單基因遺傳病的研究方法與技術(shù)

關(guān)于單基因遺傳病的研究方法與技術(shù)第一頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日已知致病基因突變分析第二頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日基因突變第三頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日基因突變穩(wěn)定突變：傳遞中不改變?cè)械耐蛔?。?dòng)態(tài)突變：傳遞中不斷改變自己，多見于短重復(fù)序列的突變，在一代代傳遞中重復(fù)次數(shù)發(fā)生明顯變化。

第四頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日三核苷酸重復(fù)突變第五頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日基因突變類型點(diǎn)突變：只有一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的改變，是突變中最多見的形式。突變的結(jié)果分為：

同義突變、錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、剪切突變等。堿基的插入和缺失：基因編碼序列中插入或丟失一個(gè)或幾個(gè)堿基，其結(jié)果是突變點(diǎn)下游堿基序列發(fā)生移碼，編碼氨基酸序列都發(fā)生改變，又稱移碼突變（frameshiftmutation），并可在突變點(diǎn)下游提前出現(xiàn)終止密碼。第六頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日基因突變類型框內(nèi)突變（inframemutation）：3個(gè)或是3的倍數(shù)的堿基缺失或插入導(dǎo)致的突變，使基因丟失或增加1個(gè)或幾個(gè)氨基酸。DNA大片段缺失或復(fù)制（largedeletionorduplication)：幾百個(gè)bp至幾十個(gè)kb的堿基缺失或復(fù)制。

第七頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日各種類型病理性突變的比例無(wú)義突變和移碼突變：60％稀有的錯(cuò)義突變：20％DNA大片段缺失或重復(fù):20％微小突變第八頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日基因突變分析所用實(shí)驗(yàn)材料臨床樣本取材：外周血組織毛囊頰粘膜脫落細(xì)胞羊水細(xì)胞絨毛實(shí)驗(yàn)應(yīng)用材料：DNARNAProtein第九頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日RNA的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):

不包含內(nèi)含子RT-PCR能夠檢測(cè)異常的剪切體缺點(diǎn):

不易獲得

要求操作特別小心且快速以免降解目的基因可能不在獲得的材料組織中表達(dá)

導(dǎo)致RNA不穩(wěn)定的突變不能被檢測(cè)第十頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日第十一頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日第十二頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分子雜交基因突變分析常用技術(shù)第十三頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日Southern印跡雜交第十四頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日例如：脆X綜合征若X染色體在Xq27.3處呈現(xiàn)細(xì)絲樣結(jié)構(gòu)，且連接的末端形似隨體，這條染色體就被稱為脆性X染色體。主要臨床癥狀：智力低下、語(yǔ)言障礙、性格孤僻、伴有特殊面容——長(zhǎng)臉、方額、大耳朵、嘴大唇厚，青春期后可見明顯大于正常的睪丸。通貫掌、三叉點(diǎn)C缺如。第十五頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日Xq27.3第十六頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日前突變和全突變正常

CGG<6-54前突變CGG55-200全突變CGG>200第十七頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日Southern雜交法診斷FragileXF:FullyexpandedandmethylatedNM:MethylatedXdonotcutwithEclXIP:UnmethylatedpremutationN:Xinnormalmaleandactivenormalfemale第十八頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日MullisF"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method"聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)于1983年由美國(guó)Cetus公司的K.Mullis建立，并和定點(diǎn)突變的發(fā)明者M(jìn).Smith一起榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究開創(chuàng)了嶄新時(shí)代。第十九頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日PCR反應(yīng)的特點(diǎn)特異性強(qiáng)引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實(shí)性靈敏度高指數(shù)增長(zhǎng)，從pg(10-12)可擴(kuò)增至mg(10-6)水平簡(jiǎn)便、快速2～4小時(shí)完成擴(kuò)增對(duì)標(biāo)本的純度要求低

DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板第二十頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日DNA的體外復(fù)制包括3個(gè)步驟：變性（denaturation）:94C~95C

退火（annealing）:40C~70C

延伸（extension）:72C

3個(gè)步驟作為PCR的一個(gè)循環(huán)，每當(dāng)完成一個(gè)循環(huán)，一個(gè)分子的模板被復(fù)制為二個(gè)，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長(zhǎng)。PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過程第二十一頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日5’5’3’3’d.NTPs耐熱DNA聚合酶引物5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’添加反應(yīng)混合液及樣本變性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’退火加入試管中第二十二頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日延伸5’3’5’3’5’3’5’3’繼續(xù)延伸5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’循環(huán)第二十三頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’第二個(gè)循環(huán)4個(gè)拷貝第三個(gè)循環(huán)8個(gè)拷貝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第n個(gè)循環(huán)2n個(gè)拷貝第二十四頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日PCR反應(yīng)體系參與PCR反應(yīng)的主要成份:模板、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。第二十五頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日引物(Primers)

引物決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度化學(xué)合成的寡核苷酸能與模板特異地結(jié)合引物決定產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循一些原則

第二十六頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日設(shè)計(jì)引物的原則：二條引物分別位于被擴(kuò)增片段的兩端，與模板正負(fù)鏈序列互補(bǔ)長(zhǎng)度為18~25個(gè)核苷酸二條引物之間避免形成引物二聚體引物的堿基組成應(yīng)平衡引物的5`端可被修飾（引入酶切位點(diǎn)、引入突變位點(diǎn)、生物素等標(biāo)記）第二十七頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日DNA聚合酶TaqDNA聚合酶復(fù)制的保真性：TaqDNA聚合酶無(wú)3’→5’外切酶活性，因而無(wú)校正功能，在復(fù)制新鏈的過程中會(huì)發(fā)生堿基錯(cuò)配。TaqDNA聚合酶在每次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000。第二十八頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日擴(kuò)增失敗試劑錯(cuò)加或漏加實(shí)驗(yàn)中如發(fā)現(xiàn)對(duì)照樣本也擴(kuò)增失敗，可用原試劑重復(fù)一次，以確定試劑是否錯(cuò)加或漏加。試劑失效變性溫度偏低有些DNA所含G、C堿基對(duì)豐富，當(dāng)變性溫度偏低時(shí)，雙鏈DNA不能完全解鏈。退火溫度偏高第二十九頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日標(biāo)本中DNA含量過高或雜質(zhì)過多。降低加樣量拖尾可明顯改善。Taq酶加量過大或擴(kuò)增循環(huán)數(shù)太多拖尾第三十頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日非特異條帶退火溫度低,提高退火溫度。引物特異性不佳，切膠純化特異條帶Taq酶加量過大或擴(kuò)增循環(huán)數(shù)太多第三十一頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日引物二聚體引物量過多：降低引物濃度。引物設(shè)計(jì)問題操作問題：反應(yīng)體系建立后，如在室溫放置時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)引起擴(kuò)增后的二聚體加重。第三十二頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日應(yīng)用PCR相關(guān)技術(shù)進(jìn)行基因突變分析的策略與方法第三十三頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日策略與方法直接分析法：PCR片段大小分析：片段大小有明顯差異PCR-RFLP：有酶切位點(diǎn)PCR-測(cè)序：確定突變點(diǎn)堿基改變多重連接探針擴(kuò)增（MLPA）：片段缺失與重復(fù)RT-PCR:

基因大，可取到新鮮材料，且基因在其中有表達(dá)間接分析法：PCR-STR連鎖分析：基因大；在已知致病基因編碼區(qū)未檢測(cè)到突變的家系第三十四頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日1.脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)是遺傳性共濟(jì)失調(diào)的主要類型，包括SCA1－27。成年期發(fā)病、常染色體顯性遺傳及共濟(jì)失調(diào)等是本病的共同特征，并表現(xiàn)在連續(xù)數(shù)代中發(fā)病年齡提前和病情加重（遺傳早現(xiàn)）。SCA3是我國(guó)最常見的脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)亞型，基因位于14q24..3－32，含4個(gè)外顯子。CAG突變位于4號(hào)外顯子，患者擴(kuò)增拷貝數(shù)為61－89，正常人為12－41。第三十五頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日

NCF1F2F3F4F5PCM應(yīng)用PCR技術(shù)分析一遺傳性脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)（SCA)3型家系NC:正常對(duì)照PC:陽(yáng)性對(duì)照F:家系成員M:Marker結(jié)果：家系成員1、3、4有SCA3致病基因突變;家系成員2、5未檢測(cè)到突變12345第三十六頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日2.脊肌萎縮癥脊肌萎縮癥(SpinalMuscularAtrophy,SMA)系指一類由于下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性導(dǎo)致的進(jìn)行性骨骼肌無(wú)力和萎縮的一組疾病,是兒童和少年常見的致死性常染色體隱性遺傳病之一,其隱性致病基因攜帶率在人群中為1/40～1/50,發(fā)病率為1/6000～1/10000.第三十七頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)分析脊肌萎縮癥（SMA）致病基因SMNPCR擴(kuò)增SMN基因exon7,DraI酶切PCR產(chǎn)物.酶切N：正常人PCR產(chǎn)物被酶切為兩條帶酶切P：陽(yáng)性對(duì)照PCR產(chǎn)物被酶切為一條短帶病人1：結(jié)果顯示SMN基因有突變病人2和3：結(jié)果顯示未有突變第三十八頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日3.腓骨肌萎縮癥(CMT)CMT是一類周圍神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病,其遺傳方式可為常染色體顯性遺傳(AD,占絕大多數(shù))、常染色體隱性遺傳(AR)及X連鎖顯性遺傳(XD)依據(jù)病理和電生理特點(diǎn)分為兩型:脫髓鞘型(CMT1型)和軸突型(CMT2型).CMT1型約占CMT總數(shù)的70%，70%以上CMT1由PMP22基因重復(fù)引起其中X連鎖顯性遺傳CMT致病基因?yàn)镃X32，含有2個(gè)外顯子第三十九頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日MLPA分析PMP22基因重復(fù)突變第四十頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日PCR-測(cè)序直接分析CX32基因來診斷X連鎖腓骨肌萎縮癥第四十一頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日4.假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥

假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)是一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X染色體連鎖的遺傳性疾病，在2500個(gè)活產(chǎn)男嬰中即有一個(gè)患者致病基因DMD含有79個(gè)外顯子

DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占60%-70%第四十二頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日MLPA

技術(shù)簡(jiǎn)介MLPAMultiplexligation-dependentprobeamplification鏈接依賴型多探針擴(kuò)增技術(shù)最早由荷蘭人SchoutenJP(SchoutenJPetal,2002)在原有PCR技術(shù)上發(fā)展出來第四十三頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日MLPA

技術(shù)原理第四十四頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日MLPA方法檢測(cè)DMD

12345第四十五頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日5.成人型多囊腎是一種最常見的單基因遺傳性腎病，發(fā)病率約為1/1000其主要特征在雙腎形成進(jìn)行性增長(zhǎng)的多個(gè)液性囊腫，最終可引起腎衰竭具有遺傳異質(zhì)性，存在兩個(gè)主要的致病基因PKD1和PKD246第四十六頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日47ADPKD分子遺傳基礎(chǔ)GenePKD1PKD2PKD3?Chromosomallocus16p13.34q22-23ClonedYesYesPercentage~85%~15%Exons/Single-copyexons46/Ex35-4615/Ex1-15Mutationnumber343100HotmutationNoNo第四十七頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日PKD1基因結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性第四十八頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日PKD基因分析:直接基因突變分析：適于散發(fā)病例和小家系病例。具有結(jié)果判讀的不確定性連鎖分析:

適于分析在已知致病基因編碼區(qū)未檢測(cè)到突變的較大家系，不適于散發(fā)病例和小家系病例49第四十九頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日PCR-測(cè)序分析在PKD1外顯子編碼序列上發(fā)現(xiàn)無(wú)義突變，使突變堿基所在密碼子由CGA變?yōu)榻K止密碼子TGA。第五十頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日連鎖分析結(jié)果第五十一頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日新致病基因的研究方法和技術(shù)第五十二頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日家系連鎖分析來定位:

適于分析較大的遺傳病家系，不適于散發(fā)病例和小家系病例二代測(cè)序技術(shù)：適于散發(fā)病例和小家系病例研究對(duì)象不同，策略方法不同

連鎖分析與二代測(cè)序相結(jié)合加快新基因的發(fā)現(xiàn)第五十三頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日ATGGTCTCACTGCAACCGATGGTCTCACTGTAACCGMetValSerLeuGlnProMetValSerLeuStop定位克隆第五十四頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日

利用被定位的基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點(diǎn)，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。連鎖分析第五十五頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日DNASTRSNP常見遺傳標(biāo)記第五十六頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日PCR-STR連鎖分析CACACAPrimer1Primer2CACACACACACACACACACACACACACACA第五十七頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日第五十八頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日毛細(xì)管電泳分析PCR片段大小第五十九頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日分析D4S1534D4S2929D4S2460D4S423I-1114,124176,178200,202105,112II-1114,120153,159200,202107,109II-2114,124157,176202,204105,112II-3114,122157,178200,202102,105II-4114,124157,176202,204105,112II-5114,124157,176198,202107,109III-1114,124153,176200,202109,112III-2114,124176,176202,202109,112第六十頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日連鎖分析結(jié)果第六十一頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日均勻分布于23對(duì)染色體上的STRSNP芯片通過全基因組掃描來定位基因第六十二頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日外顯子組測(cè)序用二代測(cè)序技術(shù)尋找致病基因全基因組測(cè)序第六十三頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日第六十四頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日第六十五頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日第六十六頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日第六十七頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日第六十八頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022