化療藥物相關基因檢測

腫瘤化療藥物相關基因檢測萬臘根南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科細胞分子檢驗南昌大學第一附屬醫(yī)院2018-11精準醫(yī)學2015年美國啟動精準醫(yī)學計劃2016年中國啟動精準醫(yī)學計劃分子診斷與個體化醫(yī)療關注幾個醫(yī)學相關的熱點事件什么是“精準醫(yī)學”？精準醫(yī)學—“預測、診斷、治療”精準預測評估某些疾病的發(fā)病風險精準診斷減少醫(yī)療事故：疾病的正確診斷精準治療個體化用藥：提高療效，降低副作。經(jīng)驗-試錯現(xiàn)在和將來傳統(tǒng)個體化-前驗藥A藥B藥C藥D嘗試、更換ADRADRADR病人組藥D藥A藥C藥B分子診斷確定、治療病人組ADR循證醫(yī)學以群體數(shù)據(jù)為依據(jù)，個體用藥仍為反復嘗試和摸索達到理想治療的過程-

把“試誤醫(yī)學”當做標準醫(yī)療模式是不完善的！診療方式的轉變提高療效、降低毒副作用定性---定量指南用藥方案調整開展個體化用藥基因檢測—精準治療預測藥物療效和毒副作用精準治療-與個體基因多態(tài)性相關CONTENT個體化用藥基因檢測01檢測技術平臺介紹02腫瘤化療藥物相關基因03個體化用藥基因檢測PARTONE基因基因：是具有遺傳效應的DNA片段。等位基因等位基因：同源染色體的相同位置上控制著相對性狀的一對基因。等位基因多態(tài)性遺傳性或突變（生殖細胞突變）從父母親那里繼承的獲得性突變（體細胞突變）在個別細胞DNA中出現(xiàn)基因多態(tài)性－基因型野生型突變雜合子型突變純合子型常見的基因變異-SNP單核苷酸多態(tài)性：SNP

單核苷酸多態(tài)性（SNP）指DNA序列上發(fā)生的單個核苷酸堿基之間的變異。人類個體間有99%的基因序列是相同的，剩下的1%序列差異構成個體間的不同。這些序列差異有90%可歸因于SNP?；蚺c藥物代謝酶、靶點、轉運體藥物療效和毒副作用基因的多態(tài)性藥物的療效和副作用都是靠基因編碼的藥物代謝酶、藥物作用靶點及藥物轉運體決定的如不同的基因型其編碼的代謝藥物的酶的活性存在差異（超快、快、中快、慢代謝型）。不同的基因型的個體對藥物療效和毒副作用是不同的基因檢測技術平臺PARTTWO基因的檢測方法（1）標本采集：抽靜脈血2ml，提取核細胞DNA（2）DNA提?。捍胖榉?，達到一定量的DNA（3）方法：分離單個核細胞提取DNAPCR擴增產(chǎn)物分析（4）產(chǎn)物分析：表現(xiàn)為檢驗方法的不同（5）結果報告：檢驗人員的素質（醫(yī)師型人才）（6）結果的應用：體現(xiàn)臨床醫(yī)師的素質（與檢驗人員的溝通）PAXgene真空采血管專業(yè)的全血RNA表達分析用采血管目前臨床分析前的采血現(xiàn)狀缺乏標準化,存在諸多外在的變異因素:存在各種抗凝劑EDTA,citrate,heparinHeparin干擾PCR反應樣本采集后至處理前的時間可變運輸/儲存的溫度可變采集/處理的樣本量可變注：標本采集PAXgene真空采血管塑料真空管2.5mL采血量含有創(chuàng)新的專利穩(wěn)定劑可與RNA純化試劑盒聯(lián)用

HemogardTM管蓋

可用于研究產(chǎn)品特點及用途標準化的密閉采集系統(tǒng)專利的添加劑瞬時穩(wěn)定血液細胞內(nèi)的RNA,可原管運輸和保存添加劑不干擾后續(xù)的分子檢測結合純化試劑盒(如QIAGENRNA純化試劑盒)可提供一整套從樣本采集到RNA提取純化的完整解決方案可用于基因轉錄水平,基因表達譜及某些疾病罕見事件的分析應用背景應用背景現(xiàn)實RNA標本在采集,運輸,儲存過程中遭遇內(nèi)在的困難:研究顯示在體外基因轉錄水平會發(fā)生明顯變化一些基因的轉錄水平增高而另一些則剛好相反（1）PCR限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）法120bp和49bp兩條帶的為CYP2C19*1／*1169bp一條帶為CYP2C19*2／*2271bp一條帶CYP2C19*3／*3，271bp，175bp和96bp三條帶的為CYP2C19*1／*3（2）熔解曲線分析（3）基因芯片法（4）焦磷酸測序焦磷酸測序技術（Pyrosequencing）：是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應，實現(xiàn)邊合成邊測序，無需電泳和熒光標記。PPiATPlighttimeSignal操作步驟臨床實驗室試驗時間DNA提取PCR擴增測序DNA提取PCR擴增測序1h+2h+30min=3h30min臨床開具檢測申請單護士取標本標本送至實驗室（1）操作簡便，檢測快速（2）測序結果判讀簡單方便（5）高通量測序技術腫瘤化療藥物相關基因檢測PARTTHREE他莫昔芬相關基因檢測及意義01他莫昔芬藥物介紹他莫昔芬（Tamoxifen）選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM),后藥藥理作用他莫昔芬（Tamoxifen）4-羥基他莫昔芬（HTAM）和內(nèi)昔芬(Endoxifen)乳腺癌細胞雌激素受體結合抑制雌激素發(fā)揮作用服抑制乳腺癌細胞的增殖適應癥1.治療女性復發(fā)轉移乳腺癌；2.用作乳腺癌手術化療－預防復發(fā)不良反應胃腸道反應，繼發(fā)性抗雌激素作用，神經(jīng)精神癥狀，視力障礙，骨髓抑制，皮疹，脫發(fā)等他莫昔芬的代謝途徑

他莫昔芬進入體內(nèi)后在CYP2D6作用下轉化活性更強的4-羥基他莫昔芬（HTAM）和內(nèi)昔芬(Endoxifen)

Endoxifen為雌激素拮抗劑，是他莫昔芬代謝的主要活性物質，可以與乳腺癌細胞內(nèi)的雌激素受體(ER)結合，發(fā)揮抗雌激素作用，從而抑制激素依賴性癌細胞的增殖CYP2D6基因多態(tài)性對于他莫昔芬的療效具有重要作用

他莫昔芬相關基因CYP2D6CYP2D6CYP2D6是CYP酶系中一種非常重要的藥物代謝酶，其基因型與酶活性密切相關位于人體染色體22q13.1位上CYP2D6多態(tài)位點很多，目前已經(jīng)有超過一百多種CYP2D6等位基因的變異被確定其中CYP2D6*5和*10等位基因的變異，導致酶活性下降或者抑制酶活性，從而使莫昔芬的代謝減弱，Endoxifen生成減少，導致乳腺癌再發(fā)危險及他莫昔芬的治療療效的降低。根據(jù)患者攜帶的等位基因，可將其分為快代謝型（EM）、中間代謝型（IM）和慢代謝型（PM）三類CYP2D6基因突變中國人群的CYP2D6突變頻率如下表：CYP2D6基因多態(tài)性的影響CYP2D6基因突變的癌癥患者，用他莫昔芬化療療效差

BritishJournalofCancer.(2012)106,1591–1597.(IF=4.83)一項針對202例韓國轉移性乳腺癌患者的研究指出：攜帶CYP2D6*10患者，用他莫昔芬后，體內(nèi)Endoxifen濃度比野生型患者低，療效差。CYP2D6基因多態(tài)性的影響CYP2D6基因突變的癌癥患者，用他莫昔芬化療療效差JClinOncol.2007;25(25):3837-3845.(IF=18.97)

轉移性乳腺癌患者在使用他莫昔芬進行治療時，攜帶CYP2D6*10等位基因的患者，中位無進展生存期較野生型患者明顯縮短。CYP2D6基因突變的癌癥患者，疾病復發(fā)風險增高JClinOncol.2005;23(36):9312-9318.(IF=18.97)

一項對206名乳腺癌患者，接受他莫昔芬治療的研究表明：慢代謝型和中間代謝型（攜帶兩個或一個CYP2D6*10等位基因）乳腺癌患者與快代謝型患者相比，其疾病復發(fā)風險增高。CYP2D6基因多態(tài)性的影響ClinCancerRes.2013Jan4.(IF=7.338)CYP2D6基因突變導致他莫西芬治療乳腺癌無效研究對接受不同乳腺癌治療方案治療的兩組婦女的復發(fā)和病死率進行監(jiān)測雌激素受體陽性并接受他莫西芬單一治療達5年的婦女接受他莫西芬治療2年后再進一步接受芳香化酶抑制劑治療3年的婦女研究結果顯示：與CYP2D6活性正常的婦女相比，具有明顯CYP2D6基因變異的婦女乳腺癌復發(fā)或因乳腺癌死亡的風險增加了2.5倍；具有中等酶活力的婦女乳腺癌復發(fā)或死亡的風險則增加了1.7倍。具有CYP2D6基因變異但2年后改變治療方案（他莫昔芬改為阿納托司唑）的婦女復發(fā)和死亡風險并不增高。ClinCancerRes.2013Jan4.(IF=7.338)CYP2D6基因突變導致他莫西芬治療乳腺癌無效CYP2D6活性低的女性患者應該在接受他莫昔芬治療2年后換用芳香化酶抑制劑治療，而那些不能代謝他莫昔芬的女性則應完全避免使用他莫昔芬。他莫昔芬必須完全被代謝分解為其最具活性的endoxifen（4-羥-N-去甲基他莫昔芬）才能發(fā)揮其作用研究認為：權威推薦攜帶有一個或兩個CYP2D6*10等位基因突變的乳腺癌患者，使用他莫昔芬復發(fā)風險增加，建議用絕經(jīng)后女性使用芳香化酶抑制劑。DPWGGuidelineforTamoxifenandCYP2D6他莫昔芬報告模板伊立替康相關基因檢測及意義02伊立替康伊立替康（Irinotecan，CPT-11）

喜樹堿類化療藥物，前藥，活性成分：SN-38（7-乙基-10羥基喜樹堿）藥理作用可以抑制拓撲異構酶Ⅰ的活性，進而抑制DNA的合成適應癥主要用于治療結直腸癌、胃癌、肺癌等實體瘤不良反應較常見為血樣腹瀉、嗜中性粒細胞減少癥(均為劑量依賴性)(如果腹瀉時間持續(xù)5－7天，?？蓪е轮滤佬悦撍碗娊赓|紊亂，嚴重時可致命)伊立替康的代謝途徑羧酸酯酶羧酸酯酶羧酸酯酶中性粒細胞減少腹瀉伊立替康的主要毒性都與SN-38的水平增加有關，且SN-38的葡萄糖醛基基化率個體差異最高達50倍，使毒性差異很大尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1(UGT1A1)，可以催化SN-38代謝生成SN-38G，而喪失抗癌活性伊立替康活性成分：SN-38毒副作用：血樣腹瀉、嗜中性粒細胞減少癥UGT1A1基因UTG1A1基因位于9號染色體長臂有12個外顯子，UTG1A1（尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶），是伊立替康的解毒酶，UTG1A1存在基因多態(tài)性（SNP）不同的基因型其活性不同，在2個外顯子多存在SNP：SNP-*6（AA、AG、GG）和SNP-*28（7/7TA、6/7TA、6/6TA），SNP-*28位點7/7TA型純合子編碼的酶解毒活性降低2/3。UGT1A1：尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶，是生物體內(nèi)重要的Ⅱ相代謝酶；UGT1A1突變的影響與劑量相關，在使用低劑量伊立替康治療時，UGT1A1突變與否對毒副作用的風險影響不大。UGT1A1*28突變率樣本量：n=6795樣本來源：三濟生物數(shù)據(jù)庫（2014-2016年）權威推薦：FDAUGT1A1可作為抗腫瘤藥物伊立替康的分子標志物FDA關于伊立替康的說明書建議

-應考慮降低起始劑量-雜合子患者，粒細胞減少的風險可能升高-粒細胞減少的風險增加UGT1A1活性降低的患者FDA對使用伊立替康的建議：依據(jù)患者的基因型，通過減低劑量減少了突變型(7/7)患者的不良反應和減少失效的風險。依據(jù)基因型，可以對野生型的患者加大使用劑量增強有效性伊立替康的說明書允許沒有毒性風險的患者，使用劑量從125mg/m2/周，提高到150mg/m2/周基于PGx檢測，野生型(6/6)患者可以從150mg/m2起始正常（野生型）患者，權威推薦：DPWG指南*28純合突變者，如果起始劑量＞250mg/m2，建議劑量降低30%如果原定劑量＞250mg/m2，則劑量建議減少30%。增加劑量會影響中性粒細胞計數(shù)。DPWGGuidelineforirinotecanandUGT1A1權威推薦：法國PRO指南PROGuidelineforirinotecanandUGT1A1野生型：劑量≥240mg/m2是安全劑量<180mg/m2/week，對所有基因型都是安全的。230＜劑量＞180mg/m2的*28突變純合子人群，劑量建議減少30%我國衛(wèi)計委推薦《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南》UGT1A1可作為抗腫瘤藥物伊立替康的分子標志物UGT1A1*28（6/7）和（7/7）基因型個體應用伊立替康時應選用劑量較低的化療方案，以避免引起嚴重腹瀉；攜帶UGT1A1*6等位基因的患者4級中性粒細胞減少癥的發(fā)生風險增加，應謹慎使用。伊立替康報告模板5-FU類藥物相關基因檢測及意義03氟尿嘧啶藥物簡介種類氟尿嘧啶（5-FU）卡培他濱：為前藥，體內(nèi)代謝為5-FU后，機制相同作用機制卡培他濱是一種尿嘧啶類似物，抑制胸苷合成酶(TYMS)活性，從而影響DNA和RNA的合成，起到抗腫瘤的作用適應癥用于結腸癌和對紫杉醇及多柔比星等無效的晚期乳腺癌的治療。毒副作用嚴重粘膜炎、粒細胞減少癥、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀甚至死亡等。《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南》5FU/卡培他濱的代謝途徑二氫嘧啶脫氫酶(DPD)是5-FU代謝的起始酶和限速酶，編碼基因為DPYD。5-FU進入體內(nèi)后，85%的5-FU通過DPD代謝為無活性的物質，15%經(jīng)胸苷激酶(TK)的催化轉變成5-FdUMP，然后與5,10-MTHF和胸苷合成酶(TYMS)形成一種穩(wěn)定的三元共價化合物，從而干擾DNA的合成和修復。DPD酶活性低下的癌患者應用5-FU、卡培他濱后出現(xiàn)體內(nèi)5-FU蓄積，引起嚴重粘膜炎、粒細胞減少癥、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀甚至死亡?？ㄅ嗨麨I為5-FU的前體，在體內(nèi)可活化代謝為5-FU。衛(wèi)計委2015年《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南》DPYD基因DPYDDYPD基因位于1號染色體短臂，有14個外顯子，DYPD基因編碼二氫嘧啶脫氫酶(DPD)，其活性高低直接決定了5-FU進入體內(nèi)合成代謝的速度，DPYD基因突變最常見的類型為一處剪切位點突變IVS14+1G＞A：AA型（純合子）AG型（雜合子）GG型（野生型）

突變導致酶的活性下降或失活。FDA推薦FDA建議：使用5-FU、卡培他濱時，檢測DPD基型臨床藥物基因組學實施聯(lián)盟(CPIC)指南：CPIC推薦更換藥物起始劑量減少50%美國《CPICGuidelineforcapecitabineandDPYD》突變雜合子人群（*1/*2A）：起始劑量至少減少50%；突變純合子人群（*2A/*2A）：更換藥物。DPWG指南荷蘭藥物基因組學工作組《DPWGGuidelineforcapecitabineandDPYD》突變雜合子人群（IM）：劑量減少50%，或換用其他藥物；突變純合子人群（PM）：換用其他藥物。中國國家衛(wèi)計委2015年發(fā)布的《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南》中，包括卡培他濱用藥指導的基因檢測中國國家衛(wèi)計委推薦《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南》5-FU報告模板甲氨蝶呤相關基因檢測及意義04甲氨蝶呤適應癥：主要適用于急性白血病、乳腺癌、絨毛膜上皮癌及惡性葡萄胎、頭頸部腫瘤、骨腫瘤、白血病腦膜脊髓浸潤、肺癌、生殖系統(tǒng)腫瘤、肝癌、頑固性普通牛皮癬、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎等自身免疫病。作用機制：主要抑制二氫葉酸還原酶，使二氫葉酸不能還原成有生理活性的四氫葉酸，從而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成過程中一碳基團的轉移作用受阻，導致DNA的生物合成受到抑制。主要毒性：胃腸道反應、骨髓抑制、肝功能損傷、皮膚及黏膜損害甲氨蝶呤代謝途徑甲氨蝶呤在MTHFR作用下進入細胞內(nèi)，通過干擾二氫葉酸還原酶的活性，抑制胸腺嘧啶和嘌呤形成，進而干擾DNA及RNA合成。MTHFR的活性影響甲氨蝶呤進入細胞內(nèi)的濃度。主要不良反應：骨髓抑制肝功能損傷皮膚及黏膜損害二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶MTHFR基因MTHFR基因位于1號染色體1P36.3位置，突變位點：677C＞T有3種基因型:CC、CT、TT型，MTHFR活性為：CC＞TC＞TT型；意義：1、是葉酸—甲硫氨酸代謝途徑中的關鍵酶，酶活性下降時葉酸代謝障礙，5-甲基四氫葉酸、甲硫氨酸合成減少，DNA合成障礙；2、MTHFR的活性影響甲氨蝶呤進入細胞內(nèi)的濃度MTHFR677基因突變率和酶活性MTHFR基因型酶活性中國人群頻率CC100%27%CT65%44%TT30%29%MTHFR基因編碼的酶活性，隨677位點CC、CT、TT的改變呈下降趨勢Blood.2001;98(1):231-234.(IF=10.558)MTHFR677CT型和TT型患者，更易發(fā)生甲氨蝶呤相關的毒副反應，具體表現(xiàn)在口腔黏膜炎指數(shù)較野生型高36%（第1-18天），且血小板數(shù)量恢復較野生型患者要慢。MTHFR677TT型副反應風險高oralmucositisindex(口腔黏膜炎指數(shù)，OMI)CT型TT型AnnOncol.2002;13(12):1915-1918.(IF=