免疫組化基本理論課件

.完全抗原(Completeantigen):大多數(shù)蛋白質(zhì)和部分大分子多糖等,分子量MW)大.半抗原(lapten):大部分多糖類脂和多肽等MW小.僅具免疫反應(yīng)性.半抗原抗體的生成:用戊二醛等將鑰孔血藍(lán)蛋白(Keyholelimpethemocyanin,KLH,牛血清白蛋白Bovineserumalbumin,BSA),卵白蛋白Ovalbumin,OVA或甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin)等大分子載體,Carrier)和MW小的半抗原結(jié)合后免疫動(dòng)物但機(jī)體可產(chǎn)生載體抗體.完全抗原(Completeantigen):大多數(shù)蛋白12特性a.異物性異種或同種異體物質(zhì):種屬關(guān)系越遠(yuǎn)免疫原性越大,交叉反應(yīng)越弱.反之亦然自身組織:特殊情況下釋放隱蔽的抗原引起自身免疫b.理化特性:分子量>10kDa,MW越大,結(jié)構(gòu)越復(fù)雜免疫原性越強(qiáng)c.特異性:抗原具有只與相應(yīng)抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的特性,其物質(zhì)基礎(chǔ)是抗原分子表面少于8個(gè)氨基酸,糖或核苷酸殘基構(gòu)成的表位(Epitope或稱抗原決定簇(Antigenicdeterminant.抗原一級(jí)和空間結(jié)構(gòu)影響抗原決定簇抗原決定簇越多,間距越大,免疫原性越大酶解或變性可暴露蛋白內(nèi)部的抗原決定簇2特性2B抗體免疫球蛋白(mmunoglobulin,lg)1.分子結(jié)構(gòu):一對(duì)重鏈(Heavychain和一對(duì)輕鏈Lightchain通過二硫鍵連接成對(duì)稱性的“Y”形在氨基端N端),重鏈的14Antigen-binding和輕鏈的12組成可變區(qū)regionsVariableregion,V區(qū)),其氨基酸排列順序變化很大用于結(jié)合不同的抗原決定簇在羧基端(C端),重Lightchain鏈的34和輕鏈的12組成穩(wěn)定區(qū)(Constantregion,CHeavychain區(qū)),其氨基酸排列順序比較恒定FCB抗體免疫球蛋白(mmunoglobulin,lg)32.功能結(jié)構(gòu)a.抗原結(jié)合片段(Antigenbindingfragment,Fab:“Y"頂部.每個(gè)Fab由一條完整的輕鏈和一條不完整的重鏈組成因一個(gè)抗體有兩個(gè)Fab,因此可結(jié)合2個(gè)抗原b.可結(jié)晶片段(Crystallizablefragment,Fc):“Y"基部由兩條不完整的重鏈組成,可與補(bǔ)體等結(jié)合,是調(diào)節(jié)抗體生物活性的部分C.絞鏈區(qū)(Hingeregion)連接Fab和Fc的狹窄區(qū),易彎曲扭轉(zhuǎn)或被木瓜酶和胃蛋白酶解.調(diào)理作用(Opsonization):免疫細(xì)胞對(duì)lG結(jié)合的抗原反應(yīng)迅速且激烈,因?yàn)檫@些細(xì)胞本身有l(wèi)gG的Fc受體3.抗原性抗體分子量約150kDa,具有抗原性2.功能結(jié)構(gòu)44.分類a.lgG:最多.是能穿過胎盤屏障的唯一類型.blgA:分泌物中的主要類型蛋白J結(jié)合2-3個(gè)gA單體,并與分泌蛋白結(jié)合后形成分泌性lgA(SlgAc.lgM:免疫反應(yīng)中首先出現(xiàn)的類型B細(xì)胞CM上單體lgM與抗原的結(jié)合,對(duì)B細(xì)胞轉(zhuǎn)變成漿細(xì)胞非常重要.血循環(huán)中五聚體lgM與抗原結(jié)合后,能激活補(bǔ)體系統(tǒng),該系統(tǒng)包括肝臟合成的C3等20余種蛋白,能增強(qiáng)免疫反應(yīng)dlgD:B細(xì)胞CM,功能不明e.lgE:其Fc段與肥大細(xì)胞CM的Fc受體結(jié)合,引起脫顆粒造成過敏反應(yīng)Allergy)4.分類5IntestinallumenSecretoryEnterocyte噸小腸上皮吸收細(xì)胞OTandB與M細(xì)胞合作,形HelperTlymphocyteBlymphocyte成分泌性!A(SgAlymphocyteIntestinallumen6gEreceptorAdenylatecyclaseFusianofgranulesATPMicrofilamentsHeparinproteinkinaseInactivECF-AExocytosisLeukotrieneslgE的Fc段與肥大細(xì)胞cM結(jié)合,引起脫顆粒造成過敏反應(yīng)gEreceptor75.生成a.多克隆抗體(Polyclonalantibody.抗原分子上有許多不同的抗原決定簇,免疫動(dòng)物體時(shí)每個(gè)抗原決定簇激活一種合成抗體的細(xì)胞克隆,產(chǎn)生許多種lgG(針對(duì)同一抗原的多種抗體混合物,即多克隆抗體*.多克隆抗體易與類似抗原(即含類似抗原決定簇)發(fā)生交叉反應(yīng).多克隆抗體分離自動(dòng)物血清,也稱抗血清b.單克隆抗體(Monoclonalantibody):.用特異性抗原免疫小鼠,分離抗體產(chǎn)生細(xì)胞與不產(chǎn)生抗體但能不斷增殖的細(xì)胞系骨髓瘤細(xì)胞融合,形成雜交瘤(Hybridoma)將雜交瘤細(xì)胞克隆化,每個(gè)雜交瘤細(xì)胞只產(chǎn)生一種抗體,對(duì)一個(gè)抗原決定簇發(fā)生反應(yīng),即單克隆抗體5.生成8C.抗原抗體反應(yīng):抗原和抗體發(fā)生特異性結(jié)合,解離系數(shù)101M抗原抗體反應(yīng)的高度特異性,高親合力及形成不溶性復(fù)合物等特性是免疫組化的基礎(chǔ)l.常用標(biāo)記物及其檢測:熒光染料,酶,生物素和膠體金等用于標(biāo)記抗體,抗原,蛋白A和凝集素等A.熒光染料1.簡介:即熒光色素,能吸收特定波長的高能量光波而受到激發(fā)(Excitation),進(jìn)而以特定波長熒光)將能量發(fā)散mon異硫氰酸熒光素(Fluoresceinisothiocyanate,FTc)490~5→520~30nm,黃綠色b.四甲基異硫氰酸羅達(dá)明(Tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC:550620nm,橙紅色C.抗原抗體反應(yīng):抗原和抗體發(fā)生特異性結(jié)合,解離系數(shù)101M9TRITC-conjugated2ndantibodiesshowvimentin.FITCatedphalloidinFITC-conjugated2ndantibodiesshowsactinsdaPishowsnucleiinshowtubulinsPishowsnucleusculturedAGMKC(AfricanGreenHelacellsMonkeykidneycells,verocelllineTRITC-conjugated2ndantibodie10免疫組化基本理論課件11免疫組化基本理論課件12免疫組化基本理論課件13免疫組化基本理論課件14免疫組化基本理論課件15免疫組化基本理論課件16免疫組化基本理論課件17免疫組化基本理論課件18免疫組化基本理論課件19免疫組化基本理論課件20免疫組化基本理論課件21免疫組化基本理論課件22免疫組化基本理論課件23免疫組化基本理論課件24免疫組化基本理論課件25免疫組化基本理論課件26免疫組化基本理論課件27免疫組化基本理論課件28免疫組化基本理論課件29免疫組化基本理論課件30免疫組化基本理論課件31免疫組化基本理論課件32免疫組化基本理論課件33.完全抗原(Completeantigen):大多數(shù)蛋白質(zhì)和部分大分子多糖等,分子量MW)大.半抗原(lapten):大部分多糖類脂和多肽等MW小.僅具免疫反應(yīng)性.半抗原抗體的生成:用戊二醛等將鑰孔血藍(lán)蛋白(Keyholelimpethemocyanin,KLH,牛血清白蛋白Bovineserumalbumin,BSA),卵白蛋白Ovalbumin,OVA或甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin)等大分子載體,Carrier)和MW小的半抗原結(jié)合后免疫動(dòng)物但機(jī)體可產(chǎn)生載體抗體.完全抗原(Completeantigen):大多數(shù)蛋白342特性a.異物性異種或同種異體物質(zhì):種屬關(guān)系越遠(yuǎn)免疫原性越大,交叉反應(yīng)越弱.反之亦然自身組織:特殊情況下釋放隱蔽的抗原引起自身免疫b.理化特性:分子量>10kDa,MW越大,結(jié)構(gòu)越復(fù)雜免疫原性越強(qiáng)c.特異性:抗原具有只與相應(yīng)抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的特性,其物質(zhì)基礎(chǔ)是抗原分子表面少于8個(gè)氨基酸,糖或核苷酸殘基構(gòu)成的表位(Epitope或稱抗原決定簇(Antigenicdeterminant.抗原一級(jí)和空間結(jié)構(gòu)影響抗原決定簇抗原決定簇越多,間距越大,免疫原性越大酶解或變性可暴露蛋白內(nèi)部的抗原決定簇2特性35B抗體免疫球蛋白(mmunoglobulin,lg)1.分子結(jié)構(gòu):一對(duì)重鏈(Heavychain和一對(duì)輕鏈Lightchain通過二硫鍵連接成對(duì)稱性的“Y”形在氨基端N端),重鏈的14Antigen-binding和輕鏈的12組成可變區(qū)regionsVariableregion,V區(qū)),其氨基酸排列順序變化很大用于結(jié)合不同的抗原決定簇在羧基端(C端),重Lightchain鏈的34和輕鏈的12組成穩(wěn)定區(qū)(Constantregion,CHeavychain區(qū)),其氨基酸排列順序比較恒定FCB抗體免疫球蛋白(mmunoglobulin,lg)362.功能結(jié)構(gòu)a.抗原結(jié)合片段(Antigenbindingfragment,Fab:“Y"頂部.每個(gè)Fab由一條完整的輕鏈和一條不完整的重鏈組成因一個(gè)抗體有兩個(gè)Fab,因此可結(jié)合2個(gè)抗原b.可結(jié)晶片段(Crystallizablefragment,Fc):“Y"基部由兩條不完整的重鏈組成,可與補(bǔ)體等結(jié)合,是調(diào)節(jié)抗體生物活性的部分C.絞鏈區(qū)(Hingeregion)連接Fab和Fc的狹窄區(qū),易彎曲扭轉(zhuǎn)或被木瓜酶和胃蛋白酶解.調(diào)理作用(Opsonization):免疫細(xì)胞對(duì)lG結(jié)合的抗原反應(yīng)迅速且激烈,因?yàn)檫@些細(xì)胞本身有l(wèi)gG的Fc受體3.抗原性抗體分子量約150kDa,具有抗原性2.功能結(jié)構(gòu)374.分類a.lgG:最多.是能穿過胎盤屏障的唯一類型.blgA:分泌物中的主要類型蛋白J結(jié)合2-3個(gè)gA單體,并與分泌蛋白結(jié)合后形成分泌性lgA(SlgAc.lgM:免疫反應(yīng)中首先出現(xiàn)的類型B細(xì)胞CM上單體lgM與抗原的結(jié)合,對(duì)B細(xì)胞轉(zhuǎn)變成漿細(xì)胞非常重要.血循環(huán)中五聚體lgM與抗原結(jié)合后,能激活補(bǔ)體系統(tǒng),該系統(tǒng)包括肝臟合成的C3等20余種蛋白,能增強(qiáng)免疫反應(yīng)dlgD:B細(xì)胞CM,功能不明e.lgE:其Fc段與肥大細(xì)胞CM的Fc受體結(jié)合,引起脫顆粒造成過敏反應(yīng)Allergy)4.分類38IntestinallumenSecretoryEnterocyte噸小腸上皮吸收細(xì)胞OTandB與M細(xì)胞合作,形HelperTlymphocyteBlymphocyte成分泌性!A(SgAlymphocyteIntestinallumen39gEreceptorAdenylatecyclaseFusianofgranulesATPMicrofilamentsHeparinproteinkinaseInactivECF-AExocytosisLeukotrieneslgE的Fc段與肥大細(xì)胞cM結(jié)合,引起脫顆粒造成過敏反應(yīng)gEreceptor405.生成a.多克隆抗體(Polyclonalantibody.抗原分子上有許多不同的抗原決定簇,免疫動(dòng)物體時(shí)每個(gè)抗原決定簇激活一種合成抗體的細(xì)胞克隆,產(chǎn)生許多種lgG(針對(duì)同一抗原的多種抗體混合物,即多克隆抗體*.多克隆抗體易與類似抗原(即含類似抗原決定簇)發(fā)生交叉反應(yīng).多克隆抗體分離自動(dòng)物血清,也稱抗血清b.單克隆抗體(Monoclonalantibody):.用特異性抗原免疫小鼠,分離抗體產(chǎn)生細(xì)胞與不產(chǎn)生抗體但能不斷增殖的細(xì)胞系骨髓瘤細(xì)胞融合,形成雜交瘤(Hybridoma)將雜交瘤細(xì)胞克隆化,每個(gè)雜交瘤細(xì)胞只產(chǎn)生一種抗體,對(duì)一個(gè)抗原決定簇發(fā)生反應(yīng),即單克隆抗體5.生成41C.抗原抗體反應(yīng):抗原和抗體發(fā)生特異性結(jié)合,解離系數(shù)101M抗原抗體反應(yīng)的高度特異性,高親合力及形成不溶性復(fù)合物等特性是免疫組化的基礎(chǔ)l.常用標(biāo)記物及其檢測:熒光染料,酶,生物素和膠體金等用于標(biāo)記抗體,抗原,蛋白A和凝集素等A.熒光染料1.簡介:即熒光色素,能吸收特定波長的高能量光波而受到激發(fā)(Excitation),進(jìn)而以特定波長熒光)將能量發(fā)散mon異硫氰酸熒光素(Fluoresceinisothiocyanate,FTc)490~5→520~30nm,黃綠色b.四甲基異硫氰酸羅達(dá)明(Tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC:550620nm,橙紅色C.抗原抗體反應(yīng):抗原和抗體發(fā)生特異性結(jié)合,解離系數(shù)