鹽析法④根據(jù)配基特異性不同親和層析法2.根據(jù)生物大分子的特性73二、生物合成技術(shù)生物合成是利用生物細(xì)胞的代謝反應(yīng)（更多的是利用微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)）來合成化學(xué)方法難于合成的藥物或藥物中間體。二、生物合成技術(shù)74微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng):是利用微生物的代謝作用來進(jìn)行某些化學(xué)反應(yīng)，確切地說就是利用微生物代謝過程中某種酶對(duì)底物進(jìn)行催化反應(yīng)，以生成所需要的活性物質(zhì)。微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng):75

半合成藥物是指一個(gè)藥物其部分結(jié)構(gòu)由天然資源得到，然后用化學(xué)合成法制得最終產(chǎn)品或應(yīng)用微生物轉(zhuǎn)化將化學(xué)合成的中間產(chǎn)物，通過某些生物合成步驟來解決藥物合成中難于進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，從而獲得最終有效化合物。半合成藥物是指一個(gè)藥物其部分結(jié)構(gòu)由天然資源得到76第19章藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)課件77三、生物技術(shù)

生物技術(shù)（biotechnology）又稱生物工程（bioengineering），是利用生物有機(jī)體（動(dòng)物、植物和微生物）或其組成部分（包括器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞器等）發(fā)展新產(chǎn)品或新工藝的一種技術(shù)體系。三、生物技術(shù)生物技術(shù)（biotech78

基因工程細(xì)胞工程酶工程發(fā)酵工程

生物技術(shù)生物技術(shù)79重組DNA技術(shù)（基因工程）基本原理：目的基因的獲取重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞目的基因與載體的拼接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選工程菌（或細(xì)胞）的大量培養(yǎng)與目的蛋白的生產(chǎn)

重組DNA技術(shù)（基因工程）基本原理：目的基因的獲取重組DNA80（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)

（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法81（二）基因載體的選用定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA（二）基因載體的選用定義常用載體82載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；83質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn)

能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn)84第19章藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)課件85（三）限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ（三）限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictio86BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC87（四）重組體的構(gòu)建即外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接（四）重組體的構(gòu)建1.粘性末端連接88BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCT4DNA連接酶GATC892.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端2.平端連接90目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體913.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。3.同聚物加尾連接925′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′3′載體DNA5′3′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶93受體菌條件

安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)（五）重組DNA導(dǎo)入受體菌受體菌條件導(dǎo)入方式（五）重組DNA導(dǎo)入受體菌94（六）重組體的篩選1.重組體的表型進(jìn)行篩選

抗藥性標(biāo)記篩選、營(yíng)養(yǎng)素的依賴篩選2.限制酶切圖譜分析鑒定3.利用核酸雜交技術(shù)進(jìn)行鑒定（六）重組體的篩選95(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇目錄(插入失活法)目錄96組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體標(biāo)志補(bǔ)救組氨酸缺陷無組氨酸酵母咪唑甘油磷促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體97重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為

小結(jié)分分離目的基因

切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌

篩篩選重組體

重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基98DNA重組技術(shù)的主要應(yīng)用：1.運(yùn)用DNA重組技術(shù)大量生產(chǎn)基因工程藥物。2.定向改造生物的基因結(jié)構(gòu)，構(gòu)建高產(chǎn)菌株，用于改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)。3.用于基礎(chǔ)研究，用于基因結(jié)構(gòu)與基因組功能的調(diào)節(jié)研究，用于分子雜交等。DNA重組技術(shù)的主要應(yīng)用：1.運(yùn)用DNA重組技術(shù)大量生產(chǎn)基因99第二節(jié)

藥物質(zhì)量控制的生物化學(xué)基礎(chǔ)第二節(jié)

藥物質(zhì)量控制的生物化學(xué)基礎(chǔ)100一、藥物質(zhì)量控制的常用生化分析法（一）免疫分析法1.免疫擴(kuò)散法2.免疫電泳法3.放射免疫測(cè)定法（RIA）4.酶聯(lián)免疫測(cè)定法（ELISA）就是讓抗體或抗原與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過顯色來檢測(cè)。一、藥物質(zhì)量控制的常用生化分析法（一）免疫分析法4.酶聯(lián)101（二）電泳分析法（二）電泳分析法102第19章藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)課件103（三）酶法分析（三）酶法分析1041.終止反應(yīng)法2.連續(xù)測(cè)定法3.循環(huán)放大分析法1.終止反應(yīng)法105二、生物藥物質(zhì)量控制的生化分析方法（一）多肽與蛋白質(zhì)類藥物的主要分析方法1.蛋白質(zhì)藥物的純度分析聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)SDS毛細(xì)管電泳(CE)等電聚焦(IEF)高效液相色譜法(HPLC)二、生物藥物質(zhì)量控制的生化分析方法（一）多肽與蛋白質(zhì)類藥物1062.多肽與蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定使用較多的是超速離心法，凝膠層析法和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法等。超速離心法凝膠層析法2.多肽與蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定超速離心法凝膠層析法107SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法1083.蛋白質(zhì)的定量測(cè)定（1）物理性質(zhì)：紫外分光光度法，折射率法，比濁法。（2）化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法，雙縮脲比色法，F(xiàn)olin-酚法，BCA法。（3）染色性質(zhì)：考馬斯亮蘭G-250結(jié)合法、銀染、金染。（4）其他：熒光激發(fā)。3.蛋白質(zhì)的定量測(cè)定1094.膠體金比色法膠體金是一種帶負(fù)電荷的疏水性膠體，加入蛋白質(zhì)后，紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，595nm處測(cè)定樣品的吸收值，計(jì)算含量。4.膠體金比色法1105.生物質(zhì)譜法：多肽和蛋白質(zhì)的分子量可用MALDI/MS（基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜法）或ESI/MS（電噴霧離子化質(zhì)譜法）直接測(cè)定，用質(zhì)譜法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量簡(jiǎn)便，快速、靈敏、準(zhǔn)確。5.生物質(zhì)譜法：111（二）核酸類藥物的主要分析方法1.紫外分光光度法：測(cè)定RNA與DNA含量260nm2.地衣酚顯色法測(cè)定RNA含量3，5-二羥甲苯3.二苯胺法測(cè)定DNA含量（二）核酸類藥物的主要分析方法1.紫外分光光度法：112（三）酶類藥物的分析酶類藥物的主要質(zhì)量指標(biāo)是它的催化活力。（四）重組DNA藥物中的可能雜質(zhì)檢查

1.外源性DNA2.宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)3.二聚體或多聚體的測(cè)定4.降解產(chǎn)物的測(cè)定（三）酶類藥物的分析（四）重組DNA藥物中的可能雜質(zhì)檢查113第三節(jié)

藥理學(xué)研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)第三節(jié)

藥理學(xué)研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)114神經(jīng)遞質(zhì)又稱突觸分泌信號(hào)(synapticsignal)特點(diǎn)由神經(jīng)元細(xì)胞分泌；通過突觸間隙到達(dá)下一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞；作用時(shí)間較短。例如：乙酰膽堿、去甲腎上腺素等一、藥物作用的生物化學(xué)基礎(chǔ)（一）神經(jīng)傳導(dǎo)與神經(jīng)遞質(zhì)神經(jīng)遞質(zhì)又稱突觸分泌信號(hào)(synapticsignal)特115乙酰膽堿受體功能模式圖1.受體-離子通道型（二）受體的結(jié)構(gòu)與功能乙酰膽堿受體功能模式圖1.受體-離子通道型（二）受體的結(jié)構(gòu)116※G蛋白(guanylatebindingprotein)是一類和GTP或GDP相結(jié)合、位于細(xì)胞膜胞漿面的外周蛋白，由、、三個(gè)亞基組成。有兩種構(gòu)象：非活化型；活化型2．受體-G蛋白-效應(yīng)蛋白型※G蛋白(guanylatebindingprotei117RＲHACγαβGDPαGTPβγ腺苷酸環(huán)化酶ACATPcAMPRＲHACγαβGDPαGTPβγ腺苷酸環(huán)化酶ACATPcA118與配體結(jié)合后具有酪氨酸蛋白激酶活性，如胰島素受體insulingrowthfactorreceptor,IGF-R

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGF-R)。與配體結(jié)合后具有酪氨酸蛋白激酶活性，如胰島素受體insul1194．受體-轉(zhuǎn)錄因子型高度可變區(qū)位于N端，具有轉(zhuǎn)錄活性DNA結(jié)合區(qū)含有鋅指結(jié)構(gòu)激素結(jié)合區(qū)位于C端，結(jié)合激素、熱休克蛋白，使受體二聚化，激活轉(zhuǎn)錄鉸鏈區(qū)4．受體-轉(zhuǎn)錄因子型高度可變區(qū)位于N端，具有轉(zhuǎn)錄活性DNA結(jié)120第19章藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)課件121（三）跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）不同種類的受體使用由共同組分構(gòu)成的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)（2）在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中不同類型的磷酸化同時(shí)起作用（三）跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)122（四）細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與藥物研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的激動(dòng)劑和抑制劑是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)藥物的研究出發(fā)點(diǎn)，尤其是各種蛋白激酶的抑制劑更是被廣泛用做母體藥物進(jìn)行抗腫瘤新藥。（四）細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與藥物研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的激動(dòng)劑123信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)干擾藥物的藥效和副作用

取決于：一、它所干擾的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在體內(nèi)是否廣泛存在，如果廣泛存在各細(xì)胞內(nèi)，副作用難以控制。二、藥物自身的選擇性，對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的選擇性越高，副作用越小。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)干擾藥物的藥效和副作用

取決于：一、它所干擾的信號(hào)轉(zhuǎn)124（五）藥物作用的靶酶藥物對(duì)靶酶的作用：

調(diào)節(jié)酶量調(diào)節(jié)酶活力（五）藥物作用的靶酶125酶抑制劑應(yīng)用臨床的條件：（1）被抑制的靶酶所催化的生化反應(yīng)與某種疾病的發(fā)生有關(guān)，具有治療作用。（2）酶抑制劑具有特異性。（3）具有某種藥動(dòng)學(xué)特征，能到達(dá)作用部位、具有合理、可預(yù)見的量效關(guān)系和作用持續(xù)時(shí)間。（4）對(duì)人體毒性小，療效指數(shù)高。（5）應(yīng)符合藥品標(biāo)準(zhǔn)。酶抑制劑應(yīng)用臨床的條件：（1）被抑制的靶酶所催化的生化反應(yīng)與126（六）細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子1.細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子類2.細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子類（六）細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子127（七）細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)

細(xì)胞凋亡是某些生理或病理?xiàng)l件下，細(xì)胞接受到某種信號(hào)所觸發(fā)的并按一定程序進(jìn)行的主動(dòng)、緩慢的死亡過程。

生化特征：（1）DNA片段化（2）谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、鈣蛋白酶激活：