畢氏酵母感受態(tài)細胞制備及轉化

畢氏酵母(Pichiapastoris)感受態(tài)細胞制備及轉化1、畢氏酵母氯化鋰轉化法試劑1MLiCl(用去離子蒸餾水配制，濾膜過濾除菌；必要時用消毒去離子水稀釋)50%PEG3350(SigmaP3640用去離子蒸餾水配制，濾膜過濾除菌，用較緊的蓋子的瓶子分裝)2mg/mlsalmonspermDNA/TE(10mMTris-Cl,pH8.0,1.0mMEDTA)-20°C保存注：醋酸鋰對畢氏酵母無效，僅氯化鋰有效；PEG3350可屏蔽高濃度LiCl的毒害作用；感受態(tài)畢氏酵母的制備接種Pachiapastoris到50mlYPD培養(yǎng)基中，30C搖菌過夜(約24~28h)培養(yǎng)到OD值為0.8~1.0(約108Cells/ml);收獲細胞，用25ml無菌水洗滌一次，室溫下1500g離心10min;重懸細胞于1ml100mMLiCl溶液中，將懸液轉入1.5ml離心管；離心機最大速度離心15秒沉淀菌體，重懸菌體于400ul100mMLiCl溶液中；按50ul/W分裝，立即進行轉化；注：不要將感受態(tài)酵母菌冰??；(3)畢氏酵母的轉化煮沸1ml鮭魚精DNA5min，迅速冰浴以制備單鏈擔體DNA；將感受態(tài)酵母菌離心，以Tips去除殘余的LiCl溶液；對于每一個轉化，按以下順序加入：50%PEG3350240ul36ul1MLiCl2mg/ml單鏈SalmonspermDNA25ul5-10ug/50ulH2O質粒DNA50ul劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體完全分布均勻(約lmin);30°C水浴孵育30min;42°C水浴熱休克20~25min;6000~8000rpm離心收集酵母菌體；重懸酵母于1mlYPD培養(yǎng)基，30C搖床孵育；1~4h后，取25~100ul菌液鋪選擇性培養(yǎng)基平板，于30C培養(yǎng)2~3天鑒定；2.^氏酵母PEG1000?化法試劑緩沖液A:1.0MSorbitol,10mMBicine,pH8.35(sigma),3%(v/v)ethyleneglycol緩沖液b:40%(w/v)PEG1000(sigma),0.2MBicine,pH8.35緩沖液C:0.15MNaCl,10mMBicine,pH8.35未污染的新鮮、試劑級DMSO,-70C保存注：36ul緩沖液A、B、C均用濾膜過濾，-20C保存；將DNA直接加在凍結的酵母細胞上是本實驗的關鍵之處(即使在冰上解凍的待轉化細胞，其攝取外源DNA的能力也在解凍過程中迅速下降；如進行多樣品的轉化，建議按6樣品/組進行)；待轉化畢氏酵母的制備接種環(huán)接種Pachiapastoris于YPD平板，30C培養(yǎng)2d;挑取單克隆酵母菌株于10mlYPD培養(yǎng)基中，30C振蕩培養(yǎng)過夜；取步驟2中小量菌液接種到100mlYPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待其OD值從0.1升到0.5-0.8；室溫下3000g離心收集酵母菌體，50ml緩沖液A洗滌一次；重懸菌體于4ml緩沖液A中按0.2ml^分裝于1.5ml的離心管中每管加入llulDMSO,混合后迅速于液氮中冷凍，-70°C保存(3)畢氏酵母的轉化將約50ug線性化質粒DNA溶于20ulTE或水中，直接加于凍結的酵母細胞中；加入擔體DNA(40ug變性超聲線性化鮭魚精DNA)以獲得最大轉化率；37C水浴孵育5min，中間混合樣品1~2次；取出離心管，加入1.5ml緩沖液B，徹底混勻；30C水浴孵育1h；室溫下2000g離心10min，去除上清液，菌體沉淀重懸于1.5ml緩沖液C中；離心樣品，去除上清液，輕微操作將樣品重懸于0.2ml緩沖液C中；將所有轉化液鋪于選擇性平板，于30C孵育3~4天后，鑒定；3、畢氏酵母電轉化法(1)E.coliTOP10F'感受態(tài)細胞的制備取10ulTOP10F'菌液，接種于200mlLB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，37C,200rpm,16~18小時。取100ul菌液接種于200ml液體LB培養(yǎng)基中。37C,200rpm，培養(yǎng)16~18小時。滅菌500ml離心管，4C,4000rpm,20min。得菌體沉淀。棄上清，菌體用10%甘油重懸并洗滌。重復洗滌3次。第三次離心后，棄絕大部分上清，留下約1ml液體用于重懸菌體。從制得得感受態(tài)細胞中，取200ul于滅菌EP管中，加入連接反應產物5ul，混勻，不要產生氣泡，在冰上放置5min。將混勻后得200ul菌液移入電擊杯中。使用電擊穿孔儀進行轉化，設置為電壓2500V，時間5ms。電擊后，往電擊杯中加入800ulSOC培養(yǎng)基，沖洗出菌體，轉移至滅菌1.5mlEP管中。37°C,150rpm，輕搖45-60min。取全部均勻涂布于含Zeocin25ug/ml的LLB-Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流動，37C培養(yǎng)12-16小時。（2）線性化質粒DNA對PichiapastorisGS115的轉化取新鮮制備的（或-70C凍存的）感受態(tài)細胞置于冰浴中，使其完全解凍；1將1005菌體移出至一新的無菌Eppendorf管中加入5-20四線性化質粒；5~10『）,輕彈混勻，盡數吸出轉移到0.2cm型的電穿孔轉化杯中；2）轉化杯置于冰浴中5~10分鐘，保持低溫。3）電穿孔轉化電擊條件：電壓：1500V;電阻：400Q;電容：25吁；脈沖時間：10mS;一次電擊。4）電擊后，馬上在電擊轉化杯中加入1ml4C預冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液槍吹打均勻，置于冰浴中；5）取30C烘至表面半干的MD培養(yǎng)基平板，在超凈工作臺上無菌操作涂布平板，4005/板3.4畢赤酵母電轉化方法3.4.1菌體的準備:1.挑取酵母單菌落，接種至含有5mlYPD培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，30°C、250-300r/min培養(yǎng)過夜；取100-5005的培養(yǎng)物接種至含有500ml新鮮培養(yǎng)基的2L三角搖瓶中，28?30C、250-300r/min培養(yǎng)過夜，至OD600達到1.3?1.5;將細胞培養(yǎng)物于4C,1500g離心5min，用500ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；按步驟3離心，用250ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；按步驟3離心，用20ml的冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；按步驟3離心，用1ml的冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為1.5ml；備注：可將其分裝為805—份的包裝冷凍起來，但會影響其轉化效率（2周之內％3.4.2電擊轉化：將5?20四的線性化DNA溶解在5?105TE溶液中，與80pl的上述步驟6所得的菌體混勻，轉至0.2cm冰預冷的電轉化杯中；將電轉化杯冰浴5min；根據電轉化儀提供的資料，參考其他文獻及多次摸索，確定合適的電壓、電流、電容等參數，按優(yōu)化的參數，進行電擊；電擊完畢后，加A1ml冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉至1.5ml的EP管中；將菌體懸液涂布于MD或RDB平板上，每200?600|jl涂布一塊平板；將平板置于301培養(yǎng)，直至單個菌落出現。推薦：電壓1.5kV；電容25吁；電阻2000。電擊時間