最新基因治療gene-therapy課件

基因治療（genetherapy）基因治療（genetherapy）1主要講授內(nèi)容：一概述二基因治療分類三基因治療的總體策略四基因治療的基本程序五基因治療應(yīng)用（心血管疾病）六展望主要講授內(nèi)容：2最新基因治療(gene-therapy課件3最新基因治療(gene-therapy課件4最新基因治療(gene-therapy課件5最新基因治療(gene-therapy課件6最新基因治療(gene-therapy課件7最新基因治療(gene-therapy課件8

間接法是指先將合適的靶細(xì)胞從體內(nèi)取出，在體外擴(kuò)增，并將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)使其高效表達(dá)，然后將這種基因修飾過的靶細(xì)胞回輸病人體內(nèi)，使外源基因在體內(nèi)表達(dá)，從而達(dá)到治療目的。間接法是指先將合適的靶細(xì)胞從體內(nèi)取出，在體外擴(kuò)增，并9體內(nèi)法是將外源基因直接或通過基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)導(dǎo)入體內(nèi)相關(guān)組織細(xì)胞，并在其中表達(dá)。導(dǎo)入體內(nèi)之后必須進(jìn)入靶細(xì)胞，有效表達(dá)并達(dá)到治療目的。

體內(nèi)法是將外源基因直接或通過基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)導(dǎo)入體內(nèi)相關(guān)10三基因治療的總體策略

基因治療是通過在適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞中有效表達(dá)重組目的基因片段而實現(xiàn)的。目前設(shè)計基因治療策略的總體原則是：三基因治療的總體策略

基因治療是通過在適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞111.直接補(bǔ)替缺陷的基因；

2.抑制非正常的基因產(chǎn)物表達(dá)；

3.以間接方式調(diào)節(jié)機(jī)體本身免疫系

統(tǒng)的抗病功能；

4.利用外源基因?qū)Σ∽兗?xì)胞造成特

異性殺傷。

1.直接補(bǔ)替缺陷的基因；

2.抑制非正常的基因產(chǎn)物表達(dá)；

3121.基因替代和基因矯正治療

基因替代是指正?；蛟惶娲毕莼颍ɑ蜃儺惢颍；虺C正是指將致病基因的異常堿基序列進(jìn)行糾正，而正常序列部分予以保留。1.基因替代和基因矯正治療

基因替代是指正常132.代償性基因治療通過對有代償功能的基因的正調(diào)控，開啟其關(guān)閉狀態(tài)來代償功能異常的基因。例如，以某些作用劑提高珠蛋白基因的表達(dá)以治療?地中海貧血。2.代償性基因治療143.基因補(bǔ)償性治療基因補(bǔ)償性治療指將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞，不去除異?；?，而是通過目的基因的非定點整合，使其表達(dá)產(chǎn)物補(bǔ)償缺陷基因的功能或使原有的功能得以加強(qiáng)。目前基因治療多采用此種策略。3.基因補(bǔ)償性治療154.基因失活性治療基因失活性早期一般指反義核酸技術(shù)。它將特定的反義核酸，包括反義RNA、反義DNA和核酶導(dǎo)入細(xì)胞，在翻譯和轉(zhuǎn)錄水平阻止某些基因的異常表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。RNAi、肽核酸、基因敲除。4.基因失活性治療165.調(diào)控性基因治療

通過導(dǎo)入編碼調(diào)控蛋白的基因以治療基因表達(dá)異常的疾病。如：以野生型P53基因治療肺癌或急性白血病。5.調(diào)控性基因治療

通過導(dǎo)入編碼調(diào)控蛋白的基因以治176.應(yīng)用“自殺基因”的基因治療

也稱活化前體藥物性基因治療。某些病毒或細(xì)菌產(chǎn)生的酶能將對人體無毒或低毒的藥物前體，在人體細(xì)胞內(nèi)一系列酶的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性物質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。6.應(yīng)用“自殺基因”的基因治療

也稱活化前體藥物性基因187.免疫修飾性基因治療

免疫修飾性基因治療即導(dǎo)入能使機(jī)體產(chǎn)生抗病毒或抗腫瘤免疫力的基因以達(dá)到治療目的。例如：B7共刺激分子基因及各種淋巴細(xì)胞因子基因的導(dǎo)入和表達(dá)，直接注入抗原基因等。7.免疫修飾性基因治療

免疫修飾性基因治療即導(dǎo)入能198.化療保護(hù)性基因治療

向正常細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入單相或多相細(xì)胞毒性藥物的抗性基因，使得正常細(xì)胞耐受化療藥物的能力大大提高。如：導(dǎo)入多藥耐藥基因（MDR），可使正常細(xì)胞獲得廣泛的化療藥物耐受性。8.化療保護(hù)性基因治療209.特異性細(xì)胞殺傷性基因治療

利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建以特異性殺傷靶細(xì)胞為目標(biāo)的導(dǎo)彈。具有導(dǎo)向性和殺傷性。9.特異性細(xì)胞殺傷性基因治療

利用DNA重組技術(shù)構(gòu)21

四.基因治療的基本程序

（一）獲得目的基因

要進(jìn)行基因治療，必須首先獲得目的基因并對其表達(dá)調(diào)控進(jìn)行詳細(xì)研究。目的基因來源有多種，主要包括：含目的基因的供體細(xì)胞的基因組DNA分離、預(yù)先分離克隆的基因、PCR擴(kuò)增的基因及人工合成的基因。四.基因治療的基本程序

（一）獲得目的基因

要進(jìn)22（二）靶細(xì)胞的選擇

已被應(yīng)用的靶細(xì)胞有淋巴細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞。（二）靶細(xì)胞的選擇

已被應(yīng)用的靶細(xì)胞有淋巴細(xì)胞、造血231.發(fā)病器官及位置。

可以選擇病變本身器官的細(xì)胞，也可以選擇病變器官以外的細(xì)胞來作為基因治療的靶細(xì)胞。例如：在肝臟病的基因治療中，可以選擇肝細(xì)胞作為基因治療的靶細(xì)胞；在腫瘤基因治療中，可選擇腫瘤組織侵潤的淋巴細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞本身。1.發(fā)病器官及位置。

可以選擇病變本身器官的細(xì)胞，也242.靶細(xì)胞應(yīng)容易取出和移植

基因治療常規(guī)途徑：將靶細(xì)胞從體內(nèi)取出，經(jīng)基因轉(zhuǎn)化后再移植回人體內(nèi)。這就要求靶細(xì)胞容易從體內(nèi)取出和植回人體。最容易取出和移植的細(xì)胞當(dāng)屬血液系統(tǒng)的細(xì)胞。2.靶細(xì)胞應(yīng)容易取出和移植

基因治療常規(guī)途徑：將靶253.靶細(xì)胞容易在體外培養(yǎng)

4.靶細(xì)胞容易實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化

將目的基因轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞的手段主要有物理、化學(xué)、融合及病毒載體四大類。

3.靶細(xì)胞容易在體外培養(yǎng)

4.靶細(xì)胞容易實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化

265.靶細(xì)胞應(yīng)有較長的壽命

基因治療、特別是某些單基因遺傳缺陷性疾病的基因治療，最終目標(biāo)是要求外源基因長期、穩(wěn)定的表達(dá)，直至終生。

5.靶細(xì)胞應(yīng)有較長的壽命

基因治療、特別是某些單基27（三）基因載體和基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)目前使用的基因載體有病毒載體和非病毒載體。1.非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移物理方法顯微注射法電穿孔法直接注射法和微粒子轟擊法

（三）基因載體和基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)28

化學(xué)方法DNA-磷酸鈣共沉淀法多聚陽離子-DNA復(fù)合物法脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物法融合法：通過原生質(zhì)球相互融合的方法，將目的基因?qū)氚屑?xì)胞。化學(xué)方法292.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移

該類方法是以病毒為載體，將目的基因?qū)氚屑?xì)胞或器官，并使之表達(dá)。一般在基因轉(zhuǎn)移中，所使用的病毒載體都是經(jīng)過改建的有復(fù)制缺陷的病毒。2.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移

該類方法是以病毒為載體，將目30這些病毒缺失了其自身復(fù)制所必需的一些基因，然后將治療基因、一些基因的調(diào)控成分（如啟動子和增強(qiáng)子）以及polyA信號等插入，使之成為表達(dá)性載體。目前在基因轉(zhuǎn)移中所使用的病毒載體有以下幾種。這些病毒缺失了其自身復(fù)制所必需的一些基因，然后將治療311.逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus,RV）RV是目前基因轉(zhuǎn)移中應(yīng)用最為廣泛的一類病毒。是一類RNA病毒。由于缺失了自身包裝所必需的蛋白（結(jié)構(gòu)蛋白gap，多聚酶pol，包膜糖蛋白env）基因，因此其復(fù)制需依賴輔助細(xì)胞系。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染效率高，理論上可高達(dá)100%。1.逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus,RV）32轉(zhuǎn)染后，前病毒基因組（經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后形成的DNA）可與靶細(xì)胞基因組隨機(jī)組合，因而能穩(wěn)定的表達(dá)外源基因。缺點：1）只能轉(zhuǎn)染處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞；2）攜帶的外源基因不能太大（8-10Kb）；轉(zhuǎn)染后，前病毒基因組（經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后形成的DNA）可與靶細(xì)胞基因333）逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染依賴于靶細(xì)胞表面適宜受體存在，限制了它的應(yīng)用，尤其是體內(nèi)基因治療的應(yīng)用；4）理論上講，從包裝細(xì)胞釋放出的復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒只有一次性感染靶細(xì)胞，但在某種情況下也會造成野生型病毒的爆發(fā)。3）逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染依賴于靶細(xì)胞表面適宜受體存在，限制了它的345）由于病毒基因組是隨機(jī)整合到靶細(xì)胞基因組的，因而具有致細(xì)胞癌變的可能；6）逆轉(zhuǎn)錄病毒不能耐受純化和濃縮等處理過程，否則會使其感染活性大大下降。5）由于病毒基因組是隨機(jī)整合到靶細(xì)胞基因組的，因而具有致細(xì)胞35逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建外源基因插入病毒基因組有兩種方式，一種是直接將外源基因插入到病毒基因中；另一種是以外源基因取代病毒的必需結(jié)構(gòu)基因。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建36

在復(fù)制缺陷型病毒中，外源目的基因的插入使病毒基因滅火或以目的基因取代病毒的必需基因，使產(chǎn)生的重組前病毒不能表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白，因此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA不能被包裝產(chǎn)生子代重組病毒，在復(fù)制缺陷型病毒中，外源目的基因的插入使病毒基因37必須借助輔助病毒的共感染或通過包裝細(xì)胞提供病毒復(fù)制所必需的反式作用蛋白，然后才能包裝產(chǎn)生子代重組病毒。這樣獲得的子代重組病毒僅僅具有一次感染性，避免了產(chǎn)生繼發(fā)擴(kuò)散感染的危險。必須借助輔助病毒的共感染或通過包裝細(xì)胞提供病毒復(fù)制所必需的反38包裝細(xì)胞（pakagingcell）包裝細(xì)胞是通過基因工程技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其產(chǎn)生病毒結(jié)構(gòu)基因gag、pol、env所編碼的蛋白，為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝成為重組病毒提供全面的病毒蛋白，同時，該包裝細(xì)胞并不能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生編碼完整病毒的基因組RNA，一句話，包裝細(xì)胞本身不能產(chǎn)生任何形式的病毒顆粒。包裝細(xì)胞（pakagingcell）39逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的一般過程：1）目的基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上；2）帶有目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過物理方法如磷酸鈣介導(dǎo)或電穿孔法導(dǎo)入已選定的包裝細(xì)胞；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的一般過程：40

3）根據(jù)載體所提供的篩選標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞；4）選擇具有高滴度重組病毒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，分離重組病毒；5）重組病毒感染靶細(xì)胞，采用兩種方式，一種是以無細(xì)胞帶病毒上清和靶細(xì)胞一起溫育；另一種以產(chǎn)病毒的包裝細(xì)胞經(jīng)射線照射致死后作為飼養(yǎng)細(xì)胞，被靶細(xì)胞在其上面培養(yǎng)達(dá)到目的。3）根據(jù)載體所提供的篩選標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞；4）選擇具41

6）如采用體外感染，則將感染的細(xì)胞回輸體內(nèi)，分析治療基因的表達(dá)及治療效果；7）病毒感染的質(zhì)量控制，在基因轉(zhuǎn)移過程中要進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。6）如采用體外感染，則將感染的細(xì)胞回輸體內(nèi)，分析治療基因的42基因轉(zhuǎn)移的方法和途徑逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的方法主要有invivo和exvivo兩種?；蛑委煹脑缙诙嗖捎秒x體方案。離體方案基因轉(zhuǎn)移效率高，具有明確的基因轉(zhuǎn)移，但必須進(jìn)行宿主細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)，而大多數(shù)人體組織細(xì)胞，原代培養(yǎng)比較困難?；蜣D(zhuǎn)移的方法和途徑43

近年來，更多采用體內(nèi)方案。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒直接注射的途徑主要有：1）采用靜脈注射等途徑，將重組病毒直接注射到機(jī)體內(nèi)，通過重組病毒的感染作用實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移；2）直接將產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細(xì)胞注射到組織或腫瘤中，由包裝細(xì)胞釋放再感染靶細(xì)胞；近年來，更多采用體內(nèi)方案。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒直接44

3）直接將表達(dá)載體，可以是非病毒性表達(dá)質(zhì)粒，注射到人體內(nèi)，如將HIV-1病毒載體注射到肌肉內(nèi)，使其表達(dá)相應(yīng)的env基因蛋白，引起相應(yīng)的細(xì)胞免疫。3）直接將表達(dá)載體，可以是非病毒性表達(dá)質(zhì)粒，注射到人體45最新基因治療(gene-therapy課件462.腺病毒（adenovirus,AV）AV是一些大的（約38kb）雙鏈DNA。目前作為基因治療中所用的AV載體通常是一些復(fù)制缺陷病毒，其基因缺失位于基因組的E1A-E1B或E3區(qū)。

2.腺病毒（adenovirus,AV）47

AV既能感染增殖期細(xì)胞，也能感染靜止期細(xì)胞。這類病毒比較穩(wěn)定，且濃縮和純化對其感染活性影響不大。其不足之處為：1）病毒基因組一般不與靶細(xì)胞基因組整合，因而其表達(dá)外源基因是暫時的和不穩(wěn)定的；AV既能感染增殖期細(xì)胞，也能感染靜止期48

2）在AV的生活周期中，有許多不同生物學(xué)活性的蛋白暫時表達(dá)，其中也包括一些與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的蛋白；3）感染細(xì)胞內(nèi)大量病毒蛋白的表達(dá)，可導(dǎo)致機(jī)體對受染細(xì)胞的強(qiáng)烈免疫應(yīng)答。這一毒副作用在體內(nèi)基因治療是必須引起足夠的重視。2）在AV的生活周期中，有許多不同生物學(xué)活性的蛋白暫時49

目前有報道利用Cre——loxp重組構(gòu)建“無內(nèi)臟（gutless）”AV載體可望解決AV的免疫原性問題；4）AV幾乎可以感染所有細(xì)胞，缺乏特異性?；蛟S可以通過使用組織特異性啟動子來克服這一問題。目前有報道利用Cre——loxp重組構(gòu)建“無503.腺相關(guān)病毒（adeno-associatedvirus,AAV）:AAV屬于微小病毒家族成員，是一類小的單鏈DNA病毒（基因組約4.7kb），非常穩(wěn)定。本身無致病性，需輔助病毒（常為AV）存在時才能復(fù)制。AAV可感染人的細(xì)胞，并能整合至非分裂相細(xì)胞。3.腺相關(guān)病毒（adeno-associatedvirus51

大部分AAV基因組可去除，從而可使外源基因得以大量補(bǔ)足。AAV可以整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組，但不如RV的整合效率高。有趣的是，在感染細(xì)胞中，野生型AAV基因組可高效定點整合于人類第19號染色體長臂的特定位置上，這種整合可導(dǎo)致染色體基因重排，大部分AAV基因組可去除，從而可使外源52

而這種重排與慢性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)。然而攜帶治療性基因的AAV載體似乎不象它的野生型親本，沒有定點整合于19號染色體的相同特征。因此從安全的角度來考慮，這種AAV的定點整合有多大優(yōu)越性，尚值得進(jìn)一步探討。而這種重排與慢性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)。然而攜帶治療性534.單純皰疹病毒（herpessimplexvirus,HSV）:HSV是一些雙鏈DNA病毒（基因組約150kb），具有嗜神經(jīng)細(xì)胞的特性，能在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)形成“終生隱性感染”。將外源基因?qū)氩⑹怪L久存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)是該類病毒載體的一大特點。4.單純皰疹病毒（herpessimplexvirus,54

如果能夠選擇性地調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)，而不誘導(dǎo)病毒基因的表達(dá)，這將對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療大有幫助。HSV的缺點：1）僅能感染分裂細(xì)胞，從而使之在成人腦組織中的應(yīng)用受到限制。2）這類病毒（包括無復(fù)制能力的病毒）對靶細(xì)胞具有毒害作用，需慎重。如果能夠選擇性地調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)，而不誘55（四）外源基因表達(dá)的檢測

需用載體中的標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行篩選。在較多的表達(dá)載體中都有neor標(biāo)記基因的存在，若向培養(yǎng)基中加入藥物G418，未被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則因不存在neor標(biāo)記基因而不能存活。（四）外源基因表達(dá)的檢測

需用載體中的標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)56（五）回輸體內(nèi)

將治療性基因修飾的靶細(xì)胞以不同的方式回輸體內(nèi)以發(fā)揮治療效果。如淋巴細(xì)胞可以靜脈回輸入血；造血細(xì)胞可采用自體骨髓移植的方法；皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)膠原包裹后埋入皮下組織中。（五）回輸體內(nèi)

將治療性基因修飾的靶細(xì)胞以不同的方式57四心血管病的基因治療近二十年來，由于心血管病發(fā)病的分子機(jī)制和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的發(fā)展，使心腦血管病的基因治療亦取得了十分可喜的成就。1993年Wilson應(yīng)用LDLR基因治療家族性高膽固醇血癥。四心血管病的基因治療58

1996年Isner應(yīng)用血管內(nèi)皮生長因子基因治療梗塞性血管病，都已在臨床應(yīng)用，并獲得了成功。盡管在人類已實施的近400個臨床基因治療方案中，心血管病只占5%左右，但其成功率卻是最高的。1996年Isner應(yīng)用血管內(nèi)皮生長59

心腦血管病的基因治療有三個最基本的條件：1治療基因的選擇，這取決于心腦血管病發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制的研究；2）體內(nèi)基因運載系統(tǒng)，這是目前心腦血管病基因治療主要的限速因素；3）治療基因在體內(nèi)的表達(dá)與調(diào)控，這是目前心腦血管病基因治療研究中最薄弱的環(huán)節(jié)。心腦血管病的基因治療有三個最基本的條60心血管病基因治療的一些特點心腦血管病主要包括單基因遺傳病和多基因的心血管病兩大類。前者發(fā)病率較低，主要有家族性高膽固醇血癥，遺傳性擴(kuò)張性心肌病，肥厚性心肌病，長Q-T綜合征，遺傳性心肌營養(yǎng)不良等。這些疾病多因基因突變和缺陷所引起，心血管病基因治療的一些特點61

其致病基因大部分已經(jīng)克隆出來?；蛑委熕x擇。外源基因需在體內(nèi)長期，穩(wěn)定表達(dá)才能有效。后者，發(fā)病率很高，主要有高血壓，動脈粥樣硬化，心肌肥厚，心功能不全，再狹窄等。這些疾病多是環(huán)境因素和遺傳因素相互作用所引起。其致病基因大部分已經(jīng)克隆出來。基因治62

心血管病與腫瘤，傳染病等不同，其發(fā)病過程較長，在發(fā)病的過程中存在一系列致病和抗病因素漫長的相互拮抗和調(diào)整的過程，是一系列網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)失衡的結(jié)果。對于絕大多數(shù)的心腦血管病基因治療的目的是促進(jìn)自身的保護(hù)機(jī)制，阻斷疾病發(fā)展過程中的惡性循環(huán)。心血管病與腫瘤，傳染病等不同，63

因此，對于絕大多數(shù)常見的心腦血管病的基因轉(zhuǎn)移，不一定需要整合到染色體中，長期而終生表達(dá)，常常瞬間，有限的表達(dá)，阻斷疾病的惡性循環(huán)即可達(dá)到治療的目的。因此，對于絕大多數(shù)常見的心腦血管病的基64心血管系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移心血管系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移可分為間接細(xì)胞轉(zhuǎn)移和直接基因轉(zhuǎn)移兩大類。1.基因縫線：基因縫線是一種裸DNA直接注射至體內(nèi)的轉(zhuǎn)移方法現(xiàn)在證明用裸DNA進(jìn)行肌肉、血管和心肌直接注射，都可以實現(xiàn)局部組織的基因轉(zhuǎn)移，并表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)。心血管系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移65

基因縫線是將裸DNA通過多聚賴氨酸或魚精蛋白直接黏附在手術(shù)縫合線上，進(jìn)行肌肉、血管和心肌縫合。這種方法可以避免直接注射裸DNA后的流失，使其長期滯留在局部組織，發(fā)揮持續(xù)轉(zhuǎn)基因作用?；蚩p線是將裸DNA通過多聚賴氨酸或魚精662.基因球囊和支架基因球囊和支架是將外源基因通過多聚賴氨酸或魚精蛋白，固定在動脈導(dǎo)管球囊或支架的表面，通過動脈導(dǎo)管送入血管局部，固定球囊和支架，令球囊加壓和充氣，使其緊貼在血管表面或?qū)⒅Ъ苤踩胙鼙趦?nèi)。2.基因球囊和支架673.血管外膜的基因轉(zhuǎn)移應(yīng)用多聚凝膠（生物膠）與外源基因混合，形成基因膠或基因微球，注射在血管周圍或組織內(nèi)，亦可延長基因轉(zhuǎn)移時間，提高轉(zhuǎn)基因效率。3.血管外膜的基因轉(zhuǎn)移684.陽離子脂質(zhì)體脂質(zhì)體是一種人工的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，可以通過與細(xì)胞膜的融合或受體介導(dǎo)的細(xì)胞吞飲，將外源DNA送入細(xì)胞內(nèi)。4.陽離子脂質(zhì)體695.受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移在心血管細(xì)胞表面存在許多特異性的受體，當(dāng)配體DNA復(fù)合物與受體結(jié)合后，可以通過受體的內(nèi)趨化和胞飲作用，將外源基因特異性轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞內(nèi)。5.受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移706.病毒脂質(zhì)體病毒脂質(zhì)體是將滅活的病毒或病毒的包被蛋白的片段鑲嵌在陽離子脂質(zhì)體的雙層脂質(zhì)層中所構(gòu)建的一種基因載體。這種載體不含病毒的基因，僅僅利用病毒中負(fù)責(zé)感染細(xì)胞的蛋白片段。6.病毒脂質(zhì)體717.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和腺相關(guān)病毒。(一)遺傳性心血管病的基因治療家族性高膽固醇血癥的基因治療1993年美國費城醫(yī)學(xué)中心Grossman應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶LDLR基因，治療5例家族性高膽固醇血癥的病人，取得成功。7.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移72

他們首先從病人體內(nèi)取出2/3的肝臟，分離出肝細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，再應(yīng)用重組LDLR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的肝細(xì)胞，經(jīng)篩選和大量培養(yǎng)，最后通過門靜脈回輸?shù)礁闻K。證明其外源性野生型LDLR可以在肝臟長期表達(dá)，血漿LDL的水平明顯降低，可以明顯延長患者存活期。他們首先從病人體內(nèi)取出2/3的肝臟73

這種方法技術(shù)復(fù)雜，費用高，可引起肝炎等免疫反應(yīng)，難以普及和推廣。1996年他們應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)極低密度脂蛋白受體基因（VLDLR）的，直接注入肝臟，證明亦可以治療實驗性高膽固醇血癥，但表達(dá)時間較反轉(zhuǎn)錄病毒載體短，但操作簡便。這種方法技術(shù)復(fù)雜，費用高，可引起肝炎74

北醫(yī)心血管研究所最近用AV脂質(zhì)體攜帶LDLR基因，直接從門靜脈注入，證明LDLR基因可以在肝細(xì)胞中高度表達(dá)，并可降低血中LDL和甘油三酯的水平，且無明顯毒副作用，但持續(xù)時間短，一次注射作用只可持續(xù)2-3周。北醫(yī)心血管研究所最近用AV脂質(zhì)體攜75（二）復(fù)雜性心血管病的基因治療除了單基因遺傳性心腦血管病以外，絕大多數(shù)的心腦血管病都是多基因復(fù)雜的心腦血管病。主要包括高血壓，高脂血癥和動脈粥樣硬化，血栓癥，心功能不全，再狹窄，梗塞性血管病等等。（二）復(fù)雜性心血管病的基因治療76

人們對這些疾病雖然進(jìn)行了大量，長期的研究，但至今還未找到這些疾病發(fā)病的主要致病基因。絕大多數(shù)心血管疾病不一定都是基因結(jié)構(gòu)的缺陷——突變、缺失、重排和移位，而主要表現(xiàn)為基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)和調(diào)控的失衡。因此，利用這些候選和調(diào)控基因，補(bǔ)充和促進(jìn)某些基因的表達(dá)，阻遏某些基因的功能，亦可達(dá)到防治疾病的目的。人們對這些疾病雖然進(jìn)行了大量，長期的研究771梗塞性血管病的基因治療梗塞性血管病包括外周梗塞性血管病、冠狀動脈梗塞、腦梗塞和再狹窄等。血管內(nèi)血栓形成，血管內(nèi)膜增生、高脂血癥、動脈粥樣硬化、糖尿病等都可以引起血管的阻塞，引起器官、組織的缺血、損傷和猝死。1梗塞性血管病的基因治療78

目前主要針對不同原因和梗塞的程度采用容栓和介入療法。嚴(yán)重的梗塞必須進(jìn)行血管外科手術(shù)-搭橋術(shù)（bypass）。但這種方法，不僅手術(shù)復(fù)雜，費用昂貴，難以推廣，而且有一定的危險。目前主要針對不同原因和梗塞的程度采用容栓和79

1995年Isner最先應(yīng)用VEGF基因治療實驗性外周梗塞性血管病，證明給兔肌肉內(nèi)注射裸VEGF質(zhì)粒，可以在肌肉局部表達(dá)，并可促進(jìn)血管新生和側(cè)枝循環(huán)的建立。1997年在美國經(jīng)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用VEGF基因在臨床治療外周梗塞性血管病，并取得了明顯效果：6例嚴(yán)重下肢缺血的患者，肌肉注射2-4mgVEGF質(zhì)粒DNA，每四周重復(fù)一次，共二次，在6個病人7條患肢均觀察到明顯的效果。1995年Isner最先應(yīng)用VEGF基因80

除VEGF基因外，應(yīng)用ｂＦＧＦ和血管生成素－１基因可以治療梗塞性血管病。近年Ｓｈｙｕ等將裸血管生成素－１的質(zhì)粒，直接注射入家兔肌肉，證明它可促進(jìn)新生血管的生成和側(cè)枝循環(huán)的建立，治療實驗性梗塞性血管病。除VEGF基因外，應(yīng)用ｂＦＧＦ和血管生成素－１基因可以812.高脂血癥和動脈粥樣硬化的基因治療高脂血癥是動脈粥樣硬化最主要的致病因素，它是由于脂代謝障礙所引起。包括一系列載脂蛋白、脂蛋白脂肪酶、ＣＥＴＰ、ＬＣＡＴ、ＬＤＬ和ＳＲ等。這些蛋白質(zhì)基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和功能異?？梢鹧獫{致動脈粥樣硬化的ＬＤＬ水平升高和抗動脈粥樣硬化的ＨＤＬ水平降低。2.高脂血癥和動脈粥樣硬化的基因治療821.LDL受體和清道夫受體的基因家族性高膽固醇血癥主要是因為LDLR基因突變和缺失所引起的，因此，應(yīng)用exvivo的方法，在肝臟內(nèi)輸入LDLR基因修飾的肝細(xì)胞，可以有效治療家族性高膽固醇血癥。應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)VLDLR基因亦同樣有效。1.LDL受體和清道夫受體的基因831）清道夫受體（SR-B）在肝臟HDL的清除中起重要作用。剔除SR-B1基因的小鼠血漿HDL水平可升高兩倍，相反在肝臟應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)SR-B1基因，可使血漿HDL完全消失。有人提議應(yīng)用反義SR-B1，升高血漿HDL水平，治療動脈粥樣硬化。1）清道夫受體（SR-B）在肝臟HDL的842）APOA-1基因載脂蛋白A1是HDL的主要載脂蛋白，它參與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)移，促使細(xì)胞內(nèi)膽固醇的清除。最近，F(xiàn)an等構(gòu)建含有APOA-1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行肌肉內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，證明它可以在成肌母細(xì)胞和肌細(xì)胞中表達(dá)，升高血漿中HDL水平，若同時轉(zhuǎn)移LCAT基因，效果更明顯。2）APOA-1基因載脂蛋白A1是HDL853）OB基因肥胖和糖尿病亦是高脂血癥和動脈粥樣硬化的一個危險因素。OB基因缺陷和表達(dá)不足是引起肥胖的一個重要原因。用缺陷型腺病毒介導(dǎo)Leptin基因，給食餌性肥胖小鼠和遺傳肥胖小鼠注射可使血漿Leptin水平增加，進(jìn)食減少，體重降低，體脂丟失，血清胰島素和糖能量恢復(fù)正常。3）OB基因86肌肉內(nèi)注射腺病毒介導(dǎo)的Leptin基因，也有同樣作用。應(yīng)用Leptin基因可以治療肥胖癥和高脂血癥。目前美國FDA已批準(zhǔn)進(jìn)行臨床試驗。肌肉內(nèi)注射腺病毒介導(dǎo)的Leptin基因，也有同樣作用。應(yīng)87

動脈粥樣硬化的發(fā)生，不僅與脂代謝有關(guān)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，血栓形成，局部過氧化和炎癥反應(yīng)亦是動脈粥樣硬化發(fā)病的重要因素，因此抗平滑肌細(xì)胞增殖，抗血栓形成，抗炎癥反應(yīng)，抗氧化的基因亦可作為動脈粥樣硬化的靶基因。動脈粥樣硬化的發(fā)生，不僅與脂代謝有88六基因治療的展望

基因治療要取得突破，必須解決幾個問題：基因?qū)胂到y(tǒng)；基因表達(dá)的可控性及更多更好的治療基因。1高效的、靶向性基因?qū)胂到y(tǒng)基因治療的關(guān)鍵中的首要問題是能將治療基因輸送到并進(jìn)入特定靶細(xì)胞，從而要能在該細(xì)胞中得到高效表達(dá)。六基因治療的展望892.外源基因表達(dá)的可控性最理想的可控性是模擬人體內(nèi)基因本身的調(diào)控模式。這是今后長期追求的目標(biāo)。是需要全基因或包括上下游的調(diào)控區(qū)及內(nèi)含子。從近期來說，可以期待實現(xiàn)的是在cDNA水平加上部分內(nèi)含子及調(diào)控元件，應(yīng)用誘導(dǎo)的形式達(dá)到一定程度的可控性，這樣部分基因，導(dǎo)入體內(nèi)后，可通過誘導(dǎo)來控制表達(dá)。2.外源基因表達(dá)的可控性903.治療基因過少目前在已用于臨床實驗的治療基因僅集中于少數(shù)基因。尤其是，對大多數(shù)多基因疾病，如腫瘤、高血壓、糖尿病、冠心病、神經(jīng)退行性疾病的致病基因還有待闡明。這將有賴于人基因組計劃，尤其是功能基因組學(xué)的發(fā)展。這不僅限于這些致病基因的發(fā)現(xiàn)，同時也包括已知和目前尚未知功能基因的表達(dá)調(diào)控序列的確定，以及其相互作用規(guī)律的闡明。3.治療基因過少914.安全性問題5.外源基因不能在體內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)的問題6.基因治療的復(fù)雜性問題7.基因治療中靶細(xì)胞生物學(xué)特性改變的問題8.論理學(xué)方面的問題。4.安全性問題92

基因治療的歷史雖短，但所取得的成績巨大。業(yè)已顯示出令人鼓舞的應(yīng)用前景。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，人類后基因組計劃的不斷實施，對疾病復(fù)雜的分子機(jī)制有了清楚的認(rèn)識，基因治療將成為人類征服多種疾病的重要手段?；蛑委煹臍v史雖短，但所取得的成績巨93Thankyou!Thankyou!94

結(jié)束語謝謝大家聆聽?。?！95

結(jié)束語謝謝大家聆聽！?。?5基因治療（genetherapy）基因治療（genetherapy）96主要講授內(nèi)容：一概述二基因治療分類三基因治療的總體策略四基因治療的基本程序五基因治療應(yīng)用（心血管疾?。┝雇饕v授內(nèi)容：97最新基因治療(gene-therapy課件98最新基因治療(gene-therapy課件99最新基因治療(gene-therapy課件100最新基因治療(gene-therapy課件101最新基因治療(gene-therapy課件102最新基因治療(gene-therapy課件103

間接法是指先將合適的靶細(xì)胞從體內(nèi)取出，在體外擴(kuò)增，并將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)使其高效表達(dá)，然后將這種基因修飾過的靶細(xì)胞回輸病人體內(nèi)，使外源基因在體內(nèi)表達(dá)，從而達(dá)到治療目的。間接法是指先將合適的靶細(xì)胞從體內(nèi)取出，在體外擴(kuò)增，并104體內(nèi)法是將外源基因直接或通過基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)導(dǎo)入體內(nèi)相關(guān)組織細(xì)胞，并在其中表達(dá)。導(dǎo)入體內(nèi)之后必須進(jìn)入靶細(xì)胞，有效表達(dá)并達(dá)到治療目的。

體內(nèi)法是將外源基因直接或通過基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)導(dǎo)入體內(nèi)相關(guān)105三基因治療的總體策略

基因治療是通過在適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞中有效表達(dá)重組目的基因片段而實現(xiàn)的。目前設(shè)計基因治療策略的總體原則是：三基因治療的總體策略

基因治療是通過在適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞1061.直接補(bǔ)替缺陷的基因；

2.抑制非正常的基因產(chǎn)物表達(dá)；

3.以間接方式調(diào)節(jié)機(jī)體本身免疫系

統(tǒng)的抗病功能；

4.利用外源基因?qū)Σ∽兗?xì)胞造成特

異性殺傷。

1.直接補(bǔ)替缺陷的基因；

2.抑制非正常的基因產(chǎn)物表達(dá)；

31071.基因替代和基因矯正治療

基因替代是指正?；蛟惶娲毕莼颍ɑ蜃儺惢颍??；虺C正是指將致病基因的異常堿基序列進(jìn)行糾正，而正常序列部分予以保留。1.基因替代和基因矯正治療

基因替代是指正常1082.代償性基因治療通過對有代償功能的基因的正調(diào)控，開啟其關(guān)閉狀態(tài)來代償功能異常的基因。例如，以某些作用劑提高珠蛋白基因的表達(dá)以治療?地中海貧血。2.代償性基因治療1093.基因補(bǔ)償性治療基因補(bǔ)償性治療指將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞，不去除異?；颍峭ㄟ^目的基因的非定點整合，使其表達(dá)產(chǎn)物補(bǔ)償缺陷基因的功能或使原有的功能得以加強(qiáng)。目前基因治療多采用此種策略。3.基因補(bǔ)償性治療1104.基因失活性治療基因失活性早期一般指反義核酸技術(shù)。它將特定的反義核酸，包括反義RNA、反義DNA和核酶導(dǎo)入細(xì)胞，在翻譯和轉(zhuǎn)錄水平阻止某些基因的異常表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。RNAi、肽核酸、基因敲除。4.基因失活性治療1115.調(diào)控性基因治療

通過導(dǎo)入編碼調(diào)控蛋白的基因以治療基因表達(dá)異常的疾病。如：以野生型P53基因治療肺癌或急性白血病。5.調(diào)控性基因治療

通過導(dǎo)入編碼調(diào)控蛋白的基因以治1126.應(yīng)用“自殺基因”的基因治療

也稱活化前體藥物性基因治療。某些病毒或細(xì)菌產(chǎn)生的酶能將對人體無毒或低毒的藥物前體，在人體細(xì)胞內(nèi)一系列酶的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性物質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。6.應(yīng)用“自殺基因”的基因治療

也稱活化前體藥物性基因1137.免疫修飾性基因治療

免疫修飾性基因治療即導(dǎo)入能使機(jī)體產(chǎn)生抗病毒或抗腫瘤免疫力的基因以達(dá)到治療目的。例如：B7共刺激分子基因及各種淋巴細(xì)胞因子基因的導(dǎo)入和表達(dá)，直接注入抗原基因等。7.免疫修飾性基因治療

免疫修飾性基因治療即導(dǎo)入能1148.化療保護(hù)性基因治療

向正常細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入單相或多相細(xì)胞毒性藥物的抗性基因，使得正常細(xì)胞耐受化療藥物的能力大大提高。如：導(dǎo)入多藥耐藥基因（MDR），可使正常細(xì)胞獲得廣泛的化療藥物耐受性。8.化療保護(hù)性基因治療1159.特異性細(xì)胞殺傷性基因治療

利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建以特異性殺傷靶細(xì)胞為目標(biāo)的導(dǎo)彈。具有導(dǎo)向性和殺傷性。9.特異性細(xì)胞殺傷性基因治療

利用DNA重組技術(shù)構(gòu)116

四.基因治療的基本程序

（一）獲得目的基因

要進(jìn)行基因治療，必須首先獲得目的基因并對其表達(dá)調(diào)控進(jìn)行詳細(xì)研究。目的基因來源有多種，主要包括：含目的基因的供體細(xì)胞的基因組DNA分離、預(yù)先分離克隆的基因、PCR擴(kuò)增的基因及人工合成的基因。四.基因治療的基本程序

（一）獲得目的基因

要進(jìn)117（二）靶細(xì)胞的選擇

已被應(yīng)用的靶細(xì)胞有淋巴細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞。（二）靶細(xì)胞的選擇

已被應(yīng)用的靶細(xì)胞有淋巴細(xì)胞、造血1181.發(fā)病器官及位置。

可以選擇病變本身器官的細(xì)胞，也可以選擇病變器官以外的細(xì)胞來作為基因治療的靶細(xì)胞。例如：在肝臟病的基因治療中，可以選擇肝細(xì)胞作為基因治療的靶細(xì)胞；在腫瘤基因治療中，可選擇腫瘤組織侵潤的淋巴細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞本身。1.發(fā)病器官及位置。

可以選擇病變本身器官的細(xì)胞，也1192.靶細(xì)胞應(yīng)容易取出和移植

基因治療常規(guī)途徑：將靶細(xì)胞從體內(nèi)取出，經(jīng)基因轉(zhuǎn)化后再移植回人體內(nèi)。這就要求靶細(xì)胞容易從體內(nèi)取出和植回人體。最容易取出和移植的細(xì)胞當(dāng)屬血液系統(tǒng)的細(xì)胞。2.靶細(xì)胞應(yīng)容易取出和移植

基因治療常規(guī)途徑：將靶1203.靶細(xì)胞容易在體外培養(yǎng)

4.靶細(xì)胞容易實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化

將目的基因轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞的手段主要有物理、化學(xué)、融合及病毒載體四大類。

3.靶細(xì)胞容易在體外培養(yǎng)

4.靶細(xì)胞容易實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化

1215.靶細(xì)胞應(yīng)有較長的壽命

基因治療、特別是某些單基因遺傳缺陷性疾病的基因治療，最終目標(biāo)是要求外源基因長期、穩(wěn)定的表達(dá)，直至終生。

5.靶細(xì)胞應(yīng)有較長的壽命

基因治療、特別是某些單基122（三）基因載體和基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)目前使用的基因載體有病毒載體和非病毒載體。1.非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移物理方法顯微注射法電穿孔法直接注射法和微粒子轟擊法

（三）基因載體和基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)123

化學(xué)方法DNA-磷酸鈣共沉淀法多聚陽離子-DNA復(fù)合物法脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物法融合法：通過原生質(zhì)球相互融合的方法，將目的基因?qū)氚屑?xì)胞。化學(xué)方法1242.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移

該類方法是以病毒為載體，將目的基因?qū)氚屑?xì)胞或器官，并使之表達(dá)。一般在基因轉(zhuǎn)移中，所使用的病毒載體都是經(jīng)過改建的有復(fù)制缺陷的病毒。2.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移

該類方法是以病毒為載體，將目125這些病毒缺失了其自身復(fù)制所必需的一些基因，然后將治療基因、一些基因的調(diào)控成分（如啟動子和增強(qiáng)子）以及polyA信號等插入，使之成為表達(dá)性載體。目前在基因轉(zhuǎn)移中所使用的病毒載體有以下幾種。這些病毒缺失了其自身復(fù)制所必需的一些基因，然后將治療1261.逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus,RV）RV是目前基因轉(zhuǎn)移中應(yīng)用最為廣泛的一類病毒。是一類RNA病毒。由于缺失了自身包裝所必需的蛋白（結(jié)構(gòu)蛋白gap，多聚酶pol，包膜糖蛋白env）基因，因此其復(fù)制需依賴輔助細(xì)胞系。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染效率高，理論上可高達(dá)100%。1.逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus,RV）127轉(zhuǎn)染后，前病毒基因組（經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后形成的DNA）可與靶細(xì)胞基因組隨機(jī)組合，因而能穩(wěn)定的表達(dá)外源基因。缺點：1）只能轉(zhuǎn)染處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞；2）攜帶的外源基因不能太大（8-10Kb）；轉(zhuǎn)染后，前病毒基因組（經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后形成的DNA）可與靶細(xì)胞基因1283）逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染依賴于靶細(xì)胞表面適宜受體存在，限制了它的應(yīng)用，尤其是體內(nèi)基因治療的應(yīng)用；4）理論上講，從包裝細(xì)胞釋放出的復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒只有一次性感染靶細(xì)胞，但在某種情況下也會造成野生型病毒的爆發(fā)。3）逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染依賴于靶細(xì)胞表面適宜受體存在，限制了它的1295）由于病毒基因組是隨機(jī)整合到靶細(xì)胞基因組的，因而具有致細(xì)胞癌變的可能；6）逆轉(zhuǎn)錄病毒不能耐受純化和濃縮等處理過程，否則會使其感染活性大大下降。5）由于病毒基因組是隨機(jī)整合到靶細(xì)胞基因組的，因而具有致細(xì)胞130逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建外源基因插入病毒基因組有兩種方式，一種是直接將外源基因插入到病毒基因中；另一種是以外源基因取代病毒的必需結(jié)構(gòu)基因。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建131

在復(fù)制缺陷型病毒中，外源目的基因的插入使病毒基因滅火或以目的基因取代病毒的必需基因，使產(chǎn)生的重組前病毒不能表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白，因此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA不能被包裝產(chǎn)生子代重組病毒，在復(fù)制缺陷型病毒中，外源目的基因的插入使病毒基因132必須借助輔助病毒的共感染或通過包裝細(xì)胞提供病毒復(fù)制所必需的反式作用蛋白，然后才能包裝產(chǎn)生子代重組病毒。這樣獲得的子代重組病毒僅僅具有一次感染性，避免了產(chǎn)生繼發(fā)擴(kuò)散感染的危險。必須借助輔助病毒的共感染或通過包裝細(xì)胞提供病毒復(fù)制所必需的反133包裝細(xì)胞（pakagingcell）包裝細(xì)胞是通過基因工程技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其產(chǎn)生病毒結(jié)構(gòu)基因gag、pol、env所編碼的蛋白，為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝成為重組病毒提供全面的病毒蛋白，同時，該包裝細(xì)胞并不能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生編碼完整病毒的基因組RNA，一句話，包裝細(xì)胞本身不能產(chǎn)生任何形式的病毒顆粒。包裝細(xì)胞（pakagingcell）134逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的一般過程：1）目的基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上；2）帶有目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過物理方法如磷酸鈣介導(dǎo)或電穿孔法導(dǎo)入已選定的包裝細(xì)胞；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的一般過程：135

3）根據(jù)載體所提供的篩選標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞；4）選擇具有高滴度重組病毒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，分離重組病毒；5）重組病毒感染靶細(xì)胞，采用兩種方式，一種是以無細(xì)胞帶病毒上清和靶細(xì)胞一起溫育；另一種以產(chǎn)病毒的包裝細(xì)胞經(jīng)射線照射致死后作為飼養(yǎng)細(xì)胞，被靶細(xì)胞在其上面培養(yǎng)達(dá)到目的。3）根據(jù)載體所提供的篩選標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞；4）選擇具136

6）如采用體外感染，則將感染的細(xì)胞回輸體內(nèi)，分析治療基因的表達(dá)及治療效果；7）病毒感染的質(zhì)量控制，在基因轉(zhuǎn)移過程中要進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。6）如采用體外感染，則將感染的細(xì)胞回輸體內(nèi)，分析治療基因的137基因轉(zhuǎn)移的方法和途徑逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的方法主要有invivo和exvivo兩種。基因治療的早期多采用離體方案。離體方案基因轉(zhuǎn)移效率高，具有明確的基因轉(zhuǎn)移，但必須進(jìn)行宿主細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)，而大多數(shù)人體組織細(xì)胞，原代培養(yǎng)比較困難。基因轉(zhuǎn)移的方法和途徑138

近年來，更多采用體內(nèi)方案。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒直接注射的途徑主要有：1）采用靜脈注射等途徑，將重組病毒直接注射到機(jī)體內(nèi)，通過重組病毒的感染作用實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移；2）直接將產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細(xì)胞注射到組織或腫瘤中，由包裝細(xì)胞釋放再感染靶細(xì)胞；近年來，更多采用體內(nèi)方案。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒直接139

3）直接將表達(dá)載體，可以是非病毒性表達(dá)質(zhì)粒，注射到人體內(nèi)，如將HIV-1病毒載體注射到肌肉內(nèi)，使其表達(dá)相應(yīng)的env基因蛋白，引起相應(yīng)的細(xì)胞免疫。3）直接將表達(dá)載體，可以是非病毒性表達(dá)質(zhì)粒，注射到人體140最新基因治療(gene-therapy課件1412.腺病毒（adenovirus,AV）AV是一些大的（約38kb）雙鏈DNA。目前作為基因治療中所用的AV載體通常是一些復(fù)制缺陷病毒，其基因缺失位于基因組的E1A-E1B或E3區(qū)。

2.腺病毒（adenovirus,AV）142

AV既能感染增殖期細(xì)胞，也能感染靜止期細(xì)胞。這類病毒比較穩(wěn)定，且濃縮和純化對其感染活性影響不大。其不足之處為：1）病毒基因組一般不與靶細(xì)胞基因組整合，因而其表達(dá)外源基因是暫時的和不穩(wěn)定的；AV既能感染增殖期細(xì)胞，也能感染靜止期143

2）在AV的生活周期中，有許多不同生物學(xué)活性的蛋白暫時表達(dá)，其中也包括一些與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的蛋白；3）感染細(xì)胞內(nèi)大量病毒蛋白的表達(dá)，可導(dǎo)致機(jī)體對受染細(xì)胞的強(qiáng)烈免疫應(yīng)答。這一毒副作用在體內(nèi)基因治療是必須引起足夠的重視。2）在AV的生活周期中，有許多不同生物學(xué)活性的蛋白暫時144

目前有報道利用Cre——loxp重組構(gòu)建“無內(nèi)臟（gutless）”AV載體可望解決AV的免疫原性問題；4）AV幾乎可以感染所有細(xì)胞，缺乏特異性。或許可以通過使用組織特異性啟動子來克服這一問題。目前有報道利用Cre——loxp重組構(gòu)建“無1453.腺相關(guān)病毒（adeno-associatedvirus,AAV）:AAV屬于微小病毒家族成員，是一類小的單鏈DNA病毒（基因組約4.7kb），非常穩(wěn)定。本身無致病性，需輔助病毒（常為AV）存在時才能復(fù)制。AAV可感染人的細(xì)胞，并能整合至非分裂相細(xì)胞。3.腺相關(guān)病毒（adeno-associatedvirus146

大部分AAV基因組可去除，從而可使外源基因得以大量補(bǔ)足。AAV可以整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組，但不如RV的整合效率高。有趣的是，在感染細(xì)胞中，野生型AAV基因組可高效定點整合于人類第19號染色體長臂的特定位置上，這種整合可導(dǎo)致染色體基因重排，大部分AAV基因組可去除，從而可使外源147

而這種重排與慢性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)。然而攜帶治療性基因的AAV載體似乎不象它的野生型親本，沒有定點整合于19號染色體的相同特征。因此從安全的角度來考慮，這種AAV的定點整合有多大優(yōu)越性，尚值得進(jìn)一步探討。而這種重排與慢性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)。然而攜帶治療性1484.單純皰疹病毒（herpessimplexvirus,HSV）:HSV是一些雙鏈DNA病毒（基因組約150kb），具有嗜神經(jīng)細(xì)胞的特性，能在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)形成“終生隱性感染”。將外源基因?qū)氩⑹怪L久存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)是該類病毒載體的一大特點。4.單純皰疹病毒（herpessimplexvirus,149

如果能夠選擇性地調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)，而不誘導(dǎo)病毒基因的表達(dá)，這將對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療大有幫助。HSV的缺點：1）僅能感染分裂細(xì)胞，從而使之在成人腦組織中的應(yīng)用受到限制。2）這類病毒（包括無復(fù)制能力的病毒）對靶細(xì)胞具有毒害作用，需慎重。如果能夠選擇性地調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)，而不誘150（四）外源基因表達(dá)的檢測

需用載體中的標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行篩選。在較多的表達(dá)載體中都有neor標(biāo)記基因的存在，若向培養(yǎng)基中加入藥物G418，未被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則因不存在neor標(biāo)記基因而不能存活。（四）外源基因表達(dá)的檢測

需用載體中的標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)151（五）回輸體內(nèi)

將治療性基因修飾的靶細(xì)胞以不同的方式回輸體內(nèi)以發(fā)揮治療效果。如淋巴細(xì)胞可以靜脈回輸入血；造血細(xì)胞可采用自體骨髓移植的方法；皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)膠原包裹后埋入皮下組織中。（五）回輸體內(nèi)

將治療性基因修飾的靶細(xì)胞以不同的方式152四心血管病的基因治療近二十年來，由于心血管病發(fā)病的分子機(jī)制和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的發(fā)展，使心腦血管病的基因治療亦取得了十分可喜的成就。1993年Wilson應(yīng)用LDLR基因治療家族性高膽固醇血癥。四心血管病的基因治療153

1996年Isner應(yīng)用血管內(nèi)皮生長因子基因治療梗塞性血管病，都已在臨床應(yīng)用，并獲得了成功。盡管在人類已實施的近400個臨床基因治療方案中，心血管病只占5%左右，但其成功率卻是最高的。1996年Isner應(yīng)用血管內(nèi)皮生長154

心腦血管病的基因治療有三個最基本的條件：1治療基因的選擇，這取決于心腦血管病發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制的研究；2）體內(nèi)基因運載系統(tǒng)，這是目前心腦血管病基因治療主要的限速因素；3）治療基因在體內(nèi)的表達(dá)與調(diào)控，這是目前心腦血管病基因治療研究中最薄弱的環(huán)節(jié)。心腦血管病的基因治療有三個最基本的條155心血管病基因治療的一些特點心腦血管病主要包括單基因遺傳病和多基因的心血管病兩大類。前者發(fā)病率較低，主要有家族性高膽固醇血癥，遺傳性擴(kuò)張性心肌病，肥厚性心肌病，長Q-T綜合征，遺傳性心肌營養(yǎng)不良等。這些疾病多因基因突變和缺陷所引起，心血管病基因治療的一些特點156

其致病基因大部分已經(jīng)克隆出來?；蛑委熕x擇。外源基因需在體內(nèi)長期，穩(wěn)定表達(dá)才能有效。后者，發(fā)病率很高，主要有高血壓，動脈粥樣硬化，心肌肥厚，心功能不全，再狹窄等。這些疾病多是環(huán)境因素和遺傳因素相互作用所引起。其致病基因大部分已經(jīng)克隆出來?；蛑?57

心血管病與腫瘤，傳染病等不同，其發(fā)病過程較長，在發(fā)病的過程中存在一系列致病和抗病因素漫長的相互拮抗和調(diào)整的過程，是一系列網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)失衡的結(jié)果。對于絕大多數(shù)的心腦血管病基因治療的目的是促進(jìn)自身的保護(hù)機(jī)制，阻斷疾病發(fā)展過程中的惡性循環(huán)。心血管病與腫瘤，傳染病等不同，158

因此，對于絕大多數(shù)常見的心腦血管病的基因轉(zhuǎn)移，不一定需要整合到染色體中，長期而終生表達(dá)，常常瞬間，有限的表達(dá)，阻斷疾病的惡性循環(huán)即可達(dá)到治療的目的。因此，對于絕大多數(shù)常見的心腦血管病的基159心血管系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移心血管系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移可分為間接細(xì)胞轉(zhuǎn)移和直接基因轉(zhuǎn)移兩大類。1.基因縫線：基因縫線是一種裸DNA直接注射至體內(nèi)的轉(zhuǎn)移方法現(xiàn)在證明用裸DNA進(jìn)行肌肉、血管和心肌直接注射，都可以實現(xiàn)局部組織的基因轉(zhuǎn)移，并表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)。心血管系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移160

基因縫線是將裸DNA通過多聚賴氨酸或魚精蛋白直接黏附在手術(shù)縫合線上，進(jìn)行肌肉、血管和心肌縫合。這種方法可以避免直接注射裸DNA后的流失，使其長期滯留在局部組織，發(fā)揮持續(xù)轉(zhuǎn)基因作用?；蚩p線是將裸DNA通過多聚賴氨酸或魚精1612.基因球囊和支架基因球囊和支架是將外源基因通過多聚賴氨酸或魚精蛋白，固定在動脈導(dǎo)管球囊或支架的表面，通過動脈導(dǎo)管送入血管局部，固定球囊和支架，令球囊加壓和充氣，使其緊貼在血管表面或?qū)⒅Ъ苤踩胙鼙趦?nèi)。2.基因球囊和支架1623.血管外膜的基因轉(zhuǎn)移應(yīng)用多聚凝膠（生物膠）與外源基因混合，形成基因膠或基因微球，注射在血管周圍或組織內(nèi)，亦可延長基因轉(zhuǎn)移時間，提高轉(zhuǎn)基因效率。3.血管外膜的基因轉(zhuǎn)移1634.陽離子脂質(zhì)體脂質(zhì)體是一種人工的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，可以通過與細(xì)胞膜的融合或受體介導(dǎo)的細(xì)胞吞飲，將外源DNA送入細(xì)胞內(nèi)。4.陽離子脂質(zhì)體1645.受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移在心血管細(xì)胞表面存在許多特異性的受體，當(dāng)配體DNA復(fù)合物與受體結(jié)合后，可以通過受體的內(nèi)趨化和胞飲作用，將外源基因特異性轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞內(nèi)。5.受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移1656.病毒脂質(zhì)體病毒脂質(zhì)體是將滅活的病毒或病毒的包被蛋白的片段鑲嵌在陽離子脂質(zhì)體的雙層脂質(zhì)層中所構(gòu)建的一種基因載體。這種載體不含病毒的基因，僅僅利用病毒中負(fù)責(zé)感染細(xì)胞的蛋白片段。6.病毒脂質(zhì)體1667.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和腺相關(guān)病毒。(一)遺傳性心血管病的基因治療家族性高膽固醇血癥的基因治療1993年美國費城醫(yī)學(xué)中心Grossman應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶LDLR基因，治療5例家族性高膽固醇血癥的病人，取得成功。7.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移167

他們首先從病人體內(nèi)取出2/3的肝臟，分離出肝細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，再應(yīng)用重組LDLR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的肝細(xì)胞，經(jīng)篩選和大量培養(yǎng)，最后通過門靜脈回輸?shù)礁闻K。證明其外源性野生型LDLR可以在肝臟長期表達(dá)，血漿LDL的水平明顯降低，可以明顯延長患者存活期。他們首先從病人體內(nèi)取出2/3的肝臟168

這種方法技術(shù)復(fù)雜，費用高，可引起肝炎等免疫反應(yīng)，難以普及和推廣。1996年他們應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)極低密度脂蛋白受體基因（VLDLR）的，直接注入肝臟，證明亦可以治療實驗性高膽固醇血癥，但表達(dá)時間較反轉(zhuǎn)錄病毒載體短，但操作簡便。這種方法技術(shù)復(fù)雜，費用高，可引起肝炎169

北醫(yī)心血管研究所最近用AV脂質(zhì)體攜帶LDLR基因，直接從門靜脈注入，證明LDLR基因可以在肝細(xì)胞中高度表達(dá)，并可降低血中LDL和甘油三酯的水平，且無明顯毒副作用，但持續(xù)時間短，一次注射作用只可持續(xù)2-3周。北醫(yī)心血管研究所最近用AV脂質(zhì)體攜170（二）復(fù)雜性心血管病的基因治療除了單基因遺傳性心腦血管病以外，絕大多數(shù)的心腦血管病都是多基因復(fù)雜的心腦血管病。主要包括高血壓，高脂血癥和動脈粥樣硬化，血栓癥，心功能不全，再狹窄，梗塞性血管病等等。（二）復(fù)雜性心血管病的基因治療171

人們對這些疾病雖然進(jìn)行了大量，長期的研究，但至今還未找到這些疾病發(fā)病的主要致病基因。絕大多數(shù)心血管疾病不一定都是基因結(jié)構(gòu)的缺陷——突變、缺失、重排和移位，而主要表現(xiàn)為基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)和調(diào)控的失衡。因此，利用這些候選和調(diào)控基因，補(bǔ)充和促進(jìn)某些基因的表達(dá)，阻遏某些基因的功能，亦可達(dá)到防治疾病的目的。人們對這些疾病雖然進(jìn)行了大量，長期的研究1721梗塞性血管病的基因治療梗塞性血管病包括外周梗塞性血管病、冠狀動脈梗塞、腦梗塞和再狹窄等。血管內(nèi)血栓形成，血管內(nèi)膜增生、高脂血癥、動脈粥樣硬化、糖尿病等都可以引起血管的阻塞，引起器官、組織的缺血、損傷和猝死。1梗塞性血管病的基因治療173

目前主要針對不同原因和梗塞的程度采用容栓和介入療法。嚴(yán)重的梗塞必須進(jìn)行血管外科手術(shù)-搭橋術(shù)（bypass