獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)第七章動物性食品中主要病原微生物的檢驗與控制-2課件

主講教師：杜愛芳教授第七章動物性食品中主要病原微生物的檢驗與控制

主講教師：杜愛芳教授第七章2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu2第一節(jié)概述2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu3食源性疾病世界衛(wèi)生組織將食源性疾病定義為“凡是通過攝食而進(jìn)入人體的病原體，使人體患感染性或中毒性疾病，統(tǒng)稱為食源性疾病”。

可分為感染性和中毒性，包括常見的食物中毒、腸道傳染病、人畜共患傳染病、寄生蟲病以及化學(xué)性有毒有害物質(zhì)所引起的疾病。食源性疾患的發(fā)病率居各類疾病總發(fā)病率的前列，是當(dāng)前世界上最突出的衛(wèi)生問題之一。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu4食源性疾病是世界各國面臨的主要公共衛(wèi)生問題之一，即便是在歐美發(fā)達(dá)國家患食源性疾病的人群可高達(dá)30%。美國每年患食源性疾病的人數(shù)多達(dá)7600萬，其中30多萬病人需要住院治療，死亡5000余人；美國因動物性食品引起的疾病占各類食源性疾病的60%以上，以海產(chǎn)品和肉類為主；歐洲國家的食源性疾病半數(shù)以上也由動物性食品引起，以肉類和蛋類為主。發(fā)展中國家的食源性疾病問題更加突出。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu5根據(jù)美國疾病預(yù)防與控制中心統(tǒng)計，在二十世紀(jì)九十年代由各種原因引起的食源性疾病中，細(xì)菌性占90%，化學(xué)性僅占3%。部分歐洲國家自1985年以來，沙門氏菌和空腸彎曲桿菌引起食源性疾病發(fā)生率增幅高達(dá)五倍。在美國，2000年由空腸彎曲桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、非O157:H7類大腸桿菌和李斯特菌等五種細(xì)菌引起的食物中毒病人達(dá)340萬，死亡1229人，經(jīng)濟(jì)損失69億美元；其中僅沙門氏菌中毒就造成553人死亡。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu6根據(jù)國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)部分資料的分析結(jié)果顯示，我國食源性疾病的高危食品依次為：肉類、糧食、海產(chǎn)品、水果蔬菜、雞蛋、豆類、奶。衛(wèi)生部2003年收到的1481起食源性疾病報告中，已經(jīng)明確由動物或植物性食物污染所引起的疾病比例接近（約各占30%），而其中因微生物污染引起的食源性疾病比例近40%，遠(yuǎn)高于化學(xué)性食物中毒（20%）。綜觀國內(nèi)外食源性疾病的發(fā)病情況，不難看出動物性食品中微生物污染是人類食源性疾病的主要問題。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu7對于食品中微生物的安全控制問題，1999年第32屆國際食品衛(wèi)生法典委員會上各國政府達(dá)成共識，認(rèn)為食品的微生物安全性要控制在原料生產(chǎn)、配方、加工等環(huán)節(jié)，而不僅僅是終產(chǎn)品的檢驗。因為微生物的污染可能發(fā)生在食品加工的任何一個環(huán)節(jié)，甚至加熱滅菌后的包裝、運輸和銷售等都有可能出現(xiàn)問題。

2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu8要實行從農(nóng)場到餐桌（FROMFARMTOTABLE）的全程食品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)控體系，即從動物養(yǎng)殖、屠宰加工、貯存、運輸、銷售過程中運用HACCP（有害物質(zhì)分析與關(guān)鍵控制點）體系。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu9從農(nóng)場到餐桌FromFarmtoTable源頭污染？屠宰加工污染？儲存運輸不當(dāng)？烹飪不當(dāng)？2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu10有害物質(zhì)分析及關(guān)鍵控制點

HazardAnalysis&CriticalControlPoints危害分析確定關(guān)鍵控制點確定關(guān)鍵限值建立監(jiān)控措施建立糾偏措施有效的記錄系統(tǒng)審核措施2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu11自由討論:從原料接受到成品的加工過程(工藝流程圖)的每一個操作步驟危害發(fā)生的可能性進(jìn)行討論。通常根據(jù)工作經(jīng)驗、流行病學(xué)數(shù)據(jù)及技術(shù)資料的信息來評估其發(fā)生的可能性。危害評估:

對每一個危害的風(fēng)險極其嚴(yán)重程度進(jìn)行分析，以決定食品安全危害的顯著性。危害分析2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu12危害分析---根據(jù)各種危害發(fā)生的可能風(fēng)險(可能性和嚴(yán)重性)來確定一種危害的潛在顯著性2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu132022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu142022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu15美國1998爆發(fā)的細(xì)菌性疾病病例(%)

病例/每10萬人空腸彎曲桿菌4,025(44)21沙門氏菌2,839(31)12志賀氏菌1,480(16)8大腸桿菌O157：H7500(5)3小腸耶爾森菌181(2)1.0單增李斯特菌112(1)0.6總共9,137(100)2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu16食源性病原菌的致死率比較沙門氏菌

31%李斯特菌 28%弓形體 21%諾沃克病毒 7%彎曲桿菌 5%大腸桿菌O157:H73%2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu17其中已知中毒食物其中已知致病因素我國衛(wèi)生部收到的食源性疾病發(fā)病情況(2002-2003)年份總計動物性(%)植物性(%)微生物(%)化學(xué)物(%)中毒起數(shù)中毒人數(shù)死亡人數(shù)2002200320022003200220034641481115722966068262141(30.4)473(29.5)4110(35.5)11367(38.3)17(25)37(14.1)175(37.3)450(30.4)4942(42.7)7693(25.9)31(45.6)104(39.7)164(35.3)590(39.8)6320(54.6)16038(54.1)6(8.8)12(4.6)129(27.8)294(19.9)2332(20.2)3605(12.2)36(52.9)100(38.2)2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu18上世紀(jì)九十年代爆發(fā)食源性疾病的食品種類2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu19食源性疾病致病因子的分布2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu20食源性疾病所涉及的食品2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu21肉類奶類蛋類禽類2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu22第二節(jié)動物性食品中菌落總數(shù)與大腸桿菌的檢驗2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu23動物性食品中微生物污染可能途徑包括：①食品原料本身的污染，動物在宰前均經(jīng)過檢疫，表現(xiàn)臨床癥狀的患病動物均不得屠宰上市。但若隱性感染的動物難以通過一般的檢疫方法檢出，其宰后的產(chǎn)品中就有可能污染致病性細(xì)菌，患隱性乳腺炎奶牛生產(chǎn)的牛奶中也有致病性細(xì)菌的污染。②動物養(yǎng)殖環(huán)境中的微生物對食品原料的污染，如開放式擠奶條件下環(huán)境中（包括奶牛乳房皮膚上的）的微生物很容易污染正常乳腺中產(chǎn)出的、原本沒有細(xì)菌的牛奶。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu24動物性食品中微生物污染可能途徑包括：③屠宰過程中的污染，屠宰車間衛(wèi)生、加工設(shè)施表面殘存的微生物可以污染胴體，或開膛去內(nèi)臟過程中不慎刺破腸管，腸內(nèi)容物及其微生物污染胴體。④深加工動物性食品可受到加工車間、加工設(shè)備表面殘存微生物的污染，從業(yè)人員如患有腸道傳染病或者是帶菌者，能通過操作過程使病原微生物污染食品。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu25動物性食品中微生物污染可能途徑包括：⑤食品從加工出廠、貯存、運輸、銷售過程中也可以受到相應(yīng)環(huán)境中微生物的污染，尤其是包裝封口破損的食品。⑥在家庭、賓館等廚房中生熟食品的交叉污染。食品被致病性微生物污染后，食用前不經(jīng)加熱和加熱不徹底，其中的微生物在適宜的溫度、水分、pH和營養(yǎng)條件下會大量繁殖或產(chǎn)生毒素，以致食用后引起疾病。綜上，檢驗動物性食品中是否有致病性微生物污染，并了解其污染程度對確保食品安全性具有重要意義。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu26細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)已被世界各國用來作為衡量食品被微生物污染程度指標(biāo)，如果加工食品中沒有大腸菌群，那么其中還有致病性腸道菌的可能性微乎其微。國家標(biāo)準(zhǔn)對每一種食品都規(guī)定了細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群限量，如果某一種食品被檢出超過限量，說明生產(chǎn)企業(yè)或銷售單位在生產(chǎn)、運輸、貯存該食品時，在某一環(huán)節(jié)上的操作出現(xiàn)偏差，為不合格食品，食用后可能對人體健康構(gòu)成潛在威脅。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu27菌落總數(shù)

菌落總數(shù)是指一定培養(yǎng)條件下（如需氧狀況、培養(yǎng)基成分、pH、培養(yǎng)溫度和時間等）每克（每毫升）食物樣品中所生長出來的細(xì)菌菌落總數(shù)。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu28這一指標(biāo)主要是用來判定食品被細(xì)菌污染的程度，在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣，并反映食品的生產(chǎn)過程是否符合衛(wèi)生要求。這一方法也可用于觀察細(xì)菌在食品中的消長動態(tài)，以便對被檢食物的加工過程或保存條件進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu29大腸菌群

大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，包括腸桿菌科的大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬和克雷伯菌屬細(xì)菌，這些細(xì)菌可來自人和溫血動物的腸道，人、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有無腸道致病菌污染的可能。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu30因此，大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是食品衛(wèi)生學(xué)用語，它指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu31食品中大腸菌群數(shù)以100ml（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最大可能數(shù)（MaximumProbableNumber,MPN）表示。大腸菌群數(shù)的高低，表明糞便污染的程度，主要用于衡量水的衛(wèi)生質(zhì)量,也可反映食品加工過程中的衛(wèi)生狀況。若食品被糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食源性疾病的威脅，對人體健康具有潛在的危險性。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu32此外，也有用耐熱大腸菌群作為指標(biāo)，這是一類在含乳糖的液體培養(yǎng)基中經(jīng)44.5℃培養(yǎng)，24h內(nèi)能產(chǎn)酸產(chǎn)氣的細(xì)菌。作為糞便污染指標(biāo)菌，耐熱大腸菌群與大腸菌群相似，主要以其檢出情況來判斷食品是否受到了糞便污染。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu33通常情況下，耐熱大腸菌群與大腸菌群相比，在人和動物糞便中所占的比例較大，而且由于在自然界容易死亡等原因，耐熱大腸菌群的存在可認(rèn)為食品直接或間接地受到了比較近期的糞便污染。因而，耐熱大腸菌群在食品中的檢出，說明食品加工過程的衛(wèi)生狀況差，腸道致病菌污染的可能性更大。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu34食源性疾病主要食源性病原菌沙門氏菌致病性大腸桿菌空腸彎曲桿菌單核細(xì)胞增多性李斯特菌副溶血弧菌2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu35

沙門氏菌病

(Salmonellosis)沙門氏菌病是由不同種沙門氏菌引起的一類人畜共患急性腸道傳染病總稱，包括傷寒、副傷寒和其它一些以腸炎為特征的沙門氏菌感染。傷寒沙門氏菌和副傷寒沙門氏菌常統(tǒng)稱為傷寒沙門氏菌，主要感染人類,本節(jié)僅討論非傷寒沙門氏菌引起的沙門氏菌病。

2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu36地理分布及危害被認(rèn)為是目前世界范圍內(nèi)最重要的食媒性病原之一，主要通過食用受沙門氏菌污染的肉、乳、蛋而發(fā)病。在歐美發(fā)達(dá)國家，人類沙門氏菌病發(fā)生率高達(dá)萬分之十，在細(xì)菌性食物中毒病原中，沙門氏菌所占的比例在20%-30%。本病在畜禽中主要引起敗血癥和腸炎，在一些地區(qū)和養(yǎng)殖場造成的危害相當(dāng)嚴(yán)重。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu37病原特性革蘭氏陰性桿菌。沙門氏菌屬分為5個亞屬，2000多個血清型。獸醫(yī)上重要的沙門氏菌血清型幾乎都在亞屬I中。我國發(fā)現(xiàn)的血清型約近120個。許多血清型沙門氏菌具有產(chǎn)生毒素的能力，尤其是腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu38病原抵抗力對外界環(huán)境有一定的抵抗力，可存活數(shù)周或數(shù)月，如在水、牛奶、肉類和蛋類制品中可存活數(shù)周至數(shù)月，在糞便中可存活1-10個月，在18-20℃、鹽分為5%-8%時可存活30多天。對熱有一定的抵抗力，60℃1h，70℃20min，75℃5min才能滅活，在肉類產(chǎn)品中還需延長時間才能將其殺死。本菌對化學(xué)消毒劑的抵抗力不強(qiáng)，常用的消毒劑和消毒方法均能達(dá)到消毒目的。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu392022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu40具鞭毛2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu412022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu42食源性沙門氏菌病的傳播源

患病畜禽是沙門氏菌病的主要傳染源，其次為受感染的鼠類和其他野生動物，其感染率為1%-40%或更高；帶菌的食品加工工作人員也是重要的傳染源。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu43臨診特征-人沙門氏菌經(jīng)口進(jìn)入人體后，在腸道內(nèi)大量繁殖，并經(jīng)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液，造成一過性菌血癥。隨后，沙門氏菌在腸道和血液中受到機(jī)體的抵抗而被裂解和破壞，釋放大量內(nèi)毒素，使人出現(xiàn)中毒癥狀。臨床上可分為四型。胃腸炎型：此型最為常見，約占70%。潛伏期為4-24h。起病較急，多有畏寒、發(fā)熱（38-39℃），初有腹部不適，繼而腹痛、惡心、嘔吐及腹瀉。兒童常出現(xiàn)驚厥、抽搐和昏迷等癥狀。死亡率較低。病程可持續(xù)幾天甚至幾個星期。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu44臨診特征-人傷寒型：多由豬霍亂沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌。潛伏期3-10d，表現(xiàn)為長期發(fā)熱（弛張熱或稽留熱），全身不適，腹瀉等，病程1-2周。敗血癥型：多由豬霍亂沙門氏菌引起。大多起病急驟，患者畏寒、發(fā)熱，熱型不規(guī)則或間歇發(fā)熱，持續(xù)1-3周不等。胃腸道癥狀不顯著。

2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu45局部化膿感染型

患者多在發(fā)熱階段或退熱以后出現(xiàn)一處或幾處局部化膿灶，發(fā)病前無敗血癥癥狀。化膿病灶可發(fā)生在任何部位，如可發(fā)生肺膿腫、胸膜炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎等。以上四種臨床類型不易明確區(qū)分，常相互重疊或繼發(fā)。臨診特征-人2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu46臨診特征-動物

（1）牛：潛伏期長短不一，一般1-3周，以敗血癥、毒血癥和出血性腸炎為特征。成年牛常以高熱（40-41℃）、昏迷、食欲廢絕、呼吸困難開始，體力迅速衰竭，大多數(shù)病牛于發(fā)病后12-24小時，糞便帶血，不久即變?yōu)橄铝?。懷孕母牛多?shù)發(fā)生流產(chǎn)。在犢牛，如牛群內(nèi)存在帶菌母牛則可于生后48小時內(nèi)即表現(xiàn)拒食、臥地、迅速衰竭等癥狀，常于3-5日內(nèi)死亡。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu47犢牛拉稀，失水消瘦，最后不能站立而虛脫死亡2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu48臨診特征-動物

（2）豬：急性病豬主要表現(xiàn)為敗血癥，但以亞急性和慢性者較為多見，特征性病變?yōu)閴乃佬阅c炎，潛伏期一般由2天到數(shù)周不等，臨床癥狀與腸型豬瘟很相似。（3）羊和兔臨床主要以下痢和流產(chǎn)為特征。（4）家禽：雛禽的禽副傷寒常呈敗血癥經(jīng)過而迅速死亡，雞白痢常侵害2-3周齡的雛雞，禽傷寒主要發(fā)生于中雞、成雞和火雞，癥狀與雞白痢相似。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu49病豬腹瀉，失水，消瘦2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu50病豬生長受阻，往往成為僵豬2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu51食品中沙門氏菌的檢測

1.形態(tài)與培養(yǎng)特性鑒定

通過選擇性平板中（如SS瓊脂等）的菌落特征進(jìn)行初步確認(rèn)。

2.生化反應(yīng)

根據(jù)其生化反映特征：發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，能發(fā)酵麥芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖、VP反應(yīng)陰性，不水解尿素等進(jìn)行確認(rèn)。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu52

3.血清型鑒定

分離株的血清型鑒別可應(yīng)用多價分群抗O血清進(jìn)行凝集試驗，再用O抗原單因子血清來測定待檢菌的O抗原組成。按照確定的O群，再用H因子對第一相或第二相H抗原進(jìn)行血清學(xué)分型。國內(nèi)有學(xué)者研制出沙門氏菌A-F群O抗原的單克隆抗體，以及抗沙門氏菌鞭毛蛋白共同抗原的屬特異性單克隆抗體，可用于凝集和免疫熒光等方法檢出沙門氏菌。病原性沙門氏菌O抗原單抗免疫熒光染色照片食品中沙門氏菌的檢測2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu53

4.免疫學(xué)檢測方法

（1）免疫熒光法

用熒光素標(biāo)記特異抗體，利用抗原抗體特異性結(jié)合的特性來檢測未知抗原，即用熒光顯微鏡直接觀察特異抗原抗體復(fù)合物的熒光。

食品中沙門氏菌的檢測2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu54

（2）酶聯(lián)免疫吸附法

以沙門氏菌屬特異性單克隆抗體為基礎(chǔ)，ELISA法可用于蛋品、鮮奶、肉品中沙門氏菌的檢測,與傳統(tǒng)方法相比,敏感性和特異性均較理想。具體方法：將沙門氏菌增菌培養(yǎng)液直接包被微孔板,封閉后加酶標(biāo)單抗，作用一定時間后加入底物呈色后終止反應(yīng)（直接ELISA）；或先后分別加單克隆抗體和酶標(biāo)二抗,再加底物顯色。

2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu555.噬菌體裂解試驗

利用噬菌體能特異性地裂解宿主菌的特性。挑取鑒別培養(yǎng)基上的可疑菌落,在蛋白胨水中培養(yǎng)(37℃過夜)，若菌液渾濁，則作1:200稀釋,再用滅菌棉簽在表面烘干的瓊脂平皿上作條狀涂布,待平板菌液干燥后，用微量加樣器依次在每個區(qū)域滴加沙門氏菌噬菌體進(jìn)行裂解試驗，沙門氏菌屬內(nèi)裂解率在95%-99.6%之間。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu566.分子生物學(xué)檢測方法

(1)PCR檢測該法有快速、特異、敏感等優(yōu)點，在沙門氏菌檢測中具有較好的應(yīng)用前景。其可靠性部分依賴于目標(biāo)模板的純度和足夠的目標(biāo)分子數(shù)量，大多數(shù)PCR檢測要求富集步驟，如選擇性增菌或免疫磁珠吸附。

2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu57PCR檢測沙門氏菌關(guān)鍵在于靶基因的選擇。沙門氏菌血清型眾多，不同血清型等位基因的DNA序列也不完全相同。目前用于PCR檢測的靶基因主要是其毒力相關(guān)基因：①編碼沙門氏菌鞭毛蛋白的基因；②編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白的基因；③編碼沙門氏菌O抗原的rfb基因序列；④編碼與莢膜多糖合成相關(guān)的基因；⑤編碼菌毛的基因序列。

2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu586.分子生物學(xué)檢測方法

(2)核酸探針沙門氏菌的核酸探針檢測技術(shù)多為屬特異性，而以特異性16SrRNA和23SrRNA作為探針的檢測方法敏感性更高。而且rRNA為單鏈，雜交前無需經(jīng)過變性步驟。此法最低檢測量為105cfu/ml，在食品樣品中含菌量少的情況下，需要預(yù)增菌后進(jìn)行探針檢測。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu59食品中沙門氏菌污染的主要控制措施

1.加強(qiáng)食品衛(wèi)生管理，防止污染要進(jìn)行嚴(yán)格的宰前和宰后檢驗，區(qū)分出健康家畜和沙門氏菌病病畜，并按照《肉品衛(wèi)生檢驗試行規(guī)程》進(jìn)行處理，經(jīng)檢驗合格的肉方可正常出售；條件性可食肉，則應(yīng)無害化處理后方能發(fā)售市場。屠宰牲畜時，避免肉類和內(nèi)臟被毛皮、糞便、污水、容器和不可食肉等污染。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu60食品中沙門氏菌污染的主要控制措施2.控制繁殖沙門氏菌的最適繁殖溫度為37℃，但在20℃以上即能大量繁殖。因此低溫貯存食品是一項重要預(yù)防措施。3.殺滅病原菌加熱殺滅病原微生物也是預(yù)防食物中毒的重要措施。可疑食物如肉類、內(nèi)臟、蛋類、禽類等要徹底煮熟，大塊食物要煮透，以防止外熟內(nèi)生；生、熟食品嚴(yán)格分開，防止交叉污染。

2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu61病畜的衛(wèi)生處理（1）血液及內(nèi)臟化制或銷毀；（2）胴體無病變或病變輕微時，高溫處理后出廠（場）；（3）肌肉有顯著病變時，化制或銷毀。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu62大腸桿菌病(Colibacillosis)為致病性大腸桿菌引起的人畜共患的一類疾病的總稱。在人類主要引起食物中毒、嬰兒腹瀉、新生兒腦膜炎、尿路感染、敗血癥等疾患，在動物主要引起幼齡畜禽腹瀉和敗血癥。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu63病原特性兩端鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌,有莢膜、大多數(shù)菌株有鞭毛、運動活潑，但不形成芽孢，在普通培養(yǎng)基上生長迅速。大腸桿菌O抗原171種，K抗原103種，H抗原60種，從而構(gòu)成許多種不同的血清型。

2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu64病原特性引起人腸道感染的大腸桿菌根據(jù)其致病性和發(fā)病機(jī)理主要分為：腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸產(chǎn)毒素性大腸桿菌（ETEC）、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）。EHEC是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種大腸桿菌，其血清型為O157：H7，這種病原菌產(chǎn)生志賀氏毒素樣細(xì)胞毒素，主要引起人出血性腹瀉，與其它大腸桿菌不同的是該血清型的大腸桿菌在24h內(nèi)不發(fā)酵山梨醇，因此，可以用山梨醇-麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行初步鑒別。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu652022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu662022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu672022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu682022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu69小腸上的E.coilEPEC2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu70食源性大腸桿菌病及其危害

大腸桿菌正常情況下不致病，而且還能合成維生素B和K，產(chǎn)生大腸菌素，對機(jī)體有利。但當(dāng)機(jī)體抵抗力下降或大腸桿菌侵入腸外組織或器官時，可作為條件性致病菌而引起腸道外感染。有些血清型可引起腸道感染，如上述EPEC、ETEC、EIEC和EHEC。EPEC主要引起新生兒的腹瀉，帶菌的牛和豬是傳播本菌并引起食物中毒的重要原因，人也可以作為帶菌者而污染食品。

2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu71食源性大腸桿菌病及其危害

大腸桿菌性腹瀉是許多發(fā)展中國家嬰幼兒發(fā)病和死亡的主要原因之一，也是旅游者腹瀉的重要原因之一，臨床表現(xiàn)以腹瀉為主。人及豬、牛、羊、家禽等對本病均易感。其主要傳染源是患病的兒童、幼畜及帶菌的人和畜。病原菌隨糞便排出，通過污染食物、飲水、飼料和周圍環(huán)境傳播本病。人主要通過污染的手、飲水、食品、飲料及用具等經(jīng)消化道感染。大腸桿菌O157：H7主要污染牛肉和牛奶。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu72食源性大腸桿菌病及其危害

人的大腸桿菌病多發(fā)于兒童，但旅游者中無年齡差異；一般多見于夏秋兩季。在發(fā)展中國家常呈地方性流行，發(fā)達(dá)國家則以散發(fā)為主。由大腸桿菌O157:H7引起的食物中毒主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、便血等出血性腸炎癥狀，嚴(yán)重時可并發(fā)出血性尿毒癥，曾在北美、澳大利亞、非洲、歐洲出現(xiàn)過，1996年在日本也發(fā)生過大腸桿菌O157:H7引起的食物中毒。我國自1987年以來曾在江蘇、山東、北京等地分離到大腸桿菌O157:H7。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu73臨診特征-人由EHEC（O157：H7）引起者，呈急性發(fā)病，突發(fā)性腹痛，先排水樣糞便，后轉(zhuǎn)為血性糞便、嘔吐、低燒或不發(fā)燒。嬰兒能導(dǎo)致溶血性尿毒綜合癥，難以恢復(fù)。人感染O157：H7后也可表現(xiàn)為無癥狀的隱性感染，但有傳染性。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu74臨診特征-人發(fā)病大多急驟，由EPEC和ETEC所致者主要表現(xiàn)為腹瀉，伴惡心、嘔吐、腹痛等表現(xiàn)。多發(fā)于嬰幼兒，成人一般癥狀較輕，數(shù)日可愈。少數(shù)病情嚴(yán)重者，可呈霍亂樣腹瀉或表現(xiàn)為菌痢性腸炎。若為EIEC引起者則主要表現(xiàn)為腹瀉，瀉糞中帶有膿血等。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu75臨診特征-動物①豬：豬的大腸桿菌病主要有仔豬黃痢、白痢和豬水腫病。黃痢多發(fā)生于1周齡以內(nèi)的仔豬，臨床上以腹瀉、糞便呈水樣或黃色漿糊狀為特征，病畜可因脫水和虛脫而死亡。發(fā)病率和死亡率可高達(dá)90%。白痢多發(fā)于10-30日齡的仔豬，臨床上以腹瀉，糞便呈白色漿糊狀糞便為特征。豬水腫病多發(fā)生于斷奶仔豬，以顏面部和頸部水腫、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為特征，發(fā)病率10%-35%，但死亡率可高達(dá)90%。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu76仔豬黃痢、消瘦病豬眼瞼水腫2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu77臨診特征-動物②牛：以犢牛和10日齡犢較多發(fā)生。臨床上分為敗血型、腸毒血型和腸型。敗血型主要發(fā)生于未吃過初乳的7日齡以內(nèi)幼犢；腸毒血型主要發(fā)生于吃過初乳的7日齡以內(nèi)幼犢，但較少見；腸型多見于7-10齡吃過初乳的幼犢。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu78臨診特征-動物③羊：多見于數(shù)日齡至6周齡的羔羊，潛伏期數(shù)小時至兩天。臨床上分為敗血型和腸型。前者主要發(fā)生于2-6周齡的羔羊；后者主要發(fā)生于7日齡內(nèi)羔羊。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu79臨診特征-動物④家禽：潛伏期數(shù)小時至3天不等。急性者體溫上升，常無腹瀉，突然死亡。經(jīng)卵感染或在孵化后感染的雞胚，出殼幾天內(nèi)可發(fā)生大批急性死亡。慢性者劇烈腹瀉，糞便灰白色，有時混有血液，死前抽搐和轉(zhuǎn)圈運動。成年雞感染后，多表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜炎、輸卵管炎和腹膜炎。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu80食品中致病性大腸桿菌的檢測

1．形態(tài)與培養(yǎng)特性鑒定

革蘭氏陰性桿菌，對一般堿性染料著色良好，有時兩端略深，散在或成對。大多數(shù)菌株有周鞭毛，能運動。有些菌株在血瓊脂平板上生長后可見β型溶血環(huán)。在麥康凱培養(yǎng)基上，能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生紅色菌落；在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上大腸桿菌能特征性地生長成紫黑色帶有金屬光澤的菌落；在遠(yuǎn)藤氏瓊脂上形成帶金屬光澤的紅色菌落；在液體培養(yǎng)基中呈均勻混濁生長，管底有粘性沉淀。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu812.生化反應(yīng)

大部分菌株發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖等產(chǎn)酸產(chǎn)氣。吲哚,甲基紅,VP,檸檬酸試驗分別呈“+、+、-、-”即為典型大腸桿菌。各菌株對蔗糖、水楊苷及棉子糖的發(fā)酵能力不一致，尿素酶陰性，不形成硫化氫，不能在含KCN的培養(yǎng)基中生長，不利用丙二酸鹽，可使谷氨酸和賴氨酸脫羧基，苯丙氨酸反應(yīng)亦為陰性。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu82大腸桿菌的生化試驗2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu833.血清學(xué)檢驗

取固體培養(yǎng)物用0.5%NaCl洗下后制成濃菌液并分成兩份，一份經(jīng)100℃水浴處理1h，另一份加0.5%福爾馬林37℃處理2448h。分別用各種抗O血清和抗OK血清對上述菌液進(jìn)行玻片凝集試驗。若菌株含K抗原，則各種抗O血清不能使福爾馬林處理菌液凝集，但可被某種抗OK血清凝集。H抗原鑒定前，將純化的細(xì)菌先在半固體培養(yǎng)基中傳2代以上，再在肉湯中37℃培養(yǎng)18-24h，加等量含0.5%福爾馬林的0.5%NaCl溶液，37℃處理46h后即可用各種抗H血清進(jìn)行鑒定。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu844.免疫學(xué)檢測方法

（1）酶聯(lián)免疫吸附法大腸桿菌有O、K、H和F四種抗原，其檢測取決于相應(yīng)抗體的特異性。如以兔抗血清為捕獲抗體，以相應(yīng)的單克隆抗體為檢測抗體，進(jìn)行雙抗夾心ELISA法，穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，對純培養(yǎng)菌液的檢出限為103-104cfu/ml，具有良好的敏感性和特異性。染菌樣品經(jīng)選擇性增菌后進(jìn)行夾心ELISA方法檢測，檢出限可達(dá)0.1cfu/g(或ml)食品，能夠基本滿足食品樣品中大腸桿菌O157的檢測需要。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu854.免疫學(xué)檢測方法

（2）免疫磁珠分離法具有固相化試劑特有的優(yōu)點和免疫反應(yīng)的高度專一性，用這種基于免疫吸附的分離方法進(jìn)行目標(biāo)細(xì)菌富集，再與其它檢測方法結(jié)合，檢測的敏感性更高、特異性更強(qiáng)。利用免疫吸附原理制備吸附有腹瀉性大腸桿菌診斷血清的磁珠，可以特異性地吸附樣品中的大腸桿菌，然后依據(jù)致病性大腸桿菌能在37℃發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣這一特征進(jìn)行鑒定，該法簡單、快速、易操作、靈敏度高。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu865.分子生物學(xué)檢測方法

（1）PCR檢測PCR方法在大腸桿菌O157：H7檢測中的試驗研究較多，根據(jù)EHEC毒力基因eaeA、hlyA和志賀樣毒素(slt）序列設(shè)計引物,利用多重PCR方法同時檢測這三種毒力基因,以提高特異性。除常見的O157∶H7血清型外,也可檢出其它血清型大腸桿菌如O26∶H11、O111∶H8中的EHEC菌株。此外,該法還可檢測產(chǎn)志賀樣毒素大腸桿菌(VTEC)和粘附性大腸桿菌(EAEC)，并與EHEC區(qū)分。

2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu875.分子生物學(xué)檢測方法

（2）核酸探針核酸探針技術(shù)在建立之初即用于檢測大腸桿菌，用于制備探針的靶基因包括stxl、stx2、slt2、eaeA等。目前已從32P放射性同位素標(biāo)記發(fā)展為熒光標(biāo)記探針，操作更為方便，并可避免同位素對人體的危害。但是檢測上述單一基因，EIEC、ETEC及非致病性大腸桿菌也可能出現(xiàn)陽性結(jié)果，不足以與O157：H7進(jìn)行區(qū)分。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu885.分子生物學(xué)檢測方法

（3）基因芯片基因芯片技術(shù)近年來也開始應(yīng)用于大腸桿菌0157：H7的檢測。將其4種毒力因子(eaeA，slt1、slt2，hlyA)的25-30mer寡核苷酸探針固定在玻片上，與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物無需純化即可進(jìn)行雜交，檢測靈敏度高；其他可用于檢測的目的基因包括fliC、rfbE、ipaH等。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu89食品中致病性大腸桿菌污染的控制

加強(qiáng)飲水消毒和食品衛(wèi)生管理，禁食病死的家禽、家畜等動物性食品，食品行業(yè)要加強(qiáng)屠宰、加工、運送、保存過程中各環(huán)節(jié)的衛(wèi)生管理。本菌在冰箱內(nèi)能存活較長時間，故生冷食品必須煮熟煮透。同時要養(yǎng)成良好的生活習(xí)慣，不喝未經(jīng)消毒的牛奶，不生食水產(chǎn)品，提倡吃熟食，喝開水，勤洗手，加強(qiáng)自我防病意識。衛(wèi)生防疫部門應(yīng)加強(qiáng)對水源衛(wèi)生監(jiān)測及對腹瀉病人和帶菌動物的疾病監(jiān)測。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu90空腸彎曲桿菌病(Colibacillosis)由空腸彎曲桿菌感染人和各種動物(特別是牛、羊、雞)的人畜共患傳染病，臨床上以發(fā)熱、腹痛、腹瀉為主要特征。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu91病原基本特性革蘭氏染色陰性，菌體細(xì)長而彎曲，運動力活潑，微需氧，對1%牛膽汁有耐受性，這一特性可用于細(xì)菌的分離。彎曲桿菌有O、H和K抗原。目前用于血清學(xué)分型的方法主要有兩種，根據(jù)Penner依賴耐熱可溶性抗原建立的間接血凝血清分型法，空腸彎曲桿菌現(xiàn)已發(fā)展至60個血清型；根據(jù)Lier依賴不耐熱抗原建立的玻板凝集血清分型法，空腸彎曲桿菌已發(fā)展至56個血清型。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu92病原基本特性空腸彎曲桿菌能產(chǎn)生3種毒素，即細(xì)胞緊張性腸毒素(CE)、細(xì)胞毒素(C)和細(xì)胞致死性膨脹毒素(CDT)。CE對熱敏感，56℃30min可使之滅活，在結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理上與大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)極為相似，可引起細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高而發(fā)生水樣腹瀉。C不耐熱，60℃30min或100℃15min可使之滅活，與出血性腹瀉的發(fā)生有關(guān)。CDT對熱敏感，胰酶也易使之失活，可使細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度升高，但作用亞于CE，幾乎所有空腸彎曲桿菌分離株均可產(chǎn)生CDT，只是效價不同。本菌對干燥、光照和一般消毒藥均敏感，58℃加熱5min即死亡。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu93食源性空腸彎曲桿菌病及其危害

本病分布廣泛，在許多國家都有較高發(fā)生率，以歐洲、北美洲和澳洲等地報道較多，我國很多省份也有不少有關(guān)本病的報道。在歐美發(fā)達(dá)國家腹瀉病人中空腸彎曲桿菌的檢出率已經(jīng)接近或超過沙門氏菌、痢疾桿菌和致病性大腸桿菌。因此，近年來該病已引起國內(nèi)外廣泛重視?？漳c彎曲桿菌性腸炎潛伏期為27天，表現(xiàn)發(fā)熱、嘔吐、腹瀉、腹痛等癥狀。

2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu94食源性空腸彎曲桿菌病及其危害

傳染源主要是受感染的病畜和人，其次是帶菌的健康動物和人。正常犢牛、綿羊、山羊、犬、兔、貓、雞、鴨的腸道中都有本菌存在，其中家禽是主要的傳染源之一。病原菌隨糞便排出體外，污染食物、飼料、飲水和周圍環(huán)境。因此，從食物、水和未經(jīng)巴氏消毒的牛奶中均可分離到本菌，國內(nèi)外報道本菌在禽肉和豬肉中的檢出率在5%56%之間。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu95臨診特征-人病情輕重不一。典型病人先有發(fā)熱、全身無力、頭痛、肌肉酸痛，嬰兒還可發(fā)生抽搐癥狀。繼而腹痛，常局限于臍周，呈間歇性，有的呈隱痛，排便后可緩解。發(fā)熱12-24h后開始腹瀉，呈水樣，1-2d后部分病例出現(xiàn)粘液便或膿血便，1周后可自行緩解，少數(shù)病例腹痛可持續(xù)數(shù)周，反復(fù)發(fā)生腹瀉。近年來有報道表明空腸彎曲菌常在兒童引起腸道外感染，如敗血癥、腦膜炎、膽囊炎、腹膜炎、心內(nèi)膜炎和反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu96臨診特征-動物（1）牛

牛感染空腸彎曲菌后發(fā)生的腹瀉，又稱“冬痢”，多發(fā)生于秋冬季節(jié)的舍飼牛。約有5％10％的病牛病情嚴(yán)重，表現(xiàn)為精神萎頓、食欲不振、弓背、寒戰(zhàn)、虛弱，如治療及時，很少發(fā)生死亡。患牛還可出現(xiàn)乳房炎，并從乳中排出病菌。

2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu97臨診特征-動物（2）雞雛雞感染空腸彎桿菌后，常表現(xiàn)精神沉郁和腹瀉，病的嚴(yán)重程度取決于雞的日齡和菌株的毒力，環(huán)境應(yīng)激因素可加重病情。開產(chǎn)期前的小母雞或正在產(chǎn)蛋新母雞感染后，表現(xiàn)為精神沉郁，體重減輕，產(chǎn)蛋率下降25％35％，病死率一般為2％15％。從病雞腸內(nèi)容物和肝臟中均可分離到空腸彎桿菌。由于空腸彎桿菌能使雞肝臟發(fā)生炎癥和壞死，又稱為雞彎桿菌性肝炎或雞傳染性肝炎。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu98食品中空腸彎曲桿菌的檢測（1）形態(tài)與培養(yǎng)特性鑒定

微需氧菌，培養(yǎng)適宜溫度為42℃。對糖類既不發(fā)酵也不氧化，生長不需血清，從氨基酸或三羧酸循環(huán)中獲得能量。食品中空腸彎曲桿菌的檢驗可用Skirrow氏選擇性培養(yǎng)基，以抑制其它細(xì)菌的繁殖。但由于食品中的菌體細(xì)胞可能處于亞致死性損傷狀態(tài)，對選擇性抑制劑比較敏感，也有學(xué)者建議將細(xì)菌在非選擇性培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)4h后再轉(zhuǎn)入選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使本菌易于檢出。

2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu99食品中空腸彎曲桿菌的檢測2．生化反應(yīng)

空腸彎曲生化反應(yīng)不活潑，不發(fā)酵糖類，不分解尿素，靛基質(zhì)陰性?？蛇€原硝酸鹽，氧化酶和過氧化氫酶為陽性，硫化氫產(chǎn)生微量或不產(chǎn)生，甲基紅和VP試驗陰性，枸椽酸鹽培養(yǎng)基中不生長。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu100食品中空腸彎曲桿菌的檢測3．免疫學(xué)檢測技術(shù)

（1）斑點ELISA法檢樣經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后刮取菌落，pH9.6碳酸鹽緩沖液制成菌懸液，隔水煮沸15min，上清液點樣于硝酸醋酸混合纖維素（NCCF）微孔濾膜上，加入抗空腸彎曲桿菌的單克隆抗體及酶標(biāo)二抗，加底物顯色，圓圈內(nèi)顯色者為陽性。該法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu1013．免疫學(xué)檢測技術(shù)

（2）丫啶橙免疫熒光菌團(tuán)法檢樣經(jīng)增菌培養(yǎng)后，取菌液與經(jīng)適當(dāng)稀釋的特異性抗血清和高倍稀釋的丫啶橙溶液混合后離心，沉淀物涂于載玻片上，濕盒培養(yǎng)后在熒光顯微鏡下觀察熒光菌團(tuán)現(xiàn)象。此法特異、敏感、簡便、快速，適合于大樣本檢測和基層單位應(yīng)用。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu102

4．分子生物學(xué)檢測方法

針對該菌特異的馬尿酸水解酶（hipO）和大腸彎曲桿菌特異的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（glyA）基因建立的多重PCR方法特異性好，能區(qū)分這兩種細(xì)菌。根據(jù)編碼鞭毛蛋白（flaA或flaB）基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后再對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，可用于空腸彎曲桿菌分型?；赥aqMan探針進(jìn)行實時熒光PCR定量檢測空腸彎曲桿菌，整個過程60min內(nèi)可以完成，檢測底限為5cfu/ml。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu103食品中空腸彎曲桿菌污染的控制由于空腸彎曲桿菌的傳播途徑是消化道，因此，防止人類通過動物性食品感染本病的重要環(huán)節(jié)是加強(qiáng)肉制品、乳制品的衛(wèi)生監(jiān)督，注意飲食衛(wèi)生，不飲用未經(jīng)巴氏消毒的牛奶，肉類食品要煮透，避免生熟食品之間的交叉污染等；同時要盡量避免與犬、貓接觸。避免畜禽攝食被病原菌污染的飼料和飲水。發(fā)現(xiàn)病人、病畜要及時進(jìn)行隔離治療。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu104李斯特菌病(Listeriosis)李斯特菌病是由單核細(xì)胞增多性李斯特菌引起的一種人畜共患的散發(fā)性傳染病。動物中羊、牛、豬、兔和禽等均可感染，人亦可感染。人畜感染后主要表現(xiàn)腦膜腦炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎和單核細(xì)胞增多癥。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu1052022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu106病原基本特性革蘭氏陽性，無莢膜和芽孢，兼性厭氧。該菌能在低溫冷藏（4℃）過程中緩慢生長繁殖。現(xiàn)已知有7個血清型、16個血清變種。大部分人李斯特菌病由1/2a、1/2b和4b這三種血清型引起。本菌在pH5.0以上才能繁殖，至pH9.6仍能生長，耐鹽性強(qiáng)。對熱的耐受性比大多數(shù)無芽孢桿菌強(qiáng)，65℃經(jīng)3040min才可將其殺滅，一般消毒藥都易使之滅活。

2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu107單增李斯特菌的致病機(jī)理2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu108李斯特菌病及其危害方便食品日趨普及，這些食品大多經(jīng)過一定的殺菌處理和真空包裝以延長其貨架期，但是這些措施有時不能完全殺死單增李斯特菌。一般食品的貨架溫度在4-8℃，此時由于不存在競爭菌群，往往使其中污染的李斯特菌得以生長繁殖而達(dá)到危害水平。該菌引起的食物中毒率雖然不高，但死亡率可高達(dá)30%，尤其對免疫力低下的人群威脅更大。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu109臨診特征-人主要表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥和心內(nèi)膜炎等。腦膜炎型多見于新生兒和免疫抑制的成人，常發(fā)病突然，發(fā)熱、劇烈頭痛、惡心、嘔吐、頸部強(qiáng)直，嚴(yán)重時昏迷、抽搐等，單核細(xì)胞并不增多。腦膜炎患者多數(shù)伴有敗血癥，有時可見心內(nèi)膜炎。孕婦感染本菌后還可引起妊娠并發(fā)癥，出現(xiàn)菌血癥、敗血癥以及流產(chǎn)死胎等。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu110臨診特征-動物（1）反芻獸病初發(fā)熱，食欲不振，精神沉郁等，數(shù)天后可出現(xiàn)腦膜炎癥狀，主要表現(xiàn)為頭頸一側(cè)性麻痹彎向?qū)?cè)，該側(cè)耳下垂，眼半閉，以至視力喪失，作圓圈運動等。病程13周或更長。妊娠母畜常發(fā)生流產(chǎn)。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu111臨診特征-動物（2）豬多表現(xiàn)為敗血癥和神經(jīng)癥狀，病初低熱，意識障礙，運動失常，作圓圈運動或無目的地行走，肌肉震顫、強(qiáng)硬。口吐白沫，側(cè)臥地上，四肢亂爬。仔豬多發(fā)生敗血癥，妊娠母豬常發(fā)生流產(chǎn)。（3）馬主要表現(xiàn)腦脊髓炎癥狀，體溫升高，容易興奮，共濟(jì)失調(diào)，意識和視力顯著減弱。幼駒還見有輕度腹瀉、黃疽和血尿等癥狀。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu112臨診特征-動物（4）免常急性死亡，有的表現(xiàn)精神萎頓，口流白沫，神志不清。神經(jīng)癥狀呈間歇性發(fā)作，發(fā)作時無目的地向前沖撞，或轉(zhuǎn)圈運動，最后倒地，頭后仰抽搐。（5）家禽主要為敗血癥，表現(xiàn)精神沉郁、停食、下痢，短時間內(nèi)死亡。病程較長的可能表現(xiàn)痙攣、斜頸等神經(jīng)癥狀。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu113食品中李斯特菌的檢測

1．形態(tài)與培養(yǎng)特性鑒定

為革蘭氏陽性小桿菌，常呈V字型排列，無芽孢，在4℃45℃均能生長，最適生長溫度為30℃37℃。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu114？2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu115

食品中李斯特菌的直接檢測受到以下幾個因素的影響：（1）在污染食品中的含量較低，直接劃線接種難以檢出；（2）動物性食品中存在的正常微生物種群多，而李斯特菌數(shù)量相對較少，競爭力差；（3）對加工食品來說，由于受加工條件的影響，李斯特菌易出現(xiàn)細(xì)胞壁的損傷，形成了一個具有不同生長特性的細(xì)胞群，若不經(jīng)恢復(fù)或復(fù)蘇，受損傷的細(xì)胞會失去生長和繁殖能力，給進(jìn)一步檢測帶來困難。因而往往需要一個增菌分離的步驟。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu116食品中李斯特菌的檢測

2．生化反應(yīng)

本菌一般可分解葡萄糖和水楊苷，37℃24h產(chǎn)酸；對乳糖、麥芽糖、蔗糖、鼠李糖、糊精、馬粟苷、三梨醇和甘油等310天產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；對棉子糖、肌醇、衛(wèi)矛醇、側(cè)金盞花醇及甘露醇等則不發(fā)酵。不產(chǎn)生H2S及靛青質(zhì)，不能使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，MR和VP試驗呈陽性。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu117食品中李斯特菌的檢測

3．免疫學(xué)檢測技術(shù)

多采用單克隆抗體建立ELISA法，特異性檢測單核細(xì)胞增多性李斯特菌。該法操作簡便，可在同一時間檢測大量樣品，但檢出限在105-106個/ml。因此，要得出可靠的結(jié)果必須先進(jìn)行選擇性增菌。此外，李斯特菌表面抗原較為豐富，且大部分優(yōu)勢表位與屬內(nèi)外細(xì)菌有廣泛的交叉抗原，因此，ELISA結(jié)果可能會出現(xiàn)假陽性，需結(jié)合其它的檢測方法。

2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu118食品中李斯特菌的檢測

4．分子生物學(xué)檢測方法（1）PCR檢測 用PCR方法特異性檢測單增李斯特菌的毒力基因主要包括hly、prfA、iap等。此外，也有針對16SrRNA的PCR法特異性檢測單增李斯特菌。應(yīng)用免疫磁珠分離法，將單增李斯特菌特異的單克隆抗體包被磁珠后置于選擇性增菌培養(yǎng)液中，然后收集磁珠提取細(xì)菌DNA，按常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測，可以提高檢測靈敏度。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu1194．分子生物學(xué)檢測方法

（2）核酸探針

以李斯特菌屬或種特異核酸序列的互補(bǔ)序列為探針，從分子水平上鑒定李斯特菌屬或種。Klinger等首先引進(jìn)了16SrRNA序列的核酸雜交法，可在2.5天內(nèi)檢出李斯特菌。也有用李斯特菌hly和inlA毒力基因特異的互補(bǔ)序列為探針，檢測不同樣品來源的李斯特菌分離株。探針雜交技術(shù)檢測限亦為105-106個細(xì)菌/ml。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17CollegeofAnimalScience,ZJU,Dr.AifangDu120食品中李斯特菌污染的控制平時應(yīng)注意飲食衛(wèi)生，防止食用被污染的蔬菜、乳、肉等食品。肉類要煮熟，食用生蔬菜時要徹底清洗干凈，生、熟食品要分開存放，避免食用生牛奶和軟乳酪。因為該菌能在低溫冷藏過程中緩慢生長繁殖，因此對于“即食型”食品（包括消毒牛奶、西式火腿等），產(chǎn)品要達(dá)到單增李斯特菌“零污染”的標(biāo)準(zhǔn)。同時作為消費者也要確保此類食品置于產(chǎn)品標(biāo)簽要求的溫度下儲存，并在規(guī)定的保質(zhì)期內(nèi)食用。若多次食用，在食用前要加熱處理。2022/12/13CollegeofAnimalSc2022/12/17College