土壤酶活性測(cè)定方法

(完整)土壤酶活性測(cè)定方法(完整)土壤酶活性測(cè)定方法66土壤酶活性測(cè)定方法土壤脲酶的測(cè)定方法(苯酚鈉—次氯酸鈉比色法）一、原理脲酶存在于大多數(shù)細(xì)菌、真菌和高等植物里。它是一種酰胺酶作用是極為專性的，它僅能水解尿素，水氮素狀況。土壤中脲酶活性的測(cè)定是以脲素為基質(zhì)經(jīng)酶促反應(yīng)后測(cè)定生成的氨量,也可以通過(guò)測(cè)定未水解的尿素量來(lái)求得。本方法以尿素為基質(zhì)，根據(jù)酶促產(chǎn)物氨與苯酚—次氯酸鈉作用生成藍(lán)色的靛酚，來(lái)分析脲酶活性。二、試劑1）甲苯2)10%尿素：稱取10g尿素，用水溶至100ml。3（PH6.:184g檸檬酸和147.5g（KOPH6。7，1000ml。4)苯酚鈉溶液(。35mol/：62。5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀釋至100ml（A100mlBAB20ml100ml。0。9％，溶液穩(wěn)定。0.4717g1000ml，得到1ml0.1mg10（10ml100ml)制成氮的工作液（0.01mg/ml）.三、操作步驟5g50ml1ml15min10ml1020mlPH37℃241ml50ml4ml3ml20min1h578nm（1h。0135791113ml50ml20ml4ml3ml20min定容。1h578nm注意事項(xiàng)：1、每一個(gè)樣品應(yīng)該做一個(gè)無(wú)基質(zhì)對(duì)照，以等體積的蒸餾水代替基質(zhì),其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以排除土樣中原有的氨對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)無(wú)土對(duì)照，不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以檢驗(yàn)試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣四、結(jié)果計(jì)算：以24小時(shí)后1g土壤中NHN的毫克數(shù)表示土壤脲酶活性Ure。3Ure=（a－a）×V×n／m式中：aNH－N3aNH－N3aNH－N3V為顯色液體積;n為分取倍數(shù)，浸出液體積／吸取濾液體積；m表示烘干土重土壤磷酸酶活性測(cè)定(磷酸苯二鈉比色法）一、原理測(cè)定磷酸酶主要根據(jù)酶促生成的有機(jī)基團(tuán)量或無(wú)機(jī)磷量計(jì)算磷酸酶活性。前一種通常稱為有有機(jī)基團(tuán)含量法，是目前較為常用的測(cè)定磷酸酶的方法，后一種稱為無(wú)機(jī)磷含量法。研究證明:磷酸酶有三種最適PH值：4～56~78～10PHPH(PH5.0~4（PH70)三羥甲基氨基甲烷緩沖液（PH7.0~8.5)、和硼酸緩沖液（PH9~10。磷酸酶測(cè)定時(shí)常用基質(zhì)有磷酸苯二鈉、酚酞磷酸鈉、甘油磷酸鈉、β-萘酚磷酸鈉等?，F(xiàn)介紹磷酸苯二鈉比色法。二、試劑緩沖液：醋酸鹽緩沖液（PH。0）0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L.0.2mol/L醋酸鈉溶液16。4gCHONa27gCHONa.3HO1L.232 232 2取14。8ml0。2mol/L醋酸溶液和35。2ml0。2mol/L醋酸鈉溶液稀釋至1L。檸檬酸鹽緩沖液7。0）mol/L檸檬酸溶液19.2gCHO1L。678mol/L磷酸氫二鈉溶液53.63g

HPO2

。7H4

O71。7g2

HPO2

.12H4

O溶至1L。2取6。4ml0.1mol/L檸檬酸溶液加43。6ml0。2mol/L磷酸氫二鈉溶液稀釋至100ml。硼酸鹽緩沖液（PH。6）0.05mol/L硼砂溶液19。05g硼砂溶至1L.0。2mol/LNaOH溶液8gNaOH溶至1L.取50ml0。05mol/L硼砂溶液加23ml0。2mol/LNaOH溶液稀釋至200ml.2）0.5％磷酸苯二鈉（用緩沖液配制）0125g10ml96放在冰箱里。保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用。甲苯5）0.3%硫酸鋁溶液6）酚標(biāo)準(zhǔn)溶液1g1L，酚工作液（0。01mg/ml）:10ml1L。三、操作步驟5g200ml2.5ml15min20ml0。5%磷酸苯二鈉（酸酶用乙酸鹽緩沖液；中性磷酸酶用檸檬酸鹽緩沖液；堿性磷酸酶用硼酸鹽緩沖液24h.100ml0.33ml50ml660nm035791113ml50ml5ml4,30min660nm注意事項(xiàng)：1、每一個(gè)樣品應(yīng)該做一個(gè)無(wú)基質(zhì)對(duì)照，以等體積的蒸餾水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同,以排除土樣中原有的氨對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)無(wú)土對(duì)照，不加土樣,其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同,以檢驗(yàn)試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣四、結(jié)果計(jì)算24h1g磷酸酶活性=（aa－a）×V×n／m式中：a樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù)；a無(wú)土為無(wú)土對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù);a無(wú)基質(zhì)為無(wú)基質(zhì)對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù);V為顯色液體積；n為分取倍數(shù)，浸出液體積／吸取濾液體積；m表示烘干土重土壤蔗糖酶活性測(cè)定（3，5-二硝基水楊酸比色法）一、原理蔗糖酶與土壤許多因子有相關(guān)性,如與土壤有機(jī)質(zhì)、氮、磷含量，微生物數(shù)量及土壤呼吸強(qiáng)度有關(guān)，一般情況下,土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高.蔗糖酶酶解所生成的還原糖與3，5—二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的3—氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān),因而可用測(cè)定還原糖量來(lái)表示蔗糖酶的活性。二、試劑8％蔗糖，pH5。51/15M（11.876gNaHPO·2HO2 4 21L）0.5ml1/15M（9.078gKHPO1L）9.5ml2 4葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL)80℃烘箱內(nèi)約1250mg50mL4℃保存期約一星期3，5—(DNS）05g20ml2mol/LNaOH50ml30g100ml（保存期不過(guò)7天).三、操作步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液05mL3mL540nmOD（2)土壤蔗糖酶測(cè)定5g50mL15ml，5mlpH5.5537℃24h50ml3mlDNS5min3min3—氨基—5-50ml,508nm四、結(jié)果計(jì)算：24h，1g蔗糖酶活性=（a－a）×n／ma樣品、a無(wú)土、a無(wú)機(jī)質(zhì)分別表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線求的葡萄糖毫克數(shù)；n為分取倍數(shù)；m表示烘干土重土壤纖維素酶活性測(cè)定（3，5-二硝基水楊酸比色法)(完整)土壤酶活性測(cè)定方法一、原理(完整)土壤酶活性測(cè)定方法一、原理66纖維素是植物殘?bào)w進(jìn)入土壤的碳水化合物的重要組分之一。在纖維素酶作用下,它的最初水解產(chǎn)物是纖維二糖，在纖二糖酶作用下，纖維二糖分解成葡萄糖.所以，纖維素酶是碳素循環(huán)中的一個(gè)重要的酶。纖維素酶解所生成的還原糖與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的3—氨基—5—硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān),因而可用測(cè)定還原糖量來(lái)表示蔗糖酶的活性。二、試劑1）甲苯2）1%羧甲基纖維素溶液：1g羧甲基纖維素鈉,用50％的乙醇溶至100ml.3）pH5.5醋酸鹽緩沖液：0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95％冰醋酸溶至1L。0。2mol/L醋酸鈉溶液16.4gCHONa2722gCHONa。3HO1L。232 232 2取11ml0。2mol/L醋酸溶液和88ml0。2mol/L醋酸鈉溶液混勻即成PH5.5醋酸鹽緩沖液.3，5—1。25g50ml2mol/LNaOH125ml75g250ml（7）,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/mL）預(yù)先將分析純葡萄糖置80℃烘箱內(nèi)約12小時(shí)。準(zhǔn)確稱取50mg葡萄糖于燒杯中,用蒸餾水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容,搖勻（冰箱中4℃保存期約一星期)。若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象，則應(yīng)棄之，重新配制。三、操作步驟1mg/mL00.10.20.4060.8mL1mL，加DNS3ml5min，540nmOD10g50ml。5ml15min5ml1％羧甲基纖維素溶5mlpH5.53772h1ml）四、結(jié)果計(jì)算72h,1g－aa樣品、a無(wú)土、a無(wú)機(jī)質(zhì)分別表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線求的葡萄糖毫克數(shù)；n為分取倍數(shù)；m表示烘干土重過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定(高錳酸鉀滴定法）過(guò)氧化氫對(duì)生物和土壤具有毒害作用。與此同時(shí)，在生物體和土壤中存有過(guò)氧化氫酶,能促進(jìn)過(guò)氧化氫分解（HOHO+O（含22 2 2有過(guò)氧化氫酶)和過(guò)氧化氫作用析出的氧氣體積或過(guò)氧化氫的消耗量,測(cè)定過(guò)氧化氫的分解速度，以此代表過(guò)氧化氫酶的活性。測(cè)定過(guò)氧化氫酶的具體方法比較多,如氣量法：根據(jù)析出的氧氣體積來(lái)計(jì)算過(guò)氧化氫酶的活性；比色法：根據(jù)過(guò)氧化氫與硫酸銅產(chǎn)生黃色或橙黃色絡(luò)合物的量來(lái)表征過(guò)氧化氫酶的活性；滴定法:用鉀滴定法。二、試劑2mol/LHSO5。43ml500ml,置于冰箱貯存；2 4002mol/L17g400mL500mL，避光保存,用時(shí)用0.1mol/L草酸溶液標(biāo)定；0.1mol/L草酸溶液：稱取優(yōu)級(jí)純HCO 2HO。334g,用蒸餾水溶解后，定容至250ml；224 23%HO30%HO25ml250ml0.1mol/L

溶液標(biāo)定。22 22 4三、操作步驟5g5mL4℃冰箱中30min25mL3％HO22

水溶液，充分混勻后,再置于冰箱中放置1h.取出,迅2mol/LHSO1mL5mL5mL2mol/L2 4HSO溶液，用0.02mol/LH

的量所消2 4 22耗的KmnO.過(guò)氧化氫酶活性以每g干土1h內(nèi)消耗的0.1mol/LKmnO體積數(shù)表示(以mL計(jì)）表示.4 4四、結(jié)果計(jì)算（如下面處理)：KMnO10mL0.1mol/LHC

用KMnO滴定，所消耗KMnO體積數(shù)為19.49mL，由此計(jì)算出KMnO標(biāo)4準(zhǔn)溶液濃度為0.0205mol/L。

224 4 4 4HO標(biāo)定：1ml3%HO用KMnO滴定,所消耗KMnO體積數(shù)為16。51ml,由此計(jì)算出HO22 22 4 4 2

濃度為0.846