RNA提取標(biāo)準(zhǔn)流程圖

RNA提取標(biāo)準(zhǔn)流程原理：TRIzol試劑適用于從細(xì)胞和組織中快速分離RNA。TRIzol使樣品細(xì)胞裂解，溶解細(xì)胞含物，同時(shí)因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相,RNA在水相中，取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA。預(yù)防RNase污染注意事項(xiàng)：.經(jīng)常更換新手套，皮膚上常帶有的細(xì)菌，霉菌可能成為RNase的來源。.使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交叉污染。.RNA提取過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿、塑料制品高壓滅菌，然后烘干即可。.配制溶液應(yīng)使用無RNase的水（將水加入處理過不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.05%v/v,充分混勻后37℃放置過夜，高壓滅菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）RNA的提取準(zhǔn)備試劑：氯仿，異丙醇（可保存在-20。。用時(shí)取出置于冰上），75%乙醇，無RNase的水。所有.溶液均需用0.05%DEPC處理過的水配制。lOxLoadingbuffer（寶生物工程（），貨號(hào)：D603,35元，lmLX5支）準(zhǔn)備器材：1mL、200pL槍頭、小燒杯*3、1.5mLEppendorf管、2mLEppendorf管若干、報(bào)紙、卷紙、研缽，以上物品全部需要高壓。操作步驟：.研磨+勻漿：將組織在液氮中磨碎（大體積不均一的樣品，如下丘腦、海馬等神經(jīng)組織、成年動(dòng)物腎上腺等腺體，必須對(duì)整個(gè)組織研磨），取50?100mg組織樣品（肝臟可減少樣品量到30mg）放入2mL離心管中，稱重記錄：均一組織或者小體積的不均一組織可直接稱重后勻漿。每50?100mg組織加入1mLTRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10%。.將勻漿樣品在室溫（15?30"）放置5min（可延長(zhǎng)到15min）,使核酸蛋白復(fù)合物完全分離?？蛇x步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖（如肝臟和肌肉中的糖原）或胞外物質(zhì)（肌肉）可于2?8clOOOOxg離心10min,取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜,多糖，高分子量基因組DNA,上清中含有RNA.處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液轉(zhuǎn)入2mL管中進(jìn)行下一步操作。.每1mLTRIzol加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩60s（可使用混勻器，也可手動(dòng)劇烈顛倒混勻），室溫放置3min。（可延長(zhǎng)震蕩時(shí)間和放置時(shí)間到15min,同GTC法）.4"C10000xg離心15min。樣品分為三層:底層為紅色有機(jī)相,上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60%o（即1mL最多600口，為保證RNA質(zhì)量，可適量減少抽取量，防止抽到下層）.記錄抽取水相的量,把水相轉(zhuǎn)移到新的1.5mLEppendorf管中，用等體積的預(yù)冷的異丙醇沉淀水相中的RNAoa.每使用1mLTRIzol力口入0.5mL異丙醇，室溫放置10min。b.可選：應(yīng)對(duì)糖原含量較高的組織（如肌肉和肝粒）：每使用1mLTRIzol在水相中加0.25mL異丙醇和0.25mL高鹽溶液（0.8M檸檬酸鈉和1.2MNaCl）混合離心,這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，沉淀出RNA..4℃10000xg離心10min,離心前看不出RNA沉淀（肌肉和肝臟等富含糖原的組織可能出現(xiàn)大量糖原沉淀），離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)白色半透明狀沉淀。棄上清。.向1.5mLEppendorf管中加入75%乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1mLTRIzol至少加1mL75%乙醇。4℃不超過7500xg離心5min,棄上清。.室溫放置于超凈臺(tái)通風(fēng)口（墊上已滅菌的吸水紙）干燥RNA沉淀，大約晾5?10min即可，過于干燥會(huì)導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入適量DEPC水，記錄使用的DEPC水體積（適量是指加入水后仍能保證RNA濃度至少20.5Mg/pL,但不影響溶解，濃度在4pg/pL以上的RNA較容易出現(xiàn)溶解不完全的情

況），使之充分溶解.（可選擇4c放置1h以上或55?65"水浴10min）,之后才可以進(jìn)行測(cè)濃度、DNA污染的PCR驗(yàn)證、RNA變性電泳等后續(xù)操作。RNA應(yīng)盡快轉(zhuǎn)移至-70°C保存。也可用100%的去離子甲酰胺溶解（用于northern的RNA可這樣保存于-20。C）。補(bǔ)充說明：.從少量樣品（1?10mg組織或IO??IO,細(xì)胞）中提取RNA時(shí)可加入少許線性丙烯酰胺等助沉劑以促進(jìn)RNA沉淀。操作示例：加800MLTRIzol勻漿樣品,沉淀RNA前加濃度為5mg/inL的線性丙烯酰胺2?3注RNase-free線性丙烯酰胺溶液。它在使用時(shí)最終工作濃度應(yīng)該為10-20pg/mL:線性丙烯酰胺會(huì)與RNA一同沉淀出來，線性丙烯酰胺濃度不高于5Ng/|JL不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。線性丙烯酰胺制備方法見附錄1。.勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-7（TC保存至少一個(gè)月。.若提取的組織源性RNAase含量較高（如胰腺），可將全部過程置于冰上操作,同時(shí)適當(dāng)延長(zhǎng)放置時(shí)間。預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或IxU細(xì)胞提取rna分別為：肝和脾6?10卜唱，腎3?4卜唱，骨骼肌和腦組織1-1.5卜喧，胎盤1?4pg,上皮細(xì)胞8?15Ng,成纖維細(xì)胞5?7ngoRNA的質(zhì)量控制：1.使用nanodrop測(cè)量RNA吸光值時(shí)的幾點(diǎn)說明：RNAdiucioninwater/TE….200nj>Mm。?100(^4Kiwuir50noyinwcnef?80rnIE—500nr)^JnTFlOOr^MinTERNAdiucioninwater/TE….200nj>Mm。?100(^4Kiwuir50noyinwcnef?80rnIE—500nr)^JnTFlOOr^MinTE 5ChqMinTE0987654323vue<yosqe對(duì)于RNA純品：A260/A280=1.81（溶于水）：A260/A280=2.04（溶于TE：10mMTris-HCIImMEDTApH=8.0）：A260/A230>2-nanodrop使用0.2mm光徑，但默認(rèn)顯示的是換算后的1cm光徑吸光值，并非其精度能圖四、RNA電泳示例圖，2%的變性股，對(duì)比度經(jīng)過調(diào)整美化常見問題分析：得率低：A.樣品裂解或勻漿處理不徹底B.RNA沉淀未完全溶解A260/A280<1.65：A.檢測(cè)吸光度時(shí)，RNA樣品沒有溶于TE,而溶于了水中，低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高，水中L5?1.8的比值都可能是質(zhì)量較好的RNAB.樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少（造成蛋白未分離完全）C.勻漿樣品時(shí)未在室溫放置5minD.吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相E.RNA沉淀未完全溶解RNA降解：A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-7（TC,而保存在了-5至-20℃C.細(xì)胞在用胰酶處理時(shí)過度D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理E.電泳時(shí)使用的甲醛pH值低于了3.5DNA污染:A.樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少B.樣品中含有有機(jī)溶劑(如乙醇，DMSO等)，強(qiáng)緩沖體系或堿性溶液附錄I一、線性丙烯酰胺制備方法.配5%的丙烯酰胺(acrylamide)溶液：A.配制buffer100mL(40mMTris-HCl(pH=8),20mM醋酸鈉,1mMEDTA)：稱取2.72g無水醋酸鈉,溶于50mLDEPC水中，向其中加入1MTris-Cl(pH=8.0)4mL,0.5MEDTA(pH=8.0)0.2mL,力口入鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0,再加DEPC水至100mLoB.稱取5g丙烯酰胺，加入lOOmLbuf&r中，高壓滅菌后分裝至高壓過的1.5mL管中，每管0.2mL。.加過硫酸鐵(AP)到終濃度為0.1%(w/v)：A.配制10%AP儲(chǔ)存液(w/v)：稱取0.1gAP,溶解于1mLDEPC水中。B.向每管5%的丙烯酰胺溶液中加入2卜工10%AP。.加TEMED到終濃度為1/1000(v/v),即向每管中加入0.2|jLTEMED,室溫聚合30mino.待溶液變粘稠，向管中加入2.5倍體積(500pL)的乙醇沉淀聚合物，-20℃沉淀30min以上。.12000義8離心51］加，沉淀即為線性的丙烯酰胺，每管加入1mLIxTEbuffer溶解(溶解時(shí)間較長(zhǎng)，可4c過夜)，即得到終濃度為10mg/mL的線性的丙烯酰胺1mL。封口膜密封保存于-20℃,可保存2年。IxTEbuffer(10mMTris-Cl,pH=8.0：1mMEDTA)配制方法：加入1MTris-Cl(pH=8.0)1mL,0.5MEDTA(pH=8.0)0.2mL,加入DEPC水至.100mL,向壓滅菌備用。6,使用時(shí)先加10?20摩(就是1?2/)到核酸(RNA、DNA均可)溶液中，之后再加相應(yīng)的鹽溶液和異丙醇進(jìn)行沉淀。對(duì)于20nt以上的片段，號(hào)稱可以無損回收pg級(jí)的核酸。二、lOxMOPS（0.2MMOPS（3-（N?嗎琳）丙磺酸），50mMNaAc,10mMEDTA）配制：先用800