《生物技術(shù)藥物》word版參考模板

9/9生物技術(shù)藥物總結(jié)第一講 總論生物技術(shù)藥物(BiotechdrugsorBiopharmaceuticals)：指采用生物技術(shù)生產(chǎn)的用于疾病的預(yù)防、治療和診斷的制品。生物技術(shù)：指以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合其他基礎(chǔ)科學(xué)的科學(xué)原理，采用先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)手段，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的。主要包括：基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、蛋白質(zhì)工程、抗體工程。生物技術(shù)藥物分類（按化學(xué)特性）：天然生物技術(shù)藥物；重組活性蛋白、多肽；基因藥物（核酸藥物）第二講 基因工程基本過(guò)程與方法（一）原核表達(dá)載體（大腸桿菌）功能元件：?jiǎn)?dòng)子及調(diào)控序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、松弛型復(fù)制子、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)、多克隆位點(diǎn)、篩選標(biāo)記哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體功能元件：原核DNA序列、啟動(dòng)子、終止子和多聚腺苷化信號(hào)、拼接信號(hào)、篩選標(biāo)記第三講 基因工程基本過(guò)程與方法（二）——基因文庫(kù)的構(gòu)建、基因工程中的常用酶、DNA測(cè)序cDNA文庫(kù)：指通過(guò)克隆的方法保存在宿主中的一群混合分子，這些分子中的插入片段的總和可代表某種生物全部mRNA序列。cDNA基因文庫(kù)構(gòu)建的步驟：①細(xì)胞總RNA的提取和mRNA的分離；②第一條cDNA合成：oligo(dT)引物引導(dǎo)的DNA合成法、隨機(jī)引物合成法、特定寡核苷酸引物合成法；③第二條cDNA合成：自身引物合成法、置換合成法、外加引物合成法④雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖限制性核酸內(nèi)切酶（同尾酶）：一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列并能切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。識(shí)別序列特點(diǎn)：多數(shù)具有嚴(yán)格的識(shí)別序列；識(shí)別序列的長(zhǎng)度:4~8個(gè)堿基對(duì)；序列特征：回文序列第四講 基因工程基本過(guò)程與方法（三）——細(xì)胞轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染連接子導(dǎo)入受體細(xì)胞：轉(zhuǎn)化：將質(zhì)?；駾NA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，引起細(xì)胞遺傳的改變。轉(zhuǎn)染：真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過(guò)噬菌體(或病毒)將宿主基因從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)不同基因型的細(xì)胞中。※常用方法： 原核細(xì)胞：CaCl2感受態(tài)法、噬菌體體外包裝法真核細(xì)胞：電穿孔法、DNA-磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、顯微注射法CaCl2感受態(tài)法：適用于革蘭氏陰性細(xì)菌。原理：是鈣離子與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖（HeatShock)發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，使DNA分子能夠通過(guò)。優(yōu)點(diǎn)：操作方便缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率較低重組體克隆的篩選與鑒定：抗藥性標(biāo)記篩選、※蘭-白斑篩選（α-互補(bǔ)）、DNA電泳檢測(cè)α-互補(bǔ)：將缺陷α-半乳糖苷酶N端部分序列的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入缺陷α-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主菌，并且在含有X-gal的培養(yǎng)基上選擇性培養(yǎng)，用乳糖類似物IPTG作為安慰性誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌后，宿主與質(zhì)粒產(chǎn)生的有缺陷的α-半乳糖苷酶之間可以形成互補(bǔ)，對(duì)X-gal進(jìn)行降解可產(chǎn)生藍(lán)色菌落，這就是α-互補(bǔ)現(xiàn)象。定點(diǎn)突變： 1、盒式誘變：利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列。2、寡核苷酸引物誘變：指應(yīng)用合成的寡核苷酸片段作為誘變劑，誘發(fā)基因或DNA片段中特定位點(diǎn)發(fā)生突變的技術(shù)。3、PCR誘變寡聚核苷酸介導(dǎo)的突變盒式突變PCR介導(dǎo)的突變優(yōu)點(diǎn)保真度高簡(jiǎn)單易行突變效率高操作簡(jiǎn)單突變成功率高缺點(diǎn)突變效率相對(duì)低操作復(fù)雜周期長(zhǎng)受到酶切位點(diǎn)的限制后續(xù)工作復(fù)雜TaqDNA聚合酶保真性偏低第五講 原核表達(dá)系統(tǒng)啟動(dòng)子（promotor）：是RNA聚合酶結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的特異DNA序列。核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）：遺傳信息翻譯成多肽鏈起始于mRNA上的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）。它是起始密碼子AUG上游的一段非翻譯區(qū)序列。常用的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)Plac轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)：弱,IPTG誘導(dǎo)lPL和lPR轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng):強(qiáng)，熱誘導(dǎo)Ptrp轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng):強(qiáng)，吲哚丙烯酸Ptac轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)：強(qiáng)，IPTG誘導(dǎo)PT7轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)：轉(zhuǎn)錄活性高，特異性強(qiáng)；IPTG誘導(dǎo)表達(dá)形式： 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)：非融合型表達(dá)：天然完整蛋白融合型表達(dá)：如GST融合表達(dá)蛋白融合型表達(dá)：如GST融合表達(dá)蛋白優(yōu)點(diǎn)：1、轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始由正常的大腸桿菌序列調(diào)控，表達(dá)效率較高2、融合蛋白較天然真核蛋白更穩(wěn)定3、可以利用識(shí)別原核肽段的配體進(jìn)行親和層析純化4、融合蛋白分子量大，易于電泳鑒定表達(dá)部位：包涵體、周質(zhì)表達(dá)包涵體：存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。形成原因：目的基因的高表達(dá)，使蛋白無(wú)足夠時(shí)間進(jìn)行肽鏈折疊，產(chǎn)生凝集；種種原因引起的蛋白不能正確折疊；蛋白的性質(zhì)；溫度、pH值等環(huán)境條件的影響等。特點(diǎn)： 1.簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作：2.能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定周質(zhì)分泌表達(dá)的特點(diǎn)分泌后的蛋白產(chǎn)物不含氨基端甲硫氨酸原核生物細(xì)胞質(zhì)中的還原環(huán)境不利于蛋白二硫鍵的形成，而氧化性的周質(zhì)間隙可以模擬真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境，便于新生肽鏈折疊成天然結(jié)構(gòu)，從而獲得完全生物活性的重組蛋白一些可被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶所降解的蛋白在周質(zhì)中穩(wěn)定性提高第六講真核表達(dá)系統(tǒng)※真核表達(dá)載體的主要構(gòu)件：?jiǎn)?dòng)子和增強(qiáng)子、終止信號(hào)和poly(A)信號(hào)、剪接信號(hào)；允許載體在細(xì)菌內(nèi)擴(kuò)增的序列：復(fù)制起始位點(diǎn)和抗藥性標(biāo)記基因；多克隆位點(diǎn)：插入外源DNA片段用于篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記：抗生素抗性基因，如：neo基因：使細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)新霉素衍生物G418的抗性。營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因，如：二氫葉酸還原酶基因、胸苷激酶基因等等顯性活動(dòng)調(diào)控區(qū)(dominantcontrolregion,DCR)序列，克服因載體整合在宿主基因組不同位點(diǎn)而產(chǎn)生的表達(dá)水平降低。釀酒酵母作為表達(dá)宿主的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)： 1、安全無(wú)毒、不致??； 2、遺傳背景清楚，易進(jìn)行遺傳操作；3、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單； 4、易進(jìn)行載體DNA的導(dǎo)入缺點(diǎn)： 1、發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生乙醇，乙醇的積累會(huì)影響酵母本身生長(zhǎng)，較難進(jìn)行高密度發(fā)酵2、蛋白質(zhì)的分泌能力較差 3、常發(fā)生過(guò)度糖基化畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：(1)高表達(dá)：表達(dá)載體一般利用醇氧化酶基因（AOX1）的啟動(dòng)子，功能很強(qiáng)。(2)高分泌：應(yīng)用啤酒酵母因子的前導(dǎo)序列，有很好的分泌效果，有些蛋白分泌表達(dá)可10g/L；(3)高穩(wěn)定：一般用整合型載體YIP，整合于染色體上，構(gòu)建的轉(zhuǎn)化子菌株十分穩(wěn)定；(4)糖基化功能較啤酒酵母更接近高等真核生物。缺點(diǎn)：(1)分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)差，對(duì)其進(jìn)行遺傳改造困難較大;(2)發(fā)酵雖能達(dá)高密度，但發(fā)酵周期較長(zhǎng);(3)不是一種食品微生物，發(fā)酵時(shí)又要添加甲醇，因?yàn)锳OX1啟動(dòng)子是被甲醇調(diào)控的，當(dāng)畢赤酵母以葡萄糖、甘油、乙醇為碳源時(shí)，菌體可以生長(zhǎng)，但AOX1啟動(dòng)子是關(guān)閉的，當(dāng)這些碳源耗盡，添加甲醇時(shí)，AOX1的mRNA可占總mRNA5%。昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)： 1、插入較大的外源基因，借助多元表達(dá)載體可以同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因；2、表達(dá)載體一般使用多角體蛋白或p10等強(qiáng)啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)蛋白的超高表達(dá)，可以達(dá)到細(xì)胞總蛋白的25～50%；3、能有效地進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯的加工，如糖基化、脂酰化和磷酸化；4、桿狀病毒有嚴(yán)格的宿主細(xì)胞專一性，對(duì)脊椎動(dòng)物和植物即不能感染也不能在非宿主細(xì)胞中繁殖或發(fā)生整合，因此十分安全。缺點(diǎn)：1、不能連續(xù)合成重組蛋白，因?yàn)槔ハx(chóng)細(xì)胞感染病毒后4～5天后就死亡，無(wú)法繼續(xù)表達(dá)蛋白；2、多角體蛋白及p10啟動(dòng)子控制的基因表達(dá)是在感染的晚期，所以表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后加工可能是不完全的；3、費(fèi)用昂貴，目前培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞需加胎牛血清，特別是在大規(guī)模懸浮培養(yǎng)時(shí)更增加了生產(chǎn)成本。重組病毒獲得：了解大框架第七講 植物基因工程植物基因工程抗體：是利用基因工程技術(shù)在植物中表達(dá)生產(chǎn)的抗體，即將編碼全抗體或抗體片段的基因?qū)胫参铮谥参镏斜磉_(dá)出具有功能性識(shí)別抗原及結(jié)合特性的全抗體或部分抗體片段。農(nóng)桿菌載體系統(tǒng)：農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌是土壤中的植物病原菌，能感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，分別誘導(dǎo)冠癭瘤和發(fā)狀根。冠癭瘤和發(fā)狀根分別由根癌農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌中的Ri質(zhì)粒引起農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物體的方法葉盤法：將葉圓片放入農(nóng)桿菌菌液一段時(shí)間，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植株；整株感染法：用農(nóng)桿菌感染植株創(chuàng)傷部位，然后無(wú)菌培養(yǎng)癌瘤組織，從愈傷組織分化出轉(zhuǎn)基因植株；共培養(yǎng)法：將原生體（去細(xì)胞壁的植物細(xì)胞）與農(nóng)桿菌一起培養(yǎng)，離心去菌，在選擇培養(yǎng)基上得到轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，最后再生得到轉(zhuǎn)基因植株第八講 蛋白質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)濃度測(cè)定：常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三種凝膠過(guò)濾層析（分子篩層析）：凝膠是具有網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)的顆粒，當(dāng)分子大小不同的蛋白質(zhì)混合液流經(jīng)凝膠裝成的層析柱時(shí)，比凝膠網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)分子進(jìn)入網(wǎng)孔內(nèi)，比凝膠網(wǎng)孔大的蛋白質(zhì)被排阻在外，當(dāng)用溶劑洗脫時(shí)，大分子先被洗脫，小分子后被洗脫親和層析：是利用蛋白質(zhì)分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親合力而得以分離純化的技術(shù)。原理①親和的一對(duì)分子中的一方以共價(jià)鍵形式與不溶性載體相連作為吸附劑。②當(dāng)含有混合組分的樣品通過(guò)時(shí)，只有與該分子有特異親合力的物質(zhì)才能被吸附結(jié)合，其它沒(méi)有親合力的無(wú)關(guān)組分隨緩沖液流出。③改變緩沖液組分，將結(jié)合的親和物洗脫下來(lái)離子交換層析：利用離子交換樹(shù)脂作為支持物，將帶有不同電荷的蛋白進(jìn)行分離的方法。分類：陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、陰離子交換樹(shù)脂。原理：通過(guò)帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換而達(dá)到分離純化目的。第九講干擾素和白細(xì)胞介素干擾素：是由病毒和其他種類的誘導(dǎo)劑，刺激巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及體細(xì)胞所產(chǎn)生的一組復(fù)雜的蛋白質(zhì)。這類蛋白具有多種生物活性，包括抗增殖、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和誘導(dǎo)分化作用。干擾素的生物學(xué)活性：抗病毒（I型）：誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，干擾病毒復(fù)制；增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)病毒感染細(xì)胞殺傷；促進(jìn)MHC-I類分子表達(dá)，增強(qiáng)CTL的殺傷能力抗腫瘤（I型和Ⅱ型）：Ⅰ型：抑制腫瘤病毒的繁殖；抑制細(xì)胞增生、誘導(dǎo)分化、促進(jìn)凋亡；增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞殺傷；Ⅱ型：增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)制、加強(qiáng)免疫監(jiān)督功能免疫調(diào)節(jié)作用（Ⅱ型）：活化巨噬細(xì)胞；促M(fèi)HC-II類分子表達(dá)，提高APC抗原遞呈能力；促M(fèi)HC-I類分子表達(dá)，增強(qiáng)NK和CTL殺傷活性；調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞功能；抑制Th2細(xì)胞分化及細(xì)胞因子合成白細(xì)胞介素（Interleukins，ILs）：是一類由免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等)和相關(guān)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)產(chǎn)生的高活性多功能的低分子量分泌蛋白。白細(xì)胞介素的生物活性：免疫調(diào)節(jié)活性：IL－2、4、5、7、9、10；炎癥介導(dǎo)活性：IL－1、6、8；刺激造血活性：IL－3、11白介素作用特點(diǎn)：多效性，協(xié)同性，重疊性，拮抗性，迅速性，高效性，非特異性第十講 促紅細(xì)胞生成素與集落刺激因子一、※促紅細(xì)胞生成素（EPO）產(chǎn)生部位：胎兒和新生兒——EPO主要由肝臟產(chǎn)生；成人——主要由腎臟產(chǎn)生，約占90％。分泌與調(diào)節(jié)：健康成人血漿中EPO水平為10-20U/L；EPO分泌受負(fù)反饋調(diào)節(jié)，當(dāng)貧血或血氧濃度偏低時(shí)分泌增加。不良反應(yīng)： ①高血壓：初次使用EPO高血壓的發(fā)生率約20%；；EPO糾正貧血后35-45%出現(xiàn)高血壓；35-45% 原來(lái)存在的高血壓加重②血管栓塞，腦梗死③高血壓腦?、馨d癇第十一講 治療性抗體工程藥物基因工程抗體（Geneticengineeringantibody,GEAb）：利用DNA重組技術(shù)，將編碼鼠和人抗體的基因或其片段進(jìn)行切割、拼接或修飾，或直接合成基因序列，插入載體后進(jìn)行表達(dá)。嵌合抗體（美羅華）：用人抗體的恒定區(qū)取代小鼠的恒定區(qū)，保留鼠單抗的可變區(qū)，形成人-鼠嵌合抗體。恒定區(qū)人源化人源化抗體（赫賽?。喊咽罂贵w可變區(qū)的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。關(guān)鍵：確定影響抗原結(jié)合部位的骨架區(qū)氨基酸殘基小分子抗體：Fab、ScFv、dsFv、雙鏈抗體、單域抗體、連接物單鏈可變區(qū)片段ScFv雙鏈抗體：一種雙價(jià)特異性抗體片段，含有2個(gè)不同的抗原識(shí)別模塊能同時(shí)識(shí)別2種不同抗原決定簇的小分子抗體。通常一種對(duì)應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原，另一種對(duì)應(yīng)效應(yīng)成分。完全人抗體：轉(zhuǎn)基因鼠；轉(zhuǎn)染色體鼠（鼠體液免疫系統(tǒng)的“人源化”）第十二講 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概念：狹義：將外源重組基因轉(zhuǎn)染并整合到動(dòng)物受體細(xì)胞基因組中，從而形成在體表達(dá)外源基因的動(dòng)物，稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（Tg）。廣義：通過(guò)對(duì)動(dòng)物基因組的改造和修飾，獲得通?？煞N系傳代的遺傳性狀的動(dòng)物，叫做轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?！D(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要技術(shù)流程：載體的構(gòu)建→原核顯微注射/基因打靶→移至假孕鼠→檢測(cè)子代小鼠→轉(zhuǎn)基因小鼠品系建立乳腺生物反應(yīng)器：指利用動(dòng)物乳腺特異性啟動(dòng)子調(diào)控元件指導(dǎo)外源基因在乳腺中特異性表達(dá)，從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中獲取重組蛋白的一種生物反應(yīng)器。制備：1、構(gòu)建表達(dá)載體 2、獲取受精卵 3、顯微注射 4、移植到假孕母鼠體內(nèi)5、轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定 6、轉(zhuǎn)基因小鼠品系建立第十三講多肽藥物多肽藥物研究開(kāi)發(fā)的幾個(gè)主要方向1、多肽疫苗 2、抗腫瘤 3、抗病毒 4、抗菌肽5、細(xì)胞因子模擬肽 6、多肽導(dǎo)向藥物 7、用于心血管疾病的多肽診斷用多肽多肽藥物的生產(chǎn)方法：①動(dòng)植物組織提取（天然活性多肽） ②蛋白降解（酸、堿降解或酶解）：大豆肽、海參肽等營(yíng)養(yǎng)品③化學(xué)合成：固相合成法 ④基因重組表達(dá)，發(fā)酵生產(chǎn)。第十四章 核酸藥物反義藥物：利用反義技術(shù)研制的藥物稱為反義藥物，通常是指反義寡核苷酸。包括反義DNA、反義RNA、核酶等。其DNA或RNA單鏈片段，具有特定基因或其mRNA互補(bǔ)配對(duì)的堿基序列，可特異性阻斷基因的表達(dá)。反義藥物作用機(jī)制： ①AS-OND與靶標(biāo)RNA雜合后激活RNA酶H，降解mRNA②影響前體mRNA剪切③阻斷蛋白質(zhì)的翻譯（針對(duì)5`帽區(qū)）④作用于polyA位點(diǎn)，影響mRNA穩(wěn)定。⑤反基因作用⑥核酶：具有酶催化活性的RNA分子，可通過(guò)堿基配對(duì)特異性地與相應(yīng)的RNA底物結(jié)合并將其裂解。錘頭型核酶RNA干擾（RNAi）：是指