固相膜免疫測(cè)定

關(guān)于固相膜免疫測(cè)定第一頁，共二十八頁，2022年，8月28日第十一章固相膜免疫分析技術(shù)第二頁，共二十八頁，2022年，8月28日掌握：免疫印跡試驗(yàn)熟悉：膠體金免疫技術(shù)的方法學(xué)種類與原理了解：膠體金與免疫金的制備、其他膜載體免疫分析技術(shù)第三頁，共二十八頁，2022年，8月28日一概述二免疫層析試驗(yàn)三免疫滲濾試驗(yàn)四斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)五免疫印跡試驗(yàn)六影響固相膜免疫試驗(yàn)的主要因素七固相膜免疫分析技術(shù)的臨床應(yīng)用第四頁，共二十八頁，2022年，8月28日概述固相膜免疫分析技術(shù)

(solidphasemembrane-basedimmunoassay)特點(diǎn):以微孔膜作為固相載體

多孔性,

非共價(jià)鍵高度吸附抗原或抗體易于漂洗第五頁，共二十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫層析試驗(yàn)

免疫層析試驗(yàn)原理：以NC膜等為固相載體，樣品溶液借助毛細(xì)作用在層析條上泳動(dòng)，同時(shí)樣品中的待測(cè)物與層析材料上待測(cè)物的受體（抗原或抗體）發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應(yīng)，層析過程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域，通過目測(cè)或儀器檢測(cè)標(biāo)記物，在短時(shí)間內(nèi)得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

第六頁，共二十八頁，2022年，8月28日毛細(xì)作用是指浸潤(rùn)液體在細(xì)管里升高的現(xiàn)象和不浸潤(rùn)液體在細(xì)管里降低的現(xiàn)象第七頁，共二十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫層析試驗(yàn)

免疫層析試驗(yàn)分為：膠體金免疫層析試驗(yàn)（ICA）熒光免疫層析試驗(yàn)（GICA）

第八頁，共二十八頁，2022年，8月28日

二、測(cè)定模式

（一）膠體金免疫層析試驗(yàn)1、雙抗體夾心法測(cè)抗原2、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)小分子抗原3、間接法測(cè)抗體

第九頁，共二十八頁，2022年，8月28日膠體金免疫層析試驗(yàn)AGCB雙抗體夾心法測(cè)大分子抗原（陽性，2個(gè)條帶）第十頁，共二十八頁，2022年，8月28日膠體金免疫層析試驗(yàn)AGCB競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)小分子抗原（陰性，2個(gè)條帶）第十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日

三技術(shù)要點(diǎn)操作要點(diǎn)：（1）將試劑條標(biāo)記線一端浸入待測(cè)標(biāo)本中2-5s,或在標(biāo)本加樣處加一定量待檢標(biāo)本,平放于水平桌面上（2）在5-20分鐘內(nèi)觀察結(jié)果結(jié)果判斷夾心法：陰性:1條棕紅色指控條帶陽性:出現(xiàn)2條棕紅色條帶

無棕紅色條帶出現(xiàn)為試劑失效競(jìng)爭(zhēng)法：陰性:出現(xiàn)2條棕紅色條帶。陽性:1條棕紅色指控條帶第十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日

第三節(jié)免疫滲濾試驗(yàn)1原理在硝酸纖維素膜為載體并包被了抗原或抗體的滲濾裝置中，依次滴加標(biāo)本、免疫金及洗滌液，因微孔濾膜貼置于吸水材料上故溶液流經(jīng)滲濾裝置時(shí)與膜上的抗原或抗體快速結(jié)合并起到濃縮作用，達(dá)到檢測(cè)目的。2方法類型雙抗體夾心法測(cè)抗原間接法測(cè)特異性抗體第十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日三、試劑盒組成和技術(shù)要點(diǎn)

①滲濾裝置②膠體金標(biāo)志物③洗滌液④Ag參照品第十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日技術(shù)要點(diǎn)：1、平放反應(yīng)板，于小孔內(nèi)滴加含待測(cè)Ag標(biāo)本1-2滴，與膜上的Ab反應(yīng)而結(jié)合在膜上2、于小孔內(nèi)滴加膠體金標(biāo)記Ab試劑1-2滴，使膠體金標(biāo)記Ab與結(jié)合在膜上的Ag反應(yīng)3、于小孔內(nèi)滴加洗滌液2-3滴，待完全滲入，洗去未結(jié)合的膠體金標(biāo)記Ab。4、結(jié)果觀察：陽性膜中央有淡紅色或紅色斑點(diǎn)

第十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日第四節(jié).斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)(Dot-ELISA)第十六頁，共二十八頁，2022年，8月28日技術(shù)要點(diǎn)：1、抗原包被NC膜吸附力強(qiáng)，包被后封閉。2、抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)后再加二抗3、確定酶結(jié)合物最佳稀釋度陰性樣品不顯色，陽性顯色最強(qiáng)時(shí)的酶結(jié)合物稀釋度4、顯色反應(yīng)pH值時(shí)反應(yīng)最靈敏強(qiáng)陽性藍(lán)黑色斑點(diǎn)

弱陽性淡綠色半點(diǎn)第十七頁，共二十八頁，2022年，8月28日方法學(xué)評(píng)價(jià)：1、NC吸附力強(qiáng)，靈敏度較ELISA高6～8倍；2、可同時(shí)檢測(cè)多種抗體；3、操作簡(jiǎn)便不需特殊儀器設(shè)備4、吸附抗原（抗體）或已有結(jié)果的NC膜可長(zhǎng)期保存，不影響期活性。第十八頁，共二十八頁，2022年，8月28日

第五節(jié).免疫印跡試驗(yàn)

（immunoblottest,IBT）免疫印跡試驗(yàn)

將凝膠電泳的高分辨率與抗原抗體反應(yīng)的高特異性結(jié)合.又稱Westernblot.是檢測(cè)蛋白質(zhì)特性、表達(dá)及分布的一種最常用的方法。蛋白免疫印跡試驗(yàn)重組免疫印跡試驗(yàn)第十九頁，共二十八頁，2022年，8月28日

二Westernblot技術(shù)要點(diǎn):1.抗原印跡與包被①（SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳）②電轉(zhuǎn)移2.抗原抗體反應(yīng)（間接法）3.檢測(cè)動(dòng)畫第二十頁，共二十八頁，2022年，8月28日SDS

抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯胺凝膠中從陰極向陽極泳動(dòng)，分子量越小，泳動(dòng)速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶）第二十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日第二十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日電轉(zhuǎn)移

將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1-2A），通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此分階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見。第二十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日第二十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日酶免疫定位將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。陽性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù)