細(xì)胞工程與干細(xì)胞課件

細(xì)胞工程與干細(xì)胞(CellEngineeringandStemCell)應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，根據(jù)人們的意愿對細(xì)胞的遺傳性狀進行定向改造，以獲得細(xì)胞產(chǎn)品、藥品或醫(yī)用生物材料的綜合技術(shù)體系。細(xì)胞工程細(xì)胞工程的分類植物細(xì)胞工程動物細(xì)胞工程微生物細(xì)胞工程細(xì)胞整體層次：如細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合等；細(xì)胞器層次：如核移植、染色體倍性或組成改變等；分子層次：如基因操作技術(shù)等。動物細(xì)胞工程所涉及的細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次第一節(jié)體外細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）指單個細(xì)胞或細(xì)胞群在體外條件下的培養(yǎng)技術(shù)，可以分為原代細(xì)胞培養(yǎng)和傳代細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞系（cellline）原代細(xì)胞經(jīng)首次傳代成功后的細(xì)胞

。細(xì)胞株（cellstrain）從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系中用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法由單細(xì)胞增殖形成具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。一、細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)1.增加培養(yǎng)容積直接向培養(yǎng)液中充氧。深層全自動氣升式培養(yǎng)缸的容量：

5升、30升、100升，1000升。（一）增加培養(yǎng)容積和細(xì)胞可附著面積細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致培養(yǎng)器中細(xì)胞死亡的主要原因。在大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，細(xì)胞凋亡／死亡多是在營養(yǎng)成分耗盡、有毒代謝產(chǎn)物增多時發(fā)生。“細(xì)胞靜止”態(tài)可以有效降低營養(yǎng)成分消耗和代謝毒物產(chǎn)生，提高目的蛋白產(chǎn)率。（二）抑制細(xì)胞的凋亡基礎(chǔ)培養(yǎng)基：

Ham’s-F12、DMEM、RPMI1640等。附加成分促生長增殖成分：轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒酸鈉、胰島素、表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、生長激素等。促貼壁附著成分：纖粘連蛋白(fibronectin)、層粘連蛋白、膠原蛋白、多聚賴氨酸等。（二）無血清培養(yǎng)基的組成一、技術(shù)路線卵細(xì)胞成熟卵母細(xì)胞(☆☆☆☆☆)（一）受體細(xì)胞的選取胚胎細(xì)胞、未分化的原始生殖細(xì)胞、胎兒細(xì)胞乃至高度分化的成年動物細(xì)胞都可以作為供核細(xì)胞。（二）供體核的獲得（三）核質(zhì)融合電融合法

重組卵需經(jīng)一定時間的體外培養(yǎng)，或放入中間受體動物輸卵管內(nèi)孵育。家兔、豬在移植入受體子宮前約需體外培養(yǎng)24h。而牛、羊一般培養(yǎng)發(fā)育至桑椹胚期或囊胚期。（四）重組卵的培養(yǎng)和植入母體二、體細(xì)胞核移植高度分化的成體動物細(xì)胞核仍具有發(fā)育的全能性。當(dāng)供體核處于S期時，受體細(xì)胞質(zhì)中高水平的MPF使染色體出現(xiàn)異常的幾率顯著升高，而當(dāng)供體核處于G1或G2期時，雖然供體核同樣會出現(xiàn)早熟凝集染色體，但對染色體沒有損害。G2－PCC

近于M期染色體，螺旋化程度低，染色淺，細(xì)長，姐妹染色單體靠得近。S－PCC

粉末狀G1－PCC

早G1期，短而粗；晚G1期，細(xì)而長。277次乳腺細(xì)胞核移植實驗；獲得29個發(fā)育為8細(xì)胞的“胚”；13頭代孕母親；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名為“多莉”。1.采用人工捕獲的方法通過限制細(xì)胞培養(yǎng)基中的某種成分，從而使大部分細(xì)胞滯留在細(xì)胞周期的某一階段。2.選擇G0、G1期細(xì)胞所占比例較高的細(xì)胞類型作供核細(xì)胞剛排出的卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞(90％以上)。（二）獲取G0或Gl期細(xì)胞的方法選擇合適的受體細(xì)胞腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞生理特性接近的細(xì)胞系要有可靠的轉(zhuǎn)化后篩選方法針對細(xì)胞抗藥性的篩選方法一、物理學(xué)方法（一）電穿孔法采用電脈沖，簡單而廣泛運用于培養(yǎng)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移，基因轉(zhuǎn)移效率最高可達(dá)10－3。（二）顯微注射法胚胎期注入目的基因，應(yīng)用范圍廣，轉(zhuǎn)基因長度可達(dá)數(shù)百kb。（三）DNA直接注射法最簡單的基因轉(zhuǎn)移方法。如能進一步提高基因轉(zhuǎn)移效率，該方法發(fā)展前景廣大。三、生物學(xué)方法該法主要指缺陷型病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。目前常用的病毒載體包括DNA病毒載體（腺病毒載體、猴腫瘤病毒載體、牛瘟病毒載體）、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(轉(zhuǎn)化細(xì)胞效率高)等。5’3’U3RU5U3RU5ψ最常用于人類的小鼠白血病病毒(Mo-MLV)外源目的基因各種克隆載體及其可插入DNA的大小克隆載體

可插入片段大小

質(zhì)粒載體

0～10Kb

λ噬菌體插入載體

0～10Kb

λ噬菌體置換載體

9～23Kb

粘粒載體

33～44Kb

P1噬菌體載體

70～100Kb

PAC載體(噬菌體人工cs)130～150Kb

BAC載體

(細(xì)菌人工cs)

300Kb

YAC載體(酵母人工cs)

0.2～2.0Mb

所有的病毒載體都會誘導(dǎo)產(chǎn)生一定程度的免疫反應(yīng)；或多或少地存在一定的安全隱患；轉(zhuǎn)導(dǎo)能力有限、不適于大規(guī)模生產(chǎn)。病毒載體的缺點：A.安全性好，不整合人染色體，不導(dǎo)致腫瘤發(fā)生；B.宿主范圍廣，對受體細(xì)胞是否處于分裂周期要求不嚴(yán)格；C.外源基因在載體上容易高效表達(dá)，病毒顆粒相對穩(wěn)定，并易于純化和濃縮，且感染力不降低；病毒載體的缺點：一、干細(xì)胞的概念干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。第四節(jié)干細(xì)胞干細(xì)胞研究成為繼人類基因組大規(guī)模測序之后最具活力、最有影響和最有應(yīng)用前景的生命學(xué)科研究領(lǐng)域，1999年干細(xì)胞研究被美國《科學(xué)》雜志評為1999年度世界十大科學(xué)之冠，2000年干細(xì)胞研究再次被《科學(xué)》雜志評為該年度世界十大科學(xué)成就之一。組織工程是以干細(xì)胞研究為基礎(chǔ)發(fā)展起來，它有望解決臨床上急需的人工組織與器官問題，進展極為迅速，已經(jīng)成為干細(xì)胞應(yīng)用的主要方向。干細(xì)胞有幾個主要特征干細(xì)胞本身不是終末分化細(xì)胞；干細(xì)胞能無限增殖分裂；干細(xì)胞可連續(xù)分裂幾代，也可在較長時間內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)；干細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞只能有兩種命運——保持為干細(xì)胞或分化為特定細(xì)胞。二、干細(xì)胞的分類按分化潛能大小來分類:全能干細(xì)胞（Totipotentstemcell）：它具有形成完整個體的分化潛能。如受精卵，胚胎干細(xì)胞。多能干細(xì)胞（pluripotentstemcell），具有分化出多種組織細(xì)胞的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個體的能力，發(fā)育潛能受到一定的限制。如骨髓多能造血干細(xì)胞是典型的例子，它可分化出至少十二種血細(xì)胞。專能干細(xì)胞（multipotentstemcell），這類干細(xì)胞只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化，如上皮組織基底層干細(xì)胞、肌肉中的成肌細(xì)胞等。根據(jù)來源來分:

來源于胚胎---胚胎干細(xì)胞

ESC

（EmbryonicStemCell）胚胎性生殖細(xì)胞EGC

（EmbryonicGermCell）來源于成體---成體組織來源的干細(xì)胞

ASC

（Adult-derivedStemCell）根據(jù)干細(xì)胞組織發(fā)生的名稱進行分類:胎胎干細(xì)胞造血干細(xì)胞骨髓間質(zhì)干細(xì)胞肌肉干細(xì)胞成骨干細(xì)胞內(nèi)胚層干細(xì)胞視網(wǎng)膜干細(xì)胞胰腺干細(xì)胞（一）胚胎干細(xì)胞當(dāng)受精卵分裂發(fā)育成囊胚時，內(nèi)層細(xì)胞團（InnerCellMass）的細(xì)胞即為胚胎干細(xì)胞(EScell)。胚胎干細(xì)胞具有全能性，可以自我更新并具有分化為體內(nèi)所有組織的能力。1.胚胎干細(xì)胞概念人類胚胎干細(xì)胞

2.胚胎干細(xì)胞的特性1）胚胎干細(xì)胞來源于胚胎早期的胚泡中的內(nèi)細(xì)胞群，保持未分化狀態(tài)，具有自我復(fù)制的能力，具有向胚胎三個胚層來源的所有細(xì)胞分化的潛能。2）胚胎干細(xì)胞可通過單細(xì)胞克隆建立有相同遺傳特性的胚胎干細(xì)胞系。建立的胚胎干細(xì)胞系有與親代細(xì)胞相同的特征

3)胚胎干細(xì)胞具有正常、完整（雙倍體）及穩(wěn)定的染色體核型。4)胚胎干細(xì)胞缺乏細(xì)胞周期中G1期的限（chechpoint），胚胎干細(xì)胞大部分時間都處于細(xì)胞周期的S期，在此期進行DNA合成。胚胎干細(xì)胞不需外源信號刺激啟動DNA的復(fù)制。

5）胚胎干細(xì)胞表達(dá)三種特異性標(biāo)志分子：細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子（intrinsictranscriptionfactor，Oct4）、白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor，LIF）和堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase，AP）。6）雌性哺乳動物來源的胚胎干細(xì)胞內(nèi)，不存在X染色體失活現(xiàn)象。7）胚胎干細(xì)胞端粒酶活性呈陽性，具有維持端粒長度，保持干細(xì)胞增殖能力的重要作用。

8）胚胎干細(xì)胞裸鼠皮下或腎包囊接種，可形成畸胎瘤。3.胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用1）基因功能的研究；2）發(fā)育機制的研究；3）藥物檢測；4）細(xì)胞替代療法和組織器官移植。（二）成體干細(xì)胞（Adultstemcell）成體干細(xì)胞是在成體組織內(nèi)具有自我更新能力并能分化產(chǎn)生一種或一種以上子代組織細(xì)胞的未成熟細(xì)胞。1.成體干細(xì)胞概念2.成體干細(xì)胞的特點數(shù)量少，難以識別，分離純化；體外培養(yǎng)時不能長時間增值；具有可塑性※（神經(jīng)干細(xì)胞－造血干細(xì)胞）；在完全分化前經(jīng)歷一個中間類型即祖細(xì)胞階段。

可塑性（plasticity）造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等成體干細(xì)胞具有一定跨系、甚至跨胚層分化的特性，稱其為干細(xì)胞的“可塑性”。造血干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞精原干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞表皮干細(xì)胞腸干細(xì)胞肝干細(xì)胞3.成體干細(xì)胞種類造血干細(xì)胞（Hematopoieticstemcell，HSCs）造血干細(xì)胞是從血液、骨髓、膠帶血來源一群原始造血細(xì)胞，能自我更新、能分化成一些具有組織特化的細(xì)胞、能從骨髓中游離出來進入血液循環(huán)、能發(fā)生程序性死亡的細(xì)胞。三個部位生產(chǎn)/儲存造血干細(xì)胞大部分在骨髓里，即骨髓造血干細(xì)胞。在外周血液中，即血管中有少量造血干細(xì)胞。在臍帶里有豐富的造血干細(xì)胞骨髓：1/400外周血：1/10000臍帶血：1/10004.造血干細(xì)胞應(yīng)用造血干細(xì)胞移植可以治療多種血液病、實體瘤、免疫缺陷和重度急性放射病，這已被多人所熟悉?；蛑委煟涸煅杉?xì)胞以自我復(fù)制和分化潛能的特點，成為基因治療最理想的靶細(xì)胞之一?？茖W(xué)家們在對造血干細(xì)胞的研究中還取得了許多新進展并發(fā)現(xiàn)許多新功能，研究結(jié)果表明造血干細(xì)胞具有可塑性，可以轉(zhuǎn)變?yōu)檠?、肝臟、脂肪、神經(jīng)、肌肉等組織細(xì)胞，并深入探討了造血干細(xì)胞治療冠心病、神經(jīng)損傷、血管閉塞性疾病等方面的新應(yīng)用。細(xì)胞工程小結(jié)細(xì)胞工程的概念及分類細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)無血清培養(yǎng)細(xì)胞核移植技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)物理學(xué)方法化學(xué)方法生物學(xué)方法干細(xì)胞干細(xì)