高效液相色譜法5

20.1概述一、高效液相色譜的特點(diǎn)二、高效液相色譜的分類第一頁，共三十七頁。分析對象氣相色譜：氣體和沸點(diǎn)較低的化合物，占有機(jī)物總數(shù)20%高效液相色譜：高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、分子量大的物質(zhì)，占有機(jī)物總數(shù)80%流動(dòng)相氣相色譜：對組分沒有親和力的惰性氣體，對分離選擇性幾乎無影響高效液相色譜：可選用不同極性的液體；選擇余地大；對分離影響大（與組分或固定相均作用）色譜柱溫氣相色譜：一般較高高效液相色譜：通常為室溫高效液相色譜vs氣相色譜第二頁，共三十七頁。一、高效液相色譜的特點(diǎn)高壓：150-350105Pa高速：一般<1h,<1min.高效：柱效高高靈敏度：10-9g（紫外檢測器）

10-12g（熒光檢測器）成本高、環(huán)境污染、梯度洗脫操作復(fù)雜；缺少靈敏度高的通用型檢測器；復(fù)雜樣品分離，缺少總理論塔板數(shù)達(dá)數(shù)十萬的色譜柱；受壓易分解或變性的生物樣品。優(yōu)點(diǎn)：局限：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析第三頁，共三十七頁。二、高效液相色譜的分類分配色譜吸附色譜離子交換色譜尺寸排阻色譜疏水作用色譜按分離原理制備色譜柱內(nèi)徑>10mm半制備色譜柱內(nèi)徑>5-10mm分析型色譜柱內(nèi)徑<5mm按分離規(guī)模第四頁，共三十七頁。20.2高效液相色譜儀第五頁，共三十七頁。1.流程一、流程及主要部件第六頁，共三十七頁。高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)附屬系統(tǒng)2.主要部件第七頁，共三十七頁。(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa；為獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一；具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性。柱塞式往復(fù)泵第八頁，共三十七頁。(2)梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺(tái)高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第九頁，共三十七頁。(3)進(jìn)樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：第十頁，共三十七頁。(4)高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。第十一頁，共三十七頁。勻漿法裝柱示意圖第十二頁，共三十七頁。高效液相色譜填料填料的熱力學(xué)特性影響色譜柱的選擇性填料的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)或結(jié)構(gòu)特點(diǎn)影響色譜柱的效率（顆粒的大小、形狀、均勻性、比表面積；孔徑、孔體積等）?；|(zhì)無機(jī)基質(zhì)材料硅膠(silica)、氧化鋁、氧化鋯、氧化鈦、羥基磷灰石、多孔玻璃、多孔石墨碳等有機(jī)基質(zhì)材料：天然多糖凝膠（如葡聚糖系、瓊脂糖系等）高聚物樹脂（如交聯(lián)苯乙烯樹脂、交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯類樹脂等）特點(diǎn)第十三頁，共三十七頁。顆粒狀整體柱微孔---孔徑<2nm；中孔---孔徑<50nm,>2nm；大孔---孔徑>50nm使用中孔和大孔填料；微孔易造成色譜峰拖尾物理形態(tài)第十四頁，共三十七頁。(5)液相色譜檢測器溶質(zhì)性質(zhì)檢測器：對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等總體檢測器：對試樣和流動(dòng)相總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)示差折光檢測器、電導(dǎo)檢測器等分類紫外光度檢測器(ultravioletphotometricdetector)光電二極管陣列檢測器(photo-diodearraydetector)熒光檢測器(fluorescencedetector)示差折光檢測器(differentialrefractiveindexdetector)蒸發(fā)光散射檢測器（evaporativelightscatteringdetector)電導(dǎo)檢測器(electricalconductivitydetector)常用檢測器第十五頁，共三十七頁。a.紫外檢測器應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：

靈敏度高、線性范圍寬；流通池可做的很小（1mm×10mm，容積8μL）；對流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

第十六頁，共三十七頁。它與固定波長紫外檢測器的主要差別在于使用一個(gè)連續(xù)光源（如氘燈），以光柵（或棱鏡）分光。光源發(fā)出的復(fù)合光（從190nm至600nm附近），光柵分光能夠隨意選擇定的檢測波長以匹配被測物質(zhì)的最大吸收波長。第十七頁，共三十七頁。b.光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。第十八頁，共三十七頁。二極管陣列檢測器可以記錄190nm-900nm波長吸收光譜數(shù)據(jù)，可直接貯存色譜圖中每一個(gè)點(diǎn)的吸收光譜。光源發(fā)出的光，通過透鏡把光聚焦在檢測池上。從檢測池出來的光，通過透鏡、狹縫到全息光柵上，經(jīng)光柵分光后由一排光電二極管接收并轉(zhuǎn)換為電信號，貯存于計(jì)算機(jī)中。DAD的最大優(yōu)點(diǎn)在于利用ＵＶ光譜識別并進(jìn)行純度分析，還可以畫出保留時(shí)間、波長和吸光度的三維立體空間譜圖等，這是目前較先進(jìn)的紫外檢測器。第十九頁，共三十七頁。光電二極管陣列檢測器第二十頁，共三十七頁。c.示差折光檢測器除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；第二十一頁，共三十七頁。d.熒光檢測器高靈敏度、高選擇性；對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；第二十二頁，共三十七頁。20.3高效液相色譜固定相和流動(dòng)相第二十三頁，共三十七頁。一、液相色譜固定相（1）全多孔型擔(dān)體

由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；（2）表面多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；

1.液-液分配及離子對分離固定相第二十四頁，共三十七頁。（3）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—C穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣；c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N第二十五頁，共三十七頁?；瘜W(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)A、傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；B、壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；C、選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；D、有利于梯度洗脫；存在著雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；

第二十六頁，共三十七頁。2.液-固吸附分離固定相

種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；

第二十七頁，共三十七頁。3.離子交換色譜分離固定相

結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）

樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）第二十八頁，共三十七頁。4.空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶?，具有恒定孔徑和窄粒度分布。第二十九頁，共三十七頁。二、液相色譜的流動(dòng)相1.流動(dòng)相特性

（1）液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。第三十頁，共三十七頁。2.流動(dòng)相類別

按流動(dòng)相組成分：單組分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。第三十一頁，共三十七頁。3.流動(dòng)相選擇

在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑