精減4重組-13碩課件

第四章DNA重組12/22/20221第四章DNA重組12/19/20221DNA重組（DNArecombination）DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合，即核苷酸序列的交換、重排(rearrangement)和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，稱為DNA重組。重組產(chǎn)物稱為重組體DNA。12/22/20222DNA重組（DNArecombination）DNA分子內(nèi)DNA重組的廣泛性廣泛存在于各類生物真核生物基因組間重組多發(fā)生在減數(shù)分裂時同源染色體之間的交換。細(xì)菌及噬菌體來自不同親代兩組DNA之間可通過多種形式進(jìn)行遺傳重組。12/22/20223DNA重組的廣泛性廣泛存在于各類生物12/19/2022312/22/2022412/19/20224DNA重組的生物學(xué)意義迅速增加群體的遺傳多樣性通過優(yōu)化組合積累有意義的遺傳信息參與許多重要的生物學(xué)過程

為DNA損傷或復(fù)制障礙提供修復(fù)機(jī)制---重組修復(fù)某些生物的基因表達(dá)受DNA重組調(diào)節(jié)12/22/20225DNA重組的生物學(xué)意義迅速增加群體的遺傳多樣性12/19/2DNA重組在相應(yīng)序列之間精確發(fā)生，在重組染色體上既不多加也不丟失任何堿基。重組可分為三種類型，其共同點(diǎn)是在兩個DNA雙鏈之間發(fā)生物理性物質(zhì)交換。不同類型發(fā)生的機(jī)制不同。DNA重組的特點(diǎn)12/22/20226DNA重組在相應(yīng)序列之間精確發(fā)生，在重組染色體上既不多加也不DNA重組機(jī)制一、同源重組(homologousrecombination)二、位點(diǎn)特異性（專一性）重組(site-specificrecombination)三、轉(zhuǎn)座重組(transpositionrecombination)12/22/20227DNA重組機(jī)制一、同源重組(homologousrecom一、同源重組(homologousrecombination)一般性重組(generalrecombination)是在兩個DNA分子的同源序列間直接進(jìn)行交換的一種重組形式。真核生物中，同源重組發(fā)生在減數(shù)分裂時期細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)12/22/20228一、同源重組(homologousrecombinatio一、同源重組1Holliday模型RobinHolliday于1964年提出2大腸桿菌同源重組的分子基礎(chǔ)12/22/20229一、同源重組1Holliday模型Robin1Holliday模型Branchmigration異源雙鏈區(qū)分支遷移Holliday連接重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本，稱為片段重組體。重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自不同親本，稱為拼接重組體。12/22/2022101Holliday模型BranchmigrationHolliday模型形成小結(jié)1重組始于雙鏈斷裂與再連接（兩條同源序列先整齊排列）兩個配對雙鏈DNA的同源鏈中相應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生斷裂2通過分支遷移產(chǎn)生異源雙鏈重組結(jié)合點(diǎn)能夠沿雙鏈移動3形成Holliday中間體4Holliday中間體切開并修復(fù)，切口方向決定重組結(jié)果片段重組體（前后兩個切口在同一條鏈上）拼接重組體（前后兩個切口在不同鏈上）12/22/202211Holliday模型形成小結(jié)1重組始于雙鏈斷裂與再連接DNA在分支點(diǎn)形成帶有一些單鏈?zhǔn)中蜨olliday中間體PotterDressler噬菌體12/22/202212DNA在分支點(diǎn)形成帶有一些單鏈?zhǔn)中蜨olliday中間體P同源重組雙鏈之間進(jìn)行連接所需要的同源區(qū)域最短是多少？

通過質(zhì)粒及噬菌體把短的同源序列引入細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)表明，如果同源區(qū)小于75bp則重組頻率降低。

12/22/202213同源重組雙鏈之間進(jìn)行連接所需要的同源區(qū)域最短是多少？

通過2大腸桿菌同源重組的分子基礎(chǔ)在細(xì)菌中識別重組位點(diǎn)重組僅涉及DNA分子的限定區(qū)域而不是完整的染色體重組的一般過程是相同的：1）兩條序列先平行排列，然后兩條序列的其中一條單鏈均發(fā)生斷裂2）斷裂分子的一個單鏈與其同源雙鏈相互作用3）配對區(qū)域延伸-----分支遷移4）內(nèi)切核酸酶消化同源雙鏈12/22/2022142大腸桿菌同源重組的分子基礎(chǔ)在細(xì)菌中識別重組位點(diǎn)12/2大腸桿菌重組的分子基礎(chǔ)每一步都需要酶的催化重組（Recombination）有關(guān)的酶RecA蛋白與RecBCD系統(tǒng)RuvA、RuvB和RuvC蛋白12/22/2022152大腸桿菌重組的分子基礎(chǔ)每一步都需要酶的催化12/19RecA蛋白及其功能在E.coli中，RecA蛋白參與重組是最關(guān)鍵的步驟1誘發(fā)SOS反應(yīng)

－－作為共蛋白酶(co-protease)促進(jìn)LexA蛋白的水解；是SOS反應(yīng)最初發(fā)動的因子2促進(jìn)DNA單鏈的同化

單鏈同化即指單鏈與同源雙鏈分子發(fā)生鏈交換，從而產(chǎn)生重組過程中的DNA配對、Holliday中間體形成、分支遷移等步驟。12/22/202216RecA蛋白及其功能在E.coli中，RecA蛋白參與重組是

嚴(yán)重的DNA損傷產(chǎn)生大量單鏈缺口

LexA阻遏蛋白裂解，阻遏作用解除

激活RecA蛋白（需要單鏈DNA和ATP存在）

一系列基因表達(dá)（包括修復(fù)基因）

DNASOS修復(fù)（易錯修復(fù)，突變增加）RecA蛋白誘發(fā)SOS反應(yīng)12/22/202217嚴(yán)重的DNA損傷產(chǎn)生大量單鏈缺口LexA阻遏蛋白

E.coli的SOS反應(yīng)

12/22/202218E.coli的SOS反應(yīng)12/19/202218重組修復(fù)損傷ABCD序列相同重組12/22/202219重組修復(fù)損傷ABCD序列相同重組12/19/202219RecA蛋白介導(dǎo)的DNA鏈交換模型（單鏈同化）RecA蛋白與單鏈DNA結(jié)合復(fù)合物與同源雙鏈DNA結(jié)合入侵單鏈與雙鏈中的互補(bǔ)鏈配對，同源鏈被置換RecA蛋白與單鏈DNA的結(jié)合具有協(xié)同性12/22/202220RecA蛋白介導(dǎo)的DNA鏈交換模型RecA蛋白與單鏈DNA結(jié)RecBCD系統(tǒng)及其功能1任何部位的單鏈DNA都能借助RecA蛋白與同源雙鏈DNA進(jìn)行鏈交換。2單鏈DNA可由多種途徑產(chǎn)生。3RecBCD酶是產(chǎn)生參與重組的DNA單鏈的主要途徑，產(chǎn)生3’單鏈末端。該酶的亞基分別由基因recB、recC和recD編碼。12/22/202221RecBCD系統(tǒng)及其功能1任何部位的單鏈DNA都能借助ReRecBCD系統(tǒng)及其功能具有三種酶的活性1依賴于ATP的核酸外切酶活性2可被ATP增強(qiáng)的核酸內(nèi)切酶活性3ATP依賴的解螺旋酶活性12/22/202222RecBCD系統(tǒng)及其功能具有三種酶的活性12/19/2022產(chǎn)生3’單鏈DNAΧ序列12/22/202223產(chǎn)生3’單鏈DNAΧ序列12/19/202223Χ序列及其功能是一段特殊的堿基序列，其一致序列是5’-GCTGGTGG它的存在能顯著提高重組的頻率能在重組過程中調(diào)節(jié)RecBCD的酶活性作為其從3’-5’外切酶活性轉(zhuǎn)變?yōu)?’-3’外切酶活性的信號12/22/202224Χ序列及其功能是一段特殊的堿基序列，其一致序列是12/19/RuvA、RuvB和RuvC蛋白RuvA蛋白識別Holliday連接，協(xié)助RuvB蛋白催化分支的遷移。以一種特別的方式形成四聚體，呈四重對稱。RuvB蛋白是一種解鏈酶，催化重組中分支的遷移，是一種環(huán)狀六聚體蛋白。單獨(dú)結(jié)合DNA的效率并不高，需要RuvA的幫助。RuvC蛋白是一種特殊的核酸內(nèi)切酶，在重組中促進(jìn)Holliday連接的分離，又稱拆分酶，是一種二聚體蛋白。其作用具有一定的序列特異性，其作用的一致序列為5’-(A/T)TT(G/C)-3’12/22/202225RuvA、RuvB和RuvC蛋白RuvA蛋白識別Holl識別連接分支遷移連接分離12/22/202226識別連接分支遷移連接分離12/19/202226產(chǎn)生3’單鏈12/22/202227產(chǎn)生3’單鏈12/19/202227二、位點(diǎn)專一性重組(site-specificrecombination)指發(fā)生在DNA特異性位點(diǎn)上的重組參與重組的特異性位點(diǎn)需要專門的蛋白質(zhì)識別和結(jié)合12/22/202228二、位點(diǎn)專一性重組(site-specificrecomb二、特異位點(diǎn)重組（位點(diǎn)專一性重組）λ噬菌體在E.coli細(xì)胞中以兩種形式存在：裂解狀態(tài)與溶原狀態(tài)（前噬菌體）兩種類型間的轉(zhuǎn)換通過位點(diǎn)特異性重組實(shí)現(xiàn)為了進(jìn)入溶原狀態(tài)，游離λDNA必須整合到宿主DNA中(整合反應(yīng))；為了從溶原狀態(tài)進(jìn)入裂解周期，前噬菌體DNA必須從染色體DNA上切除下來(切除反應(yīng))。12/22/202229二、特異位點(diǎn)重組（位點(diǎn)專一性重組）λ噬菌體在E.coli細(xì)胞（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1重組反應(yīng)在附著位點(diǎn)(attachmentsite)發(fā)生2與催化有關(guān)的酶類12/22/202230（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1重組反應(yīng)在（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1重組反應(yīng)在附著位點(diǎn)(attachmentsite)發(fā)生整合和切除過程是在細(xì)菌和噬菌體DNA上被稱為附著位點(diǎn)的特殊位置上，通過重組作用而實(shí)現(xiàn)。12/22/202231（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1重組反應(yīng)在（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1重組反應(yīng)在附著位點(diǎn)(attachmentsite)發(fā)生在細(xì)菌遺傳學(xué)中，細(xì)菌染色體上的這一附著位點(diǎn)稱為attλ。若這一座位發(fā)生突變，則會抑制λ的整合。細(xì)菌上的附著位點(diǎn)（attλ）稱為attB(Bacteria)，噬菌體上的稱為attP(Phage)attP長度為255bpattB長度為30bp兩者含有共同的核心序列15bp（O區(qū)）POP’BOB’12/22/202232（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1重組反應(yīng)在（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1重組反應(yīng)在附著位點(diǎn)(attachmentsite)發(fā)生2與催化重組有關(guān)的酶類12/22/202233（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1重組反應(yīng)在（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除2催化重組的酶類

整合反應(yīng)：整合酶（Integrase,Int）、整合宿主因子（IntegrationHostFactor,IHF）

切除反應(yīng)：整合酶（Int）、整合宿主因子（IHF）、噬菌體基因xis產(chǎn)物12/22/202234（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除12/19/2切除反應(yīng)整合反應(yīng)xis噬菌體BB‘環(huán)形噬菌體DNA通過attP位點(diǎn)和attB位點(diǎn)的交互重組將噬菌體DNA變成整合的線形前噬菌體DNA整合integration12/22/202235切整xis噬菌體BB‘環(huán)形噬菌體DNA通過attP位點(diǎn)和at12/22/20223612/19/202236attP(255bp)attB(30bp)attO(15bp)12/22/202237attP(255bp)attB(30bp)attO(15bp（二）位點(diǎn)特異性重組結(jié)果依賴于重組

位點(diǎn)的位置和方向12211212212結(jié)果發(fā)生倒位結(jié)果發(fā)生切除切除的環(huán)形片段重組位點(diǎn)反方向位于同一DNA分子上重組位點(diǎn)同方向位于同一DNA分子上112/22/202238（二）位點(diǎn)特異性重組結(jié)果依賴于重組

位點(diǎn)的位置和位點(diǎn)特異性重組結(jié)果小結(jié)1當(dāng)重組位點(diǎn)反方向位于同一DNA分子上時，重組結(jié)果：發(fā)生倒位；2當(dāng)重組位點(diǎn)同方向位于同一DNA分子上時，重組結(jié)果：發(fā)生切除；3當(dāng)重組位點(diǎn)位于不同DNA分子上時，重組結(jié)果：發(fā)生整合。12/22/202239位點(diǎn)特異性重組結(jié)果小結(jié)1當(dāng)重組位點(diǎn)反方向位于同一DNA分子（三）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門菌的H抗原H1鞭毛蛋白H2鞭毛蛋白單菌落的沙門菌中經(jīng)常出現(xiàn)少數(shù)呈另一H抗原的細(xì)菌細(xì)胞（鞭毛相轉(zhuǎn)變）12/22/202240（三）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門菌的H抗原H1鞭毛蛋白H2鞭毛蛋沙門菌的H片段倒位遺傳學(xué)分析表明，這種抗原相位改變是由一段995bp的DNA，稱為H片段發(fā)生倒位所決定的。12/22/202241沙門菌的H片段倒位遺傳學(xué)分析表明，這種抗原相位改變是由一段1hin編碼特異的重組酶（倒位酶）hix為14bp的反向重復(fù)序列重組位點(diǎn)Promoterhin是否仍表達(dá)？H2、rH1呢？H1呢？沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變12/22/202242hin編碼特異的重組酶hix為14bp的反向重復(fù)序列重組位點(diǎn)沙門菌的H片段倒位遺傳學(xué)分析表明，這種抗原相位改變是由一段995bp的DNA，稱為H片段發(fā)生倒位所決定的。rH1阻遏蛋白與啟動子結(jié)合阻止H1表達(dá)PH片段（995bp）PH片段（995bp）為14bp的反向重復(fù)序列hixhin編碼特異的重組酶（倒位酶）12/22/202243沙門菌的H片段倒位遺傳學(xué)分析表明，這種抗原相位改變是由一段r沙門氏菌的H片段倒位rH1倒位后，啟動子序列與H2、rH1取向相反，H2、rH1不表達(dá),解除了對H1的抑制，H1表達(dá)PPH1鞭毛素H片段（995bp）hin是否仍表達(dá)？√12/22/202244沙門氏菌的H片段倒位rH1倒位后，啟動子序列與H2、rH三、轉(zhuǎn)座重組(transpositionrecombination)指DNA上的核苷酸序列從一個位置轉(zhuǎn)移到另外一個位置的現(xiàn)象。發(fā)生轉(zhuǎn)位的DNA片段稱為轉(zhuǎn)座元件、可移位遺傳元件(mobilegeneticelement,MGE)、跳躍基因(jumpgene)12/22/202245三、轉(zhuǎn)座重組(transpositionrecombina轉(zhuǎn)座元件的種類

原核生物轉(zhuǎn)座元件的種類

IS（插入序列）TnAfamilyCompositetransposonTransposablephage

復(fù)制型轉(zhuǎn)座元件(replicatingtransposableelement)

12/22/202246轉(zhuǎn)座元件的種類復(fù)制型長度較小，一般700－2000bp之間兩端通常含有10－40bp長的IR(invertedrepeats)內(nèi)部一般只有一個基因，編碼產(chǎn)物為轉(zhuǎn)座酶缺乏抗生素或其他毒性抗性基因(一)插入序列（insertionsequence，IS）l

7002000basepair（bp）GATCGTC--------------------------GACGATCCTAGCAG---------------------------CTGCTAG●GATCGTC--------------------------GACGATC

Stem-loop

5’

GATCGTC3’CTAGCAG

12/22/202247長度較小，一般700－2000bp之間(一)插入序列（IS的結(jié)構(gòu)一個結(jié)構(gòu)基因反向重復(fù)序列12/22/202248IS的結(jié)構(gòu)一個結(jié)構(gòu)基因反向重復(fù)序列12/19/202248IS的轉(zhuǎn)座機(jī)制

當(dāng)IS轉(zhuǎn)座時，宿主靶部位雙鏈交錯切開，經(jīng)修復(fù)后IS兩側(cè)形成短的正向重復(fù)。12/22/202249IS的轉(zhuǎn)座機(jī)制當(dāng)IS轉(zhuǎn)座時，宿主靶部位雙鏈交錯切開，經(jīng)修復(fù)基因的表達(dá)及其產(chǎn)物的活性?ATGTAAATGTAA12/22/202250基因的表達(dá)ATGTAAATGTAA12/19/202250(二)轉(zhuǎn)座子(Transposon，Tn/TnpAfamily)

l兩側(cè)含有35－40bp的IRl

較長，2.5kb20kb

l內(nèi)部通常含有不止一個結(jié)構(gòu)基因：轉(zhuǎn)座酶基因、調(diào)節(jié)基因、抗生素抗性基因(resistancegene)

12/22/202251(二)轉(zhuǎn)座子(Transposon，Tn/TnpAfal

Tn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpRStrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrRTmpR)Tn9(CamR)Tn10(TetR)多個結(jié)構(gòu)基因反向重復(fù)序列12/22/202252l

Tn1(AmpR)(三)復(fù)合元件/復(fù)合轉(zhuǎn)座子

（compositeelement/compositetansposon）●

IS插入到一段帶有抗生素抗性基因或其它毒性抗性基因等結(jié)構(gòu)基因的兩端，形成復(fù)合轉(zhuǎn)座子。IStranspositionmutationISIS

ISLISR臂中心區(qū)臂插入結(jié)果？12/22/202253(三)復(fù)合元件/復(fù)合轉(zhuǎn)座子●IS插入到一段帶有抗生素抗●復(fù)合轉(zhuǎn)座子一旦形成，轉(zhuǎn)座功能受較多因子調(diào)控●結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

IRIRIRIRIRIR

IS10LTn10(9.3kb)IS10R

IRIRIRIRDRDR

IS1LTn9(2.5kb)IS1R結(jié)構(gòu)基因兩端IS序列方向相反結(jié)構(gòu)基因兩端IS序列方向相同兩種轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定性？12/22/202254●復(fù)合轉(zhuǎn)座子一旦形成，轉(zhuǎn)座功能受較多因子調(diào)控●結(jié)●穩(wěn)定性發(fā)生切除DR型(Instable)12/22/202255●穩(wěn)定性發(fā)生切除DR型(Instable)12IR型(Stable)InversionBAABBA發(fā)生倒位12/22/202256IR型(Stable)InversionB思考題：轉(zhuǎn)座子Tn9和Tn10，哪一種較穩(wěn)定？為什么？12/22/202257思考題：轉(zhuǎn)座子Tn9和Tn10，哪一種較穩(wěn)定？為什么？12/轉(zhuǎn)座重組產(chǎn)生的效應(yīng)1.是基因突變和重排的重要原因：轉(zhuǎn)座元件的存在，會增加宿主基因組DNA的量，同時引起宿主染色體DNA重組，造成染色體斷裂、重復(fù)、缺失、倒位及易位等。2.影響鄰近基因的表達(dá)，改變宿主表型：轉(zhuǎn)座元件也可通過干擾宿主基因與其調(diào)控元件之間的關(guān)系或轉(zhuǎn)座元件本身的作用而從而改變宿主表型。12/22/202258轉(zhuǎn)座重組產(chǎn)生的效應(yīng)1.是基因突變和重排的重要原因：轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座重組產(chǎn)生的效應(yīng)轉(zhuǎn)座元件插入特定基因內(nèi)部后，很可能導(dǎo)致基因失活，這是轉(zhuǎn)座作用最直接的效應(yīng)。當(dāng)轉(zhuǎn)座元件自發(fā)插入細(xì)菌的啟動子時，即可阻止它所控制基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。由于轉(zhuǎn)座元件帶有終止子，其插入將影響操縱子中其后基因的表達(dá)。12/22/202259轉(zhuǎn)座重組產(chǎn)生的效應(yīng)轉(zhuǎn)座元件插入特定基因內(nèi)部后，很可能導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)座重組的生物學(xué)意義人、小鼠和水稻的基因組大約有40%的序列由轉(zhuǎn)座子衍生而來。低等真核生物和細(xì)菌內(nèi)轉(zhuǎn)座子相應(yīng)比例較小，約1%-5%。轉(zhuǎn)座子在從低等生物到高等生物的基因和基因組進(jìn)化過程中曾發(fā)揮過十分重要的作用。12/22/202260轉(zhuǎn)座重組的生物學(xué)意義人、小鼠和水稻的基因組大約有40%的序列1.RecA蛋白是怎樣調(diào)節(jié)SOS反應(yīng)的？2.什么叫DNA重組？歸納總結(jié)三種DNA重組的機(jī)制。3.什么是Holliday中間體？它是如何形成的？（RecA和RecBCD系統(tǒng)、Ruv系統(tǒng)是如何發(fā)揮作用的？）4.在位點(diǎn)特異性重組中，若重組位點(diǎn)反向位于同一條DNA上，則重組后的結(jié)果會怎樣？若同方向位于一條DNA上呢？若重組位點(diǎn)位于不同DNA分子上，重組結(jié)果如何？（可圖示說明）5.什么是卡序列？它在同源重組中如何發(fā)揮作用？復(fù)習(xí)題12/22/2022611.RecA蛋白是怎樣調(diào)節(jié)SOS反應(yīng)的？復(fù)習(xí)題12/19/6.在不同的轉(zhuǎn)座子類型中，Tn10與Tn9哪一種轉(zhuǎn)座子較穩(wěn)定？為什么？7.以DNA重組為例，說說生物大分子是如何相互作用來影響生命現(xiàn)象的？12/22/2022626.在不同的轉(zhuǎn)座子類型中，Tn10與Tn9哪一種轉(zhuǎn)座子較穩(wěn)小測試4.轉(zhuǎn)座子引起的突變可類似于缺失突變的效果：基因的功能完全喪失?，F(xiàn)有一青霉素抗性的突變菌株，經(jīng)過Tn5侵染后，失去了青霉素抗性，試解釋原因？A．轉(zhuǎn)座子改變了細(xì)菌的代謝過程B．轉(zhuǎn)座子影響了細(xì)菌細(xì)胞壁的合成過程C．轉(zhuǎn)座子插入編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因內(nèi)部，使之失活D．轉(zhuǎn)座子使細(xì)菌通過其他機(jī)制抵御青霉素作用E．無法解釋12/22/202263小測試4.轉(zhuǎn)座子引起的突變可類似于缺失突變的效果：基因的功5.利用自己的位點(diǎn)專一重組酶把自己從寄主基因組中的一個地方移到另一個地方的遺傳元件叫（）A、啟動子B、轉(zhuǎn)座子C、T-DNAD、順反子6.以沙門菌中鞭毛抗原相轉(zhuǎn)變?yōu)槔?，試說明位點(diǎn)特異性重組是如何發(fā)生的？7.什么是IS？什么是transposon?12/22/2022645.利用自己的位點(diǎn)專一重組酶把自己從寄主基因組中的一個地方謝謝！12/22/202265謝謝！12/19/202265第四章DNA重組12/22/202266第四章DNA重組12/19/20221DNA重組（DNArecombination）DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合，即核苷酸序列的交換、重排(rearrangement)和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，稱為DNA重組。重組產(chǎn)物稱為重組體DNA。12/22/202267DNA重組（DNArecombination）DNA分子內(nèi)DNA重組的廣泛性廣泛存在于各類生物真核生物基因組間重組多發(fā)生在減數(shù)分裂時同源染色體之間的交換。細(xì)菌及噬菌體來自不同親代兩組DNA之間可通過多種形式進(jìn)行遺傳重組。12/22/202268DNA重組的廣泛性廣泛存在于各類生物12/19/2022312/22/20226912/19/20224DNA重組的生物學(xué)意義迅速增加群體的遺傳多樣性通過優(yōu)化組合積累有意義的遺傳信息參與許多重要的生物學(xué)過程

為DNA損傷或復(fù)制障礙提供修復(fù)機(jī)制---重組修復(fù)某些生物的基因表達(dá)受DNA重組調(diào)節(jié)12/22/202270DNA重組的生物學(xué)意義迅速增加群體的遺傳多樣性12/19/2DNA重組在相應(yīng)序列之間精確發(fā)生，在重組染色體上既不多加也不丟失任何堿基。重組可分為三種類型，其共同點(diǎn)是在兩個DNA雙鏈之間發(fā)生物理性物質(zhì)交換。不同類型發(fā)生的機(jī)制不同。DNA重組的特點(diǎn)12/22/202271DNA重組在相應(yīng)序列之間精確發(fā)生，在重組染色體上既不多加也不DNA重組機(jī)制一、同源重組(homologousrecombination)二、位點(diǎn)特異性（專一性）重組(site-specificrecombination)三、轉(zhuǎn)座重組(transpositionrecombination)12/22/202272DNA重組機(jī)制一、同源重組(homologousrecom一、同源重組(homologousrecombination)一般性重組(generalrecombination)是在兩個DNA分子的同源序列間直接進(jìn)行交換的一種重組形式。真核生物中，同源重組發(fā)生在減數(shù)分裂時期細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)12/22/202273一、同源重組(homologousrecombinatio一、同源重組1Holliday模型RobinHolliday于1964年提出2大腸桿菌同源重組的分子基礎(chǔ)12/22/202274一、同源重組1Holliday模型Robin1Holliday模型Branchmigration異源雙鏈區(qū)分支遷移Holliday連接重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本，稱為片段重組體。重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自不同親本，稱為拼接重組體。12/22/2022751Holliday模型BranchmigrationHolliday模型形成小結(jié)1重組始于雙鏈斷裂與再連接（兩條同源序列先整齊排列）兩個配對雙鏈DNA的同源鏈中相應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生斷裂2通過分支遷移產(chǎn)生異源雙鏈重組結(jié)合點(diǎn)能夠沿雙鏈移動3形成Holliday中間體4Holliday中間體切開并修復(fù)，切口方向決定重組結(jié)果片段重組體（前后兩個切口在同一條鏈上）拼接重組體（前后兩個切口在不同鏈上）12/22/202276Holliday模型形成小結(jié)1重組始于雙鏈斷裂與再連接DNA在分支點(diǎn)形成帶有一些單鏈?zhǔn)中蜨olliday中間體PotterDressler噬菌體12/22/202277DNA在分支點(diǎn)形成帶有一些單鏈?zhǔn)中蜨olliday中間體P同源重組雙鏈之間進(jìn)行連接所需要的同源區(qū)域最短是多少？

通過質(zhì)粒及噬菌體把短的同源序列引入細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)表明，如果同源區(qū)小于75bp則重組頻率降低。

12/22/202278同源重組雙鏈之間進(jìn)行連接所需要的同源區(qū)域最短是多少？

通過2大腸桿菌同源重組的分子基礎(chǔ)在細(xì)菌中識別重組位點(diǎn)重組僅涉及DNA分子的限定區(qū)域而不是完整的染色體重組的一般過程是相同的：1）兩條序列先平行排列，然后兩條序列的其中一條單鏈均發(fā)生斷裂2）斷裂分子的一個單鏈與其同源雙鏈相互作用3）配對區(qū)域延伸-----分支遷移4）內(nèi)切核酸酶消化同源雙鏈12/22/2022792大腸桿菌同源重組的分子基礎(chǔ)在細(xì)菌中識別重組位點(diǎn)12/2大腸桿菌重組的分子基礎(chǔ)每一步都需要酶的催化重組（Recombination）有關(guān)的酶RecA蛋白與RecBCD系統(tǒng)RuvA、RuvB和RuvC蛋白12/22/2022802大腸桿菌重組的分子基礎(chǔ)每一步都需要酶的催化12/19RecA蛋白及其功能在E.coli中，RecA蛋白參與重組是最關(guān)鍵的步驟1誘發(fā)SOS反應(yīng)

－－作為共蛋白酶(co-protease)促進(jìn)LexA蛋白的水解；是SOS反應(yīng)最初發(fā)動的因子2促進(jìn)DNA單鏈的同化

單鏈同化即指單鏈與同源雙鏈分子發(fā)生鏈交換，從而產(chǎn)生重組過程中的DNA配對、Holliday中間體形成、分支遷移等步驟。12/22/202281RecA蛋白及其功能在E.coli中，RecA蛋白參與重組是

嚴(yán)重的DNA損傷產(chǎn)生大量單鏈缺口

LexA阻遏蛋白裂解，阻遏作用解除

激活RecA蛋白（需要單鏈DNA和ATP存在）

一系列基因表達(dá)（包括修復(fù)基因）

DNASOS修復(fù)（易錯修復(fù)，突變增加）RecA蛋白誘發(fā)SOS反應(yīng)12/22/202282嚴(yán)重的DNA損傷產(chǎn)生大量單鏈缺口LexA阻遏蛋白

E.coli的SOS反應(yīng)

12/22/202283E.coli的SOS反應(yīng)12/19/202218重組修復(fù)損傷ABCD序列相同重組12/22/202284重組修復(fù)損傷ABCD序列相同重組12/19/202219RecA蛋白介導(dǎo)的DNA鏈交換模型（單鏈同化）RecA蛋白與單鏈DNA結(jié)合復(fù)合物與同源雙鏈DNA結(jié)合入侵單鏈與雙鏈中的互補(bǔ)鏈配對，同源鏈被置換RecA蛋白與單鏈DNA的結(jié)合具有協(xié)同性12/22/202285RecA蛋白介導(dǎo)的DNA鏈交換模型RecA蛋白與單鏈DNA結(jié)RecBCD系統(tǒng)及其功能1任何部位的單鏈DNA都能借助RecA蛋白與同源雙鏈DNA進(jìn)行鏈交換。2單鏈DNA可由多種途徑產(chǎn)生。3RecBCD酶是產(chǎn)生參與重組的DNA單鏈的主要途徑，產(chǎn)生3’單鏈末端。該酶的亞基分別由基因recB、recC和recD編碼。12/22/202286RecBCD系統(tǒng)及其功能1任何部位的單鏈DNA都能借助ReRecBCD系統(tǒng)及其功能具有三種酶的活性1依賴于ATP的核酸外切酶活性2可被ATP增強(qiáng)的核酸內(nèi)切酶活性3ATP依賴的解螺旋酶活性12/22/202287RecBCD系統(tǒng)及其功能具有三種酶的活性12/19/2022產(chǎn)生3’單鏈DNAΧ序列12/22/202288產(chǎn)生3’單鏈DNAΧ序列12/19/202223Χ序列及其功能是一段特殊的堿基序列，其一致序列是5’-GCTGGTGG它的存在能顯著提高重組的頻率能在重組過程中調(diào)節(jié)RecBCD的酶活性作為其從3’-5’外切酶活性轉(zhuǎn)變?yōu)?’-3’外切酶活性的信號12/22/202289Χ序列及其功能是一段特殊的堿基序列，其一致序列是12/19/RuvA、RuvB和RuvC蛋白RuvA蛋白識別Holliday連接，協(xié)助RuvB蛋白催化分支的遷移。以一種特別的方式形成四聚體，呈四重對稱。RuvB蛋白是一種解鏈酶，催化重組中分支的遷移，是一種環(huán)狀六聚體蛋白。單獨(dú)結(jié)合DNA的效率并不高，需要RuvA的幫助。RuvC蛋白是一種特殊的核酸內(nèi)切酶，在重組中促進(jìn)Holliday連接的分離，又稱拆分酶，是一種二聚體蛋白。其作用具有一定的序列特異性，其作用的一致序列為5’-(A/T)TT(G/C)-3’12/22/202290RuvA、RuvB和RuvC蛋白RuvA蛋白識別Holl識別連接分支遷移連接分離12/22/202291識別連接分支遷移連接分離12/19/202226產(chǎn)生3’單鏈12/22/202292產(chǎn)生3’單鏈12/19/202227二、位點(diǎn)專一性重組(site-specificrecombination)指發(fā)生在DNA特異性位點(diǎn)上的重組參與重組的特異性位點(diǎn)需要專門的蛋白質(zhì)識別和結(jié)合12/22/202293二、位點(diǎn)專一性重組(site-specificrecomb二、特異位點(diǎn)重組（位點(diǎn)專一性重組）λ噬菌體在E.coli細(xì)胞中以兩種形式存在：裂解狀態(tài)與溶原狀態(tài)（前噬菌體）兩種類型間的轉(zhuǎn)換通過位點(diǎn)特異性重組實(shí)現(xiàn)為了進(jìn)入溶原狀態(tài)，游離λDNA必須整合到宿主DNA中(整合反應(yīng))；為了從溶原狀態(tài)進(jìn)入裂解周期，前噬菌體DNA必須從染色體DNA上切除下來(切除反應(yīng))。12/22/202294二、特異位點(diǎn)重組（位點(diǎn)專一性重組）λ噬菌體在E.coli細(xì)胞（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1重組反應(yīng)在附著位點(diǎn)(attachmentsite)發(fā)生2與催化有關(guān)的酶類12/22/202295（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1重組反應(yīng)在（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1重組反應(yīng)在附著位點(diǎn)(attachmentsite)發(fā)生整合和切除過程是在細(xì)菌和噬菌體DNA上被稱為附著位點(diǎn)的特殊位置上，通過重組作用而實(shí)現(xiàn)。12/22/202296（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1重組反應(yīng)在（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1重組反應(yīng)在附著位點(diǎn)(attachmentsite)發(fā)生在細(xì)菌遺傳學(xué)中，細(xì)菌染色體上的這一附著位點(diǎn)稱為attλ。若這一座位發(fā)生突變，則會抑制λ的整合。細(xì)菌上的附著位點(diǎn)（attλ）稱為attB(Bacteria)，噬菌體上的稱為attP(Phage)attP長度為255bpattB長度為30bp兩者含有共同的核心序列15bp（O區(qū)）POP’BOB’12/22/202297（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1重組反應(yīng)在（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1重組反應(yīng)在附著位點(diǎn)(attachmentsite)發(fā)生2與催化重組有關(guān)的酶類12/22/202298（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1重組反應(yīng)在（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除2催化重組的酶類

整合反應(yīng)：整合酶（Integrase,Int）、整合宿主因子（IntegrationHostFactor,IHF）

切除反應(yīng)：整合酶（Int）、整合宿主因子（IHF）、噬菌體基因xis產(chǎn)物12/22/202299（一）λDNA通過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除12/19/2切除反應(yīng)整合反應(yīng)xis噬菌體BB‘環(huán)形噬菌體DNA通過attP位點(diǎn)和attB位點(diǎn)的交互重組將噬菌體DNA變成整合的線形前噬菌體DNA整合integration12/22/2022100切整xis噬菌體BB‘環(huán)形噬菌體DNA通過attP位點(diǎn)和at12/22/202210112/19/202236attP(255bp)attB(30bp)attO(15bp)12/22/2022102attP(255bp)attB(30bp)attO(15bp（二）位點(diǎn)特異性重組結(jié)果依賴于重組

位點(diǎn)的位置和方向12211212212結(jié)果發(fā)生倒位結(jié)果發(fā)生切除切除的環(huán)形片段重組位點(diǎn)反方向位于同一DNA分子上重組位點(diǎn)同方向位于同一DNA分子上112/22/2022103（二）位點(diǎn)特異性重組結(jié)果依賴于重組

位點(diǎn)的位置和位點(diǎn)特異性重組結(jié)果小結(jié)1當(dāng)重組位點(diǎn)反方向位于同一DNA分子上時，重組結(jié)果：發(fā)生倒位；2當(dāng)重組位點(diǎn)同方向位于同一DNA分子上時，重組結(jié)果：發(fā)生切除；3當(dāng)重組位點(diǎn)位于不同DNA分子上時，重組結(jié)果：發(fā)生整合。12/22/2022104位點(diǎn)特異性重組結(jié)果小結(jié)1當(dāng)重組位點(diǎn)反方向位于同一DNA分子（三）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門菌的H抗原H1鞭毛蛋白H2鞭毛蛋白單菌落的沙門菌中經(jīng)常出現(xiàn)少數(shù)呈另一H抗原的細(xì)菌細(xì)胞（鞭毛相轉(zhuǎn)變）12/22/2022105（三）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門菌的H抗原H1鞭毛蛋白H2鞭毛蛋沙門菌的H片段倒位遺傳學(xué)分析表明，這種抗原相位改變是由一段995bp的DNA，稱為H片段發(fā)生倒位所決定的。12/22/2022106沙門菌的H片段倒位遺傳學(xué)分析表明，這種抗原相位改變是由一段1hin編碼特異的重組酶（倒位酶）hix為14bp的反向重復(fù)序列重組位點(diǎn)Promoterhin是否仍表達(dá)？H2、rH1呢？H1呢？沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變12/22/2022107hin編碼特異的重組酶hix為14bp的反向重復(fù)序列重組位點(diǎn)沙門菌的H片段倒位遺傳學(xué)分析表明，這種抗原相位改變是由一段995bp的DNA，稱為H片段發(fā)生倒位所決定的。rH1阻遏蛋白與啟動子結(jié)合阻止H1表達(dá)PH片段（995bp）PH片段（995bp）為14bp的反向重復(fù)序列hixhin編碼特異的重組酶（倒位酶）12/22/2022108沙門菌的H片段倒位遺傳學(xué)分析表明，這種抗原相位改變是由一段r沙門氏菌的H片段倒位rH1倒位后，啟動子序列與H2、rH1取向相反，H2、rH1不表達(dá),解除了對H1的抑制，H1表達(dá)PPH1鞭毛素H片段（995bp）hin是否仍表達(dá)？√12/22/2022109沙門氏菌的H片段倒位rH1倒位后，啟動子序列與H2、rH三、轉(zhuǎn)座重組(transpositionrecombination)指DNA上的核苷酸序列從一個位置轉(zhuǎn)移到另外一個位置的現(xiàn)象。發(fā)生轉(zhuǎn)位的DNA片段稱為轉(zhuǎn)座元件、可移位遺傳元件(mobilegeneticelement,MGE)、跳躍基因(jumpgene)12/22/2022110三、轉(zhuǎn)座重組(transpositionrecombina轉(zhuǎn)座元件的種類

原核生物轉(zhuǎn)座元件的種類

IS（插入序列）TnAfamilyCompositetransposonTransposablephage

復(fù)制型轉(zhuǎn)座元件(replicatingtransposableelement)

12/22/2022111轉(zhuǎn)座元件的種類復(fù)制型長度較小，一般700－2000bp之間兩端通常含有10－40bp長的IR(invertedrepeats)內(nèi)部一般只有一個基因，編碼產(chǎn)物為轉(zhuǎn)座酶缺乏抗生素或其他毒性抗性基因(一)插入序列（insertionsequence，IS）l

7002000basepair（bp）GATCGTC--------------------------GACGATCCTAGCAG---------------------------CTGCTAG●GATCGTC--------------------------GACGATC

Stem-loop

5’

GATCGTC3’CTAGCAG

12/22/2022112長度較小，一般700－2000bp之間(一)插入序列（IS的結(jié)構(gòu)一個結(jié)構(gòu)基因反向重復(fù)序列12/22/2022113IS的結(jié)構(gòu)一個結(jié)構(gòu)基因反向重復(fù)序列12/19/202248IS的轉(zhuǎn)座機(jī)制

當(dāng)IS轉(zhuǎn)座時，宿主靶部位雙鏈交錯切開，經(jīng)修復(fù)后IS兩側(cè)形成短的正向重復(fù)。12/22/2022114IS的轉(zhuǎn)座機(jī)制當(dāng)IS轉(zhuǎn)座時，宿主靶部位雙鏈交錯切開，經(jīng)修復(fù)基因的表達(dá)及其產(chǎn)物的活性?ATGTAAATGTAA12/22/2022115基因的表達(dá)ATGTAAATGTAA12/19/202250(二)轉(zhuǎn)座子(Transposon，Tn/TnpAfamily)

l兩側(cè)含有35－40bp的IRl

較長，2.5kb20kb

l內(nèi)部通常含有不止一個結(jié)構(gòu)基因：轉(zhuǎn)座酶基因、調(diào)節(jié)基因、抗生素抗性基因(resistancegene)

12/22/2022116(二)轉(zhuǎn)座子(Transposon，Tn/TnpAfal

Tn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpRStrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrRTmpR)Tn9(CamR)Tn10(TetR)多個結(jié)構(gòu)基因反向重復(fù)序列12/22/2022117l

Tn1(AmpR)(三)復(fù)合元件/復(fù)合轉(zhuǎn)座子

（compositeelement/compositetansposon）●

IS插入到一段帶有抗生素抗性基因或其它毒性抗性基因等結(jié)構(gòu)基因的兩端，形成復(fù)合轉(zhuǎn)座子。IStranspositionmutationISIS

ISLISR臂中心區(qū)臂插入結(jié)果？12/22/2022118(三)復(fù)合元件/復(fù)合轉(zhuǎn)座子●IS插入到一段帶有抗生素抗●復(fù)合轉(zhuǎn)座子一旦形成，轉(zhuǎn)座功能受較多因子調(diào)控●