分子生物學概述-兼容

分子生物學概述OutlineofMolecularBiology主要內容：什么是分子生物學？分子生物學的發(fā)展歷程分子生物學與醫(yī)學發(fā)展2一.什么是分子生物學？圍繞著生物的中心法則，重點在DNA水平上，通過研究生物大分子間相互作用及其互調網絡，揭示生命及其規(guī)律的科學ProteinDNARNA3思維方式：傳統(tǒng)生物學：從宏觀到微觀我國現(xiàn)在解剖學、組織胚胎學等發(fā)展始于20世紀初比歐美國家晚200多年從19世紀中期到20世紀初，關于細胞結構尤其是細胞核的研究，有了長足的進展1944年證明DNA是遺傳物質1961-64年破譯DNA遺傳密碼4思維方式：傳統(tǒng)生物學：從宏觀到微觀分子生物學：從微觀到宏觀生物學5思維方式：傳統(tǒng)生物學：從宏觀到微觀分子生物學：從微觀到宏觀基因異常生物體異常結構變化數(shù)量變化修飾變化？信號轉導異常動態(tài)受精卵生長發(fā)育成熟6思維方式：傳統(tǒng)生物學：從宏觀到微觀分子生物學：從微觀到宏觀最終目的：在分子水平上解釋生物的生命本質DNARNA蛋白質分子生物學的中心法則7二.分子生物學的發(fā)展歷程分子生物學的發(fā)展：源于對生命現(xiàn)象探究的渴望eagertoknow問題：你最想知道什么？8Whatislife?WhatIsLife?isa1944non-fictionsciencebookwrittenbyphysicistErwinSchr?dinger.Schr?dinger推測：含有遺傳信息的物質是一種不斷變換的液狀晶體，由共價化學鍵維持其構型1950年，這種idea刺激了尋找遺傳物質的熱情1869年，已經知道DNA,但其功能及結構都未知9ChrickWatson分子生物學的誕生：起始于DNA雙螺旋模板學說Watson：原從事鳥類研究的開始從事DNA相關研究是源于讀了“Whatislife”這本小冊子Crick：物理學家，一直思考兩個問題：——分子為什么能使非生命體變成生命體？——頭腦怎么就有智慧了呢？推測：DNA和蛋白質，DNA更可能是遺傳物質Howmoleculesmakethetransitionfromthenon-livingtotheliving?Howthebrainmakesaconsciousmind?10知道了：DNA是遺傳物質，DNA是雙螺旋結構下面你最想知道什么？是不是想知道：—DNA真能決定生物體的一切嗎？如果是，你這時最想干什么？—是不是想動一動DNA？11分子生物學的快速發(fā)展：起始對DNA的操作靶向化學鍵的操作：限制性核酸內切酶（RE）DNA連接酶DNA變性-復性切割磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵氫鍵斷裂-形成12問題：一旦實現(xiàn)了操作DNA了，你想干什么？好奇心可能驅使你將不同生物的DNA組裝到一起看能出現(xiàn)什么奇跡，是嗎？13問題：一旦實現(xiàn)了操作DNA了，你想干什么？好奇心可能驅使你將不同生物的DNA組裝到一起看能出現(xiàn)什么奇跡，是嗎？猿猴病毒DNA噬菌體DNA限制性內切酶限制性內切酶DNA連接酶重組DNA分子PaulBergabiochemistryatStanford1980年，獲諾貝爾化學獎1972年：14真正意義上的DNA重組技術：1973年建立的基因克隆體系Plasmid1Plasmid2REREligaseRecombinantplasmidTransformationE.coli要點：不同來源DNA的重新組合在生物體內能自我復制無性繁殖StanleyCohen(Stanford)HerbertBoyer(UCSF)151974年，申請了重組DNA技術發(fā)明專利1976年,Boyer和投資人Swanson(29歲)作為發(fā)起人，創(chuàng)建了GenentechInc.第一個產品：重組人胰島素(1982年上市)RobertA.Swanson

1947-1999

16—GenentechInc.的產品1982-Synthetic"human"insulin1987-Activase(alteplase)-todissolvebloodclotsinpatients.1990-Actimmune(IFN1b)-chronicgranulomatousdisease.1997-Rituxan(rituximab)-Treatmentforspecifickindsofnon-Hodgkinslymphomas.1998-Herceptin(trastuzumab)-Treatmentformetastaticbreastcancerpatients2000-TNKase(tenecteplase)-totreatacutemyocardialinfarction.2003-Xolair(omalizumab)-formoderatetoseverepersistentasthma.2004-Avastin(bevacizumab)-Anti-VEGFmAbforthetreatmentofmetastaticcancerofthecolonorrectum,locallyadvanced,recurrentormetastaticnon-smallcelllungcancer,untreatedadvancedHER2-negativebreastcancer.2004-Tarceva(erlotinib)-Treatmentforpatientswithlocallyadvancedormetastaticnon-smallcelllungcancer,andpancreaticcancer.2006-Lucentis(ranibizumab)-forthetreatmentofneovascular(wet)age-relatedmaculardegeneration(AMD).2010-Actemra(tocilizumab),IL-6R-inhibitingmAbtotreatrheumatoidarthritis.2012-Erivedge(vismodegib)-Treatmentforadvancedbasal-cellcarcinoma(BCC2012-PERJETAforuseincombinationwithHerceptin(trastuzumab)anddocetaxelchemotherapyforthetreatmentofpatientswithpreviouslyuntreatedHER2-positivemetastaticbreastcancer(mBC).17—關于GenentechInc.宗旨：UsinghumangeneticinformationTodiscover（發(fā)現(xiàn)）

develop（開發(fā)）

manufacture（生產）

commercialize（銷售）

biotherapeuticsthataddresssignificantunmetmedicalneedsunmet:未滿足的HerbertW.Boyer(UCSF)RobertA.Swanson

1947-1999

18接下來：不滿足于只知道DNA構型1975年，DNA測序技術誕生WalterGilbertHarvardFrederickSangerUniversityofCambridge1980年獲諾貝爾獎94歲1958年，第一次獲諾貝爾化學獎Insulinproteinsequencing1980年，第二次獲諾貝爾化學獎DNAsequencingTillnow，Sanger是第四個獲兩次諾貝爾獎的人發(fā)現(xiàn)一系列疾病相關基因1976年發(fā)現(xiàn)第一個病毒癌基因發(fā)現(xiàn)編碼序列和非編碼序列發(fā)現(xiàn)基因表達調控序列1990年啟動人類基因組計劃個體基因組測序

2007年：Watson,Venter

2008年：中國YH

Watson

Venter19—基因組測序1990年，人類基因組計劃啟動1996年，酵母(S.cervisiae)基因組測序1998年，線蟲基因組測序2000年，果蠅基因組測序2001年，人類基因組草圖完成2002年，小鼠基因組測序2003年，人類基因組計劃結束2004年，發(fā)表人類基因組序列；大鼠基因組測序；雞基因組測序2005年，狗基因組測序

猩猩基因組測序

第一個基因組范圍相關性研究發(fā)表人類基因組與小鼠基因組高度同源（80%同源性）2005年開始，大規(guī)模小鼠基因敲除的研究計劃在美國、歐盟和加拿大實施人類的研究工具10年4年2006年，第一個直接對消費者的基因組測序

海膽(seaurchin)基因組測序

蜜蜂基因組測序

基因型、表型-NCBIdatabase啟動2007年，第一個個人基因組測序中國漢人基因組測序

人類遺傳變異有重大突破的一年

獼猴基因組測序2008-11-6,第一個中國人YH的個人基因組序列發(fā)表在Nature上Yourlifeinyourhands—基因組測序212008年，遺傳信息非歧視Act在美國通過第一個癌基因組測序(AML)

膠質瘤全基因組分析

鴨嘴獸(platypus)基因組測序

非洲優(yōu)魯巴人(Yoruba)基因組測序

第一個用新技術個人基因組測序2009年，韓國人基因組測序

第一張人類甲基化圖譜2009年，?；蚪M測序

國際數(shù)據釋放研討會

完成了哺乳動物基因收集(MGC)JamesWatson—基因組測序222010年，Exosome測序發(fā)現(xiàn)MillerFisher綜合征的致病基因1000基因組試驗性計劃完成

穴居人(Neanderthal)基因組測序>1000小鼠基因敲除突變品系

第500個基因組范圍的研究發(fā)表

南非人基因組測序附：MillerFisher綜合征是一種罕見的多發(fā)性神經炎疾病，其病理現(xiàn)象即為腦干的腦神經核體功能缺損—基因組測序23—基因組中的“垃圾DNA”ENCODE(ENCyclopediaOfDNAElements)研究組上百位研究人員2012-9-6公布了最新成果:—人類基因組中“垃圾DNA”實際上是一個龐大的控制面板，能調控數(shù)以百萬計基因的活性。Nature,489:57–74(06Sep2012).AnintegratedencyclopediaofDNAelementsinthehumangenome.Nature,489:101–108(06Sep2012).Landscapeoftranscriptioninhumancells.人基因組中，—1.5%編碼蛋白，8.5%編碼結合在DNA上的蛋白，調控基因轉錄—位于4%功能仍未知基因組中的一大片與其他哺乳動物不同，預示受到了進化的“約束”24接下來：不滿足于只知道DNA構型不斷發(fā)明新技術以滿足新需求GH轉基因小鼠1981年，大鼠生長激素(GH)基因被轉入小鼠體內（轉基因技術）轉基因動物基因敲除動物轉基因-基因敲除動物克隆動物用于生物制品的生產如：人凝血因子Ⅷ(羊奶中)作為模式生物如：Dolly早衰模型25分子生物學的使命：試圖從根本上解釋生命的奧秘學科特點：中心法則作為理論體系核心操作基因作為技術體系核心提出理論產生技術上的需求發(fā)明技術提出新的理論分子生物學在這樣的循環(huán)中得到發(fā)展DNA是遺傳物質DNA結構及功能關系操作DNA改變生物遺傳物質制造模式生物揭示人類自身生老病死的機制26DNA重組技術重組蛋白人源抗體重組多肽藥物重組疫苗基因克隆DNA序列測定重組載體基因治療載體RNA轉錄載體打靶載體轉基因載體基因敲除動物模型轉基因動物模型發(fā)夾RNARNAi核酸探針標記分子雜交SouthernblotNorthernblot構建文庫基因組文庫cDNA文庫基因合成PCR-克隆-亞克隆基因突變基因敲除動物模型RNAi以DNA重組技術為核心技術：27一些成果？從根本上研究人類的起源、進化等奧秘問題人類的近親——猩猩98%相似性1.44%差異2005,Nature比較基因組學表觀遺傳學人與人之間有多大差異？人與其他生物間有多大差異？北京猿人是不是中國人的祖先？DNA序列不變但基因功能可遺傳性變化環(huán)境因素與生物進化？28一些成果？從根本上研究人類的起源、進化等奧秘問題尋求造福于人類的新途徑生物制藥公司改良動植物品種用生物體作為制藥工廠大腸桿菌：干擾素，胰島素酵母：HBsAg,HPV疫苗昆蟲細胞：HPV疫苗大動物：凝血因子Ⅷ抗病蟲害的植物抗病毒感染的家畜轉基因大豆轉基因家禽轉基因豬問：轉基因動植物對人體到底有沒有害？29醫(yī)學分子生物學在分子水平上，探討人類生、老、病、死的分子機理挖掘分子水平干預疾病的線索和方法利用分子生物學的理論和技術使不可能成為可能如果人類各種器件都能自我更新，人還衰老嗎？用皮膚細胞培育出心臟，你信嗎？2008年，小鼠皮膚細胞心肌細胞、血管平滑肌細胞、造血細胞2008年(NatMed)，利用大鼠心臟脫細胞支架的第一個人工心臟誕生30OneoftheTaylorteam’sbio-artificialheartsinajar生物反應器將大鼠心臟的細胞去掉，保留心臟的三維結構Ittookaboutayear31ScientistscreateartificialjellyfishfromratheartcellsUsingratheartmusclecellsandathinsiliconefilm,researchershaveconstructedaswimmingjellyfishlikecreature.水母ByStephaniePappas,

LiveScience/July23,2012agoodmodeltousetostudycardiacphysiology你也許會問：這與分子生物學有什么關系？32三.分子生物學與醫(yī)學發(fā)展傳統(tǒng)醫(yī)學，比如中醫(yī)學現(xiàn)代醫(yī)學，比如西醫(yī)學望、聞、問、切個性化診療模糊處理內在與外在的關系系統(tǒng)性分析避免個性偏差從解剖開始精確到器官、細胞，必然尋求更精確的解釋結合？33分子變異與疾病1956年，發(fā)現(xiàn)鐮狀細胞性貧血的主要原因是珠蛋白的第6位谷氨酸變?yōu)槔i氨酸鐮狀細胞性貧血后來證明：疾病的本質是編碼珠蛋白的基因發(fā)生了點突變GAG(谷氨酸)GTG(纈氨酸)點突變這是第一次確認的一種疾病由一個分子的一個特定改變所引起34—老年癡呆阿爾海默氏癡呆癥血管性癡呆癥其他類型的癡呆癥美國前總統(tǒng)——里根中國和歐美國家發(fā)病率相似>65歲：2-5%發(fā)病>85歲：50%以上發(fā)病早期發(fā)病(<65歲)：<1%病例與APP、PS1和PS2基因突變有關。晚期發(fā)病(>65歲):載脂蛋白酶E4(APOE4)基因的過度復制可能是重要原因1994年里根被診斷為Alzheimerdisease1994.9.21被確定為worldAlzheimer’sday2011年：通過鼻腔將胰島素送入腦內，近70%患者在4個月內記憶力有所改善2012年：抗癲癇藥左乙拉西坦在小鼠模型中能降低50%腦內異常網絡活動并改善記憶351970年，從雞肉瘤中分離到能使細胞轉化成肉瘤的病毒HaroldVarmus

J.MichaelBishop1976年，發(fā)現(xiàn)病毒癌基因Src

(1989年獲Nobel獎)

之后確定了細胞癌基因的概念因此，對腫瘤發(fā)生發(fā)展機制方面的知識影響巨大現(xiàn)在已經發(fā)現(xiàn)大約40個不同的癌基因這種發(fā)現(xiàn)也拓寬了人們洞察復雜信號系統(tǒng)的視野，從而掌控細胞的正常生長—惡性腫瘤36 Prostate LungandbronchusColonandrectum Uterinebladder Melanomaofskin Non-HodgkinlymphomaKidney&renalpelvis Leukemia OralCavity Pancreas AllOtherSites 33%12%10% 7% 5% 4%3% 3% 3% 2% 17% 28%15%9% 7% 5% 4% 4%

4%

3%

Men:710,0402005and2011EstimatedUSCancerNewCases789,6202005201137Women:662,870 Breast LungandbronchusColonandrectum Uterinecorpus Non-Hodgkinlymphoma MelanomaofskinOvary Thyroid Urinarybladder Pancreas AllOtherSites 32%12%11% 6% 4% 4%3% 3% 2% 2% 21% 28%14%10% 6% 4% 4% 3% 5%

3%

2005and2011EstimatedUSCancerNewCases

739,9402005201138疾病的分子診斷從基因水平上判斷癌癥的預后提供治療方案選擇的依據,如Her2MammaPrint:Agendia’s

開發(fā)美國FDA批準同時檢測70個基因判斷乳腺癌轉歸據分析：80%乳腺癌術后沒有必要進行化療提問：我們現(xiàn)在為什么對幾乎所有癌癥術后患者進行化療？敢不敢不化療？391990年，世界上第一例真正意義上的基因治療將腺苷脫氨酶(ADA)基因用逆轉錄病毒作載體導入ADA缺陷病人的T淋巴細胞中基因治療對象：4歲女孩ADA缺乏性嚴重復合型免疫缺陷病替代療法雖然從此掀起基因治療研究的熱潮基因治療仍面臨極大的困難和挑戰(zhàn)疾病的分子治療40—基因型與治療HBV感染：全世界有3億多攜帶者，我國有1.2億人長期攜帶我國每年死于HBV相關肝病人數(shù)28萬HCV感染：全球有1.7億人感染丙肝全球每年約30萬例死于丙肝引起的肝癌中國約3800萬丙型肝炎重癥感染者33%HIV感染者合并HCV感染研究發(fā)現(xiàn)：人基因組上與IL-28基因相連的一個基因的一個點突變，顯著影響丙肝的治療效果<Nature>(2009-8-16)TC突變30%治愈80%治愈干擾素+利巴韋林41疾病治療的生物替代品重組蛋白(多肽)產品：IFN,IL-2,GM-CSF…基因治療載體：病毒，質粒…轉基因細胞干細胞：胚胎干細胞，誘導型多能干細胞inducedpluripotentstem(iPS)embryonicstemcell(ES

cell)將皮膚等體細胞誘導成多能干細胞問題：為什么能將終末分化的細胞變成干細胞呢？42掌控細胞的命運緣于對基因表達調控的認識基因組重新編程(re-programme)在受精過程中精子提供另一套染色體精子還提供6種mRNA這些mRNA：使基因組重新程序化？是生命之初的基因開關？43iPS細胞的啟示：基因組重新程序化并不需要太復雜的因素四種轉錄因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)可將體細胞轉化為iPS細胞單個轉錄因子Oct4可將人神經干細胞誘導成iPS細胞細胞這么容易就能獲得全能性，你能想象一下細胞癌變的難易嗎？器官移植的材料來源還是問題嗎？44Early-stageepigeneticmodificationduringsomaticcellreprogrammingbyParp1andTet2.Nature,488:652–655(30Aug2012)2012年8月：基因表達受到兩類蛋白的共同控制：—轉錄因子—表觀遺傳調控子以各種方式來影響基因的表達，如通過改變組蛋白直接結合到DNA上發(fā)揮作用兩種表觀遺傳調控因子Parp1和Tet2—刺激了成纖維細胞中靜止多能基因的表達，由此啟動了這些細胞重編程為iPSCs—成纖維細胞中Oct4誘導了Parp1表達Oct4轉錄因子Parp1表觀調控因子啟動多能基因的表達問題：表觀調控因子是如何“知道”哪些基因需要被重新激活？是否廣泛除去對整個基因組基因表達的抑制？是通過重編程轉錄因子引導到特異的基因？45哪種疾病與基因沒關系呢？每個人在這個世界上都是獨一無二的每個基因組序列都不可能是一樣的(同卵雙生？)你能回答下面的問題嗎？同一環(huán)境下為什么有人感冒了而你安然無恙？同樣的飲食營養(yǎng)為什么有人得動脈硬化了？同樣的打擊為什么有人瘋了？那是因為，他們的基因有差異，序列不一樣？修飾不一樣？數(shù)目不一樣？位置不一樣？其實，就是老百姓說的“體質”不一樣46—不同個體的基因組有差異中國人YH基因組序列與Watson和Venter序列的異同AllSNPsnon-synonymousSNPsgeneswithnon-synonymousSNPssynonymous同義的47未來醫(yī)學研究的思維方式：單基因病幾個基因病復雜性狀疾病的遺傳背景研究腫瘤心血管系統(tǒng)疾病糖尿病重要感染性疾病疾病易感性藥物敏感性個體基因組與環(huán)境相互作用基因突變基因多態(tài)性表觀遺傳改變環(huán)境相互作用遺傳背景參與分子易感因素疾病的診斷：評價疾病的存在狀態(tài)預測疾病的轉歸及預后評判疾病在個體發(fā)生的風險性48—從堿基到病床基因組結構基因組生物學疾病生物學前瞻醫(yī)學科學改善醫(yī)療保健1990-2003人類基因組計劃2004-20102011-20202020以后—Nature,Feb10,201149—60年前我們無法想象通過操作遺傳物質來認識生命的奧秘—今天我們也無法想象未來生命科學會出現(xiàn)怎樣的巨變但我們知道：—分子生物學能帶領我們去探索生命的奧秘50小結：主要內容：分子生物學的概念——中心法則，DNA分子生物學的發(fā)展歷程—DNA雙螺旋模板學說——分子生物學誕生—分子生物學快速發(fā)展——DNA操作，基因克隆分子生物學與醫(yī)學發(fā)展—疾病與基因變異、異常開啟或關閉有關—分子診斷與治療方案選擇有關51這門課需要準備的知識：普通生物化學遺傳學簡單病毒學和細菌學細胞生物學52自學內容：三種生物大分子的基本特性關鍵酶的功能基因表達原核細胞和真核細胞DNA結構、DNA復制、DNA重組DNA序列，基因組及其序列元件(element)DNA聚合酶，RNA聚合酶53Abriefreview：DNA結構特性：一級結構：

GATC四種核苷酸——3