基因工程抗體gaobo課件

1基因工程抗體INSTITUTEFORIMMUNOBIOLOGYDEPARTMENTOFIMMUNOLOGYBoGao,Ph.D.Email:gaobo@Tel:542371542013-9-301基因工程抗體INSTITUTEFORIMMUNOBIO121888年 Roux/Yersin 白喉外毒素1890年 Behring/Kitasato 抗毒素；血清療法1939年 Tiselius/Kabat g-globulin1959年 Porter Fab、Fc1962年 Edelman H、L1962年 Porter Fab(H+L)、Fc(H)

1975年 Kohler/Milstein McAb1980年 Tonegawa Abdiversity1984年 Sharon Engineeringantibody1989年 Winter/Lerner AntibodyLibraries21888年 Roux/Yersin 白喉外毒素1923EmilvonBehring,

1901,antitoxinsGeoregesKohlerandCesarMilstein,

1984,monoclonalantibodySusumuTonegama,1987,structureofIggeneGeraldEdelmanandRodneyPorter,

1972,structureofantibodyPaulEhrlich,

1908,productionofantibodyNobelPrizewinners3EmilvonBehring,1901,antit34445556667抗體占所有生物技術(shù)藥品的25%2010年440億美元2015年將超過980億美元2011年TOP50的生物藥物14個是抗體藥物，前六位均是抗體藥物抗體相關(guān)信息7抗體占所有生物技術(shù)藥品的25%抗體相關(guān)信息788899910101011111112121213131314141415151516抗體的發(fā)展抗血清的制備：19世紀末，Behring單克隆抗體：1975，Koehler和MilsteinNature1975Aug7;256(5517):495-7Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.

基因工程抗體：1984，Sharon

Nature1984May24-30;309(5966):364-7

ExpressionofaVHCkappachimaericproteininmousemyelomacells.16抗體的發(fā)展抗血清的制備：19世紀末，Behring1617抗血清（多克隆抗體）的制備ForeignproteinsVirusesBacteriaParasitesFungiAntigensBcellBcellactivatedHumoralresponsePlasmacellssecreteantibodies+THcellAntigen+Vertebratebody17抗血清（多克隆抗體）的制備Foreignprotein1718多克隆抗血清對健康人用疫苗進行主動免疫，免疫前（a）和免疫后10天（b）分別采血并對血清蛋白進行凝膠電泳分析。免疫前血清中的球蛋白條帶較寬，免疫之后則相對集中。Bruton氏病患者血清蛋白中的球蛋白條帶缺失（c）。a1a2bg白蛋白球蛋白（c）（a）（b）18多克隆抗血清對健康人用疫苗進行主動免疫，免疫前（a）和免1819小鼠體系：半衰期短、HAMA大鼠體系：單抗腹水比小鼠高10倍，易親合層析人體系：人－鼠雜交瘤、人－人雜交瘤

單克隆抗體的制備19小鼠體系：半衰期短、HAMA單克隆抗體的制備1920202021

雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)DNA合成的途徑：氨基喋呤(Aminopterin,A)糖+氨基酸核苷酸胸腺嘧啶核苷(Thymidine,T)TKTMP次黃嘌呤IMPHGPRT核苷酸前體DNA(Hypoxanthine,H)21雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)DNA合成的途徑：氨基喋呤(Am2122融合后細胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況脾細胞〔HGPRT+,TK+,不能長期生長〕骨髓瘤細胞〔HGPRT-,TK-，不能生長〕雜交瘤細胞〔HGPRT+,TK+，能夠生長〕22融合后細胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況2223蛇毒單抗的制備23蛇毒單抗的制備2324242425鼠源單克隆抗體的應用基礎(chǔ)研究細胞抗原研究及鑒定分類細胞受體研究分子克隆及功能研究醫(yī)學研究及診斷感染性疾病診斷腫瘤診斷及預后判斷其它診斷及研究不足：半衰期短、人抗鼠抗體反應（HAMA）25鼠源單克隆抗體的應用基礎(chǔ)研究細胞抗原研究及鑒定分類細胞受2526

將制備單抗的細胞工程技術(shù)與生產(chǎn)重組分子的基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)結(jié)合起來，對編碼抗體的基因按不同需要進行加工改造和重新組裝，轉(zhuǎn)染適當?shù)氖荏w細胞后表達出抗體分子，這種經(jīng)基因重組的抗體稱為基因工程抗體?；蚬こ炭贵w概念26將制備單抗的細胞工程技術(shù)與生產(chǎn)重組分子的基因工程26271.從雜交瘤或免疫脾細胞、外周血淋巴細胞等提取mRNA

逆轉(zhuǎn)錄成cDNA2.PCR分別擴增出抗體的重鏈及輕鏈基因3.構(gòu)建表達載體4.在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_并折疊成有功能的抗體分子5.篩選出高表達細胞株6.親和層折等手段純化抗體片段基因工程抗體基本原理271.從雜交瘤或免疫脾細胞、外周血淋巴細胞等提取mRNA2728基因工程抗體人源化(Humanization)抗體28基因工程抗體人源化(Humanization)抗體2829Humanization

（Chimeric/ReshapedAntibody)Constantregion(Fc)MouseantibodyAntigen-bindingregion(Fab)Antigen-bindingregionsfrommouseSpecifivantigen-bindingsitesfrommouseChimericantibody(66%)Fullyhuamnantibody(100%)Humanizedantibody(90%)29Humanization（Chimeric/Resha2930FR：為CDR的構(gòu)象提供環(huán)境；參與抗體結(jié)合位點正確構(gòu)象的形成；簡單的CDR移植會喪失或降低原親本抗體的親和力方法：模板替換 較大同源性人FR替換鼠FR

表面重塑 對鼠CDR及FR表面殘基鑲飾或重飾－類似人補償變換 CDR移植后更換部分的人FR－鼠定位保留 以人FR保守序列為模板進行人源化

人源化抗體的構(gòu)建策略30FR：為CDR的構(gòu)象提供環(huán)境；參與抗體結(jié)合位點正確構(gòu)象的3031從同源抗體或抗體的共同序列中選擇人源FR確定在FR中起關(guān)鍵作用的氨基酸以鼠單抗可變區(qū)的立體模型作指導人源化抗體的構(gòu)建策略關(guān)鍵目標保持抗體的親和力降低免疫原性31從同源抗體或抗體的共同序列中選擇人源FR人源化抗體的構(gòu)建3132

從分泌某種鼠單抗的雜交瘤細胞基因組中分離并鑒定出重排的功能性V區(qū)基因，并與人抗體C區(qū)基因按一定的方式重組，克隆到表達載體中構(gòu)建鼠－人嵌合的輕重鏈基因表達載體，再轉(zhuǎn)入宿主細胞表達，經(jīng)篩選后制備成特異性的嵌合抗體。人－鼠嵌合抗體概念32從分泌某種鼠單抗的雜交瘤細胞基因組中分離3233PCR鼠抗體基因人抗體基因VLCLVHCH1CH2CH3VLCLVHCH1CH2CH3嵌合輕鏈嵌合重鏈IgG33PCR鼠抗體基因人抗體基因VLCLVH3334人－鼠嵌合抗體特點完全保留鼠單抗的特異性和親和力降低了HAMA不良反應一定的免疫原性，V區(qū)完全鼠源性34人－鼠嵌合抗體特點完全保留鼠單抗的特異性和親和力降低3435改型抗體

抗體分子輕、重鏈可變區(qū)的6個CDR形成CDR平面直接接觸抗原，決定了抗體的特異性，骨架區(qū)只是作為支持CDR襻的支架，而且其立體構(gòu)象極為保守。因此，將鼠單抗的CDR移植到人單抗的骨架區(qū)上，有可能使人單抗獲得鼠單抗的特異性，并最大限度地減少鼠單抗的異源性，僅有9%的序列來源于親本鼠單抗，這種CDR移植的人單抗稱為改型抗體。35改型抗體抗體分子輕、重鏈可變區(qū)的6個CDR形成CDR3536CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體（改型抗體）鼠單克隆V區(qū)人源化（CDR移植）36CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體（3637治療性抗體的開發(fā)幾經(jīng)反復終于形成蓬勃發(fā)展-——鼠單抗人源化的技術(shù)功不可沒。

鼠單抗人源化時基本選擇IgG同種型，在體內(nèi)IgG與存在于內(nèi)皮細胞表面的受體FcRn相互作用，在細胞內(nèi)受到保護不被降解而具有較長的半衰期。同時鼠IgG通過激活補體和結(jié)合Fc受體激發(fā)一系列生物效應功能的效率較低，無論是嵌合抗體還是改型抗體均通過使用人恒定區(qū)克服了這一缺陷。人源化抗體的評價37治療性抗體的開發(fā)幾經(jīng)反復終于形成蓬勃發(fā)展-——鼠單抗人源3738對于人源化的最主要的初衷，消除異源性的評價卻要復雜的多。除了降低抗體分子的鼠源序列外，其免疫原性還受到其它因素如給予抗體的途徑和劑量、病人的病情和免疫狀況、抗體所針對的抗原的特性和部位以及抗體本身激活生物學效應的特性等均相關(guān)，因此應該綜合考慮。人源化抗體的評價38對于人源化的最主要的初衷，消除異源性的評價卻要復雜的多。3839不同種屬之間抗體分子可變區(qū)的差別遠低于恒定區(qū)的差別；構(gòu)建改型抗體要比構(gòu)建嵌合抗體的工作量大的多，還常常導致親和力不同程度的降低，付出親和力和增加研制成本的代價是否值得的問題。人源化抗體的評價改型抗體相對于嵌合抗體的優(yōu)越性存在質(zhì)疑：39不同種屬之間抗體分子可變區(qū)的差別遠低于恒定區(qū)的差別；人源3940應當制備配對的改型和嵌合抗體，用于足夠量的可比較的人群，觀察其誘發(fā)抗抗體的生成情況，這是難以做到的。迄今大量臨床應用的情況揭示其他影響免疫原性的因素值得重視，因此一味追求序列的同源性而摒棄嵌合抗體是值得商榷的。事實上即使完全人源化的抗體也可以誘發(fā)抗獨特型抗體，并不可能完全消除治療性抗體的免疫原性，而這種抗獨特型反應的后果如何待進一步觀察。人源化抗體的評價欲確切評判人源化對免疫原性的影響：40應當制備配對的改型和嵌合抗體，用于足夠量的可比較的人群，4041V區(qū)片斷，1/3～1/80，具有與抗原結(jié)合的功能種類：Fab抗體單鏈抗體（ScFv）

Fv片斷抗體單域抗體SDAb

最小識別單位MRU小分子抗體41V區(qū)片斷，1/3～1/80，具有與抗原結(jié)合的功能小分子抗4142(1)小分子抗體42(1)小分子抗體4243組成：由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與輕鏈二硫鍵連接，50KD，為完整IgG的1/3。應用前景：較好的滲透性和藥代動力學特征

HAMA反應存在親和力較低、穩(wěn)定性差Fab抗體43組成：由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與輕鏈二硫鍵連接，50KD4344將抗體分子的重鏈V區(qū)和CH1功能區(qū)的cDNA與輕鏈完整的cDNA序列重組并克隆到適當?shù)谋磉_載體中在大腸桿菌等宿主細胞中表達整個制備過程包括Fab抗體基因的擴增，表達載體的構(gòu)建、表達及產(chǎn)物鑒定基因工程手段構(gòu)建Fab抗體的原理44將抗體分子的重鏈V區(qū)和CH1功能區(qū)的cDNA與輕鏈完整的4445Fab抗體基因的擴增方法Fab基因擴增的方法主要有二種：

采用PCR技術(shù)直接從基因組中擴增，但這種方法不確定的影響因素較多。通過RT-PCR技術(shù)從cDNA中擴增

兩種方法成功的關(guān)鍵均取決于PCR引物的設(shè)計。不同F(xiàn)ab抗體引物的設(shè)計有所不同，但一般均使用同源性較高的序列，其中5’端的引物必須包含克隆位點，3’端的引物除克隆位點外還應含有翻譯終止信號。45Fab抗體基因的擴增方法Fab基因擴增的方法主要有二種：4546免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈表達載體L鏈表達載體共轉(zhuǎn)染細胞PrVHCH1PrVLCLFab抗體分子的制備Fab抗體46免疫球蛋白H鏈表達載體L鏈表達載體共轉(zhuǎn)染細胞Pr4647抗體分泌細胞VHVLCL-S-S-CH1Fab抗體分子的制備Fab抗體47抗體分泌細胞VHVLCL-S-S-CH1Fab抗體分子4748單鏈抗體（ScFv）組成特點VH和VL通過連接肽重組表達分子量小、穿透力強、體內(nèi)循環(huán)半衰期短、免疫原性低可作為其它抗體的基本元件48單鏈抗體（ScFv）組成特點VH和VL通過連接肽4849

單鏈抗體基因的構(gòu)建一般采用從雜交瘤細胞提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過PCR擴增其VL及VH基因，再用人工合成的寡核苷酸序列即接頭把VL的C端與VH的N端或VH的C端與VL的N端連接，即成單鏈抗體基因。

單鏈抗體（ScFv）構(gòu)建方法49單鏈抗體基因的構(gòu)建一般采用從雜交瘤細胞提取mRN4950VHVL接頭DNA(Gly4Ser)3VH引物PCRVH接頭DNA酶切、克隆ScFv(singlechainFv,scFv)的構(gòu)建變性、復性VL引物VL單鏈抗體（ScFv）50VH5051單鏈ScFv：抗原含重復抗原決定簇時，親和力下降8倍以上雙價ScFv：改善ScFv的親和活性雙特異性ScFv：與細胞因子IL-2、TNF相連：特異性殺傷應用前景51單鏈ScFv：抗原含重復抗原決定簇時，親和力下降8倍以上5152保持抗體的可溶性接頭：長度、V區(qū)空間結(jié)構(gòu)組成單域抗體一個VH或VL功能結(jié)構(gòu)域特點分子量小Ig分子的1/12、抗原性弱、穿透力強抗原性弱、相對較粘（疏水面的暴露有關(guān)。在全抗體分子中，疏水面被VL遮蓋）細菌LPS的單域抗體在雜交瘤細胞中的表達量比親本單克隆抗體高50倍以上設(shè)計原則52保持抗體的可溶性組成單域抗體一個VH或VL功能結(jié)構(gòu)域5253最小識別單位(minimalrecognitionunit,MRU)組成高多變區(qū)多肽（hypervariableregionpolypeptides,HRP）一個CDR多肽特點設(shè)計原理應用16－30氨基酸、抗原性弱、穿透力強非特異性吸附每個CDR的作用不同尋找在抗原識別和親和力方面有重要意義的CDR抗血小板纖維蛋白原受體CDR3，抑制纖維蛋白原、PACI與血小板的結(jié)合 53最小識別單位(minimalrecognitionu5354傳統(tǒng)單抗分子量大，穿透力弱基因工程小分子抗體穿透力強，親和力低多價微型抗體 雙鏈抗體（diabody） 雙特異性抗體（bispecificantibody） 微型抗體（minibody） 三鏈抗體（triabody） 四鏈抗體（tetrabody）多價微型抗體54傳統(tǒng)單抗分子量大，穿透力弱多價微型抗體5455VL－VH－CH380kD易于構(gòu)建及生產(chǎn)血中停留時間長靶部位吸收好

CH3-dimerizedscFVCH3CH3微型抗體55VL－VH－CH3CH3-dimerizedscF5556LD型LDLEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSGFlex型連接肽序列VHVLVHVLCH356LD型LEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSG5657價肽取決于連接肽段所形成的聚合物特性多價ScFv與單價ScFv和Fab片斷相比，與靶抗原結(jié)合的功能親和力提高四鏈抗體4helix-stabilizedscFvtetramers57價肽取決于連接肽段所形成的聚合物特性多價ScFv與單價S5758Leucine-zipperstabilizedscFvdimersHelix-stabilizedscFvdimers4helix-stabilizedscFvtetramersStreptavidin-scFvscFvfusionswithdi-andmultimeriaztiondomains58Leucine-zipperstabilizedsc5859雙鏈抗體的分子量為60KD左右，三鏈抗體為90KD左右，二者均顯著大于ScFv單體的分子量(約30KD)。因而在體內(nèi)應用多價微抗時，可以降低抗體在循環(huán)中的清除速度，但這種優(yōu)勢也可能因穿透能力的降低而抵消。雙鏈抗體和三鏈抗體的較短接頭不易被蛋白酶水解，而單價ScFv的較長接頭卻易被水解。多價ScFv與單價ScFv和Fab片段比較，最突出的特點是與靶抗原結(jié)合的功能親合力提高。ScFv多聚體能同時結(jié)合幾個靶抗原，也可多價結(jié)合于癌細胞的表面，因而具有較高的親和力。單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體及多價抗體的比較59雙鏈抗體的分子量為60KD左右，三鏈抗體為90KD左右，5960

人-鼠嵌合抗體 鼠源V區(qū)或Fab 15025%~30%

人源C區(qū)或Fc改型抗體 以鼠源CDR 15015%

替換人源CDR雙特異性抗體 異源性H2/L2 150－小分子抗體Fab 完整L和部分H 50 15％Fv VH和VL 25 15％單鏈抗體 VH-連接肽-VL 26 15％單域抗體 VH 12.5 7.5％最小識別單位 單一CDR 2 1.5％基因工程抗體的種類及其特性種類基本結(jié)構(gòu)相對分子量（kD）鼠源性成分60

人-鼠嵌合抗體 鼠源V區(qū)或Fab 6061BsAb，兩個不同的VL和VH－兩個不同的抗原結(jié)合位點雙特異性抗體61BsAb，兩個不同的VL和VH－兩個不同的抗原結(jié)合位點雙6162CTLCD3TUMORCELL-S-S-VHCH1VL-S-S-CH1抗原A抗原B雙特異性抗體62CTLCD3TUMOR-S-S-VHCH1VL-S-S-6263雙特異性抗體63雙特異性抗體63641.高效的表達、篩選抗體的體系

將表型（與抗原特異結(jié)合）和基因型（含有片段抗體基因）聯(lián)系起來，使識別抗原的能力與進行再擴增的能力結(jié)合在一起，可以模擬生物體內(nèi)B細胞的有關(guān)特性—識別與擴增的統(tǒng)一。2.繞過免疫制備全人源性抗體，避免了鼠源性抗體在人體應用時誘發(fā)的HAMA等不良反應。噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)及噬菌體抗體的研制成功已成為生命科學研究的突破性進展之一。噬菌體抗體特色641.高效的表達、篩選抗體的體系噬菌體抗體特色6465

以噬菌體為載體，將抗體基因(Fab或ScFv基因等)與噬菌體編碼的外殼蛋白Ⅲ(cpⅢ)或Ⅷ(cpⅧ)相連，在噬菌體表面以抗體-外殼蛋白融合蛋白的形式表達；經(jīng)輔助病毒感染后，借助cpⅢ的信號肽穿膜作用，進入宿主外周基質(zhì)，在正確折疊后被包裝于噬菌體尾部，隨后攜帶有表達載體的宿主菌就會釋放出帶有抗體片段的噬菌體顆粒；這種噬菌體抗體可以特異識別抗原，又能感染宿主菌進行再擴增；采用類似于親和層析原理從噬菌體抗體庫中篩選出特異性抗體。噬菌體抗體基本原理65以噬菌體為載體，將抗體基因(Fab或ScFv基因65661InsertFabgenesintophages2Infectedbacteriamakenewphages3Screenthephagesspecifictotheantigen4Addtheselectedphagesbacktobacteria5PuttheFabontoAbbackbonesPhage-displacecanbeusedinsteadofhybridomas噬菌體抗體661InsertFabgenesintopha6667噬菌體抗體的克隆和表達antigenantigenRepertoireofdiversesequencesdisplayedonphageIncubationofphage-displayedrepertoirewithantigenEliminationofunboundphageElutionofboundphageSelectionofligandsfromphage-displaylibraries67噬菌體抗體的克隆和表達antigenantigenRep6768

噬菌體抗體庫技術(shù)的產(chǎn)生主要依賴于三項實驗技術(shù)的發(fā)展：1.PCR技術(shù)的發(fā)展使人們可以用一組引物克隆出全套Ig

的可變區(qū)基因。目前已設(shè)計出了多套擴增VH和VL基因的引物。2.從大腸桿菌內(nèi)分泌有結(jié)合功能的Ig分子片段獲得成功。這一成功說明了用抗體庫在原核細胞篩選特異性抗體的可行性。噬菌體抗體68噬菌體抗體庫技術(shù)的產(chǎn)生主要依賴于三項實驗技術(shù)的發(fā)68693.有效的篩選系統(tǒng)（噬菌體表面表達技術(shù)）的建立將肽鏈通過與單鏈噬菌體外殼蛋白（pⅢ或pⅧ）融合表達在絲狀噬菌體（fd、M13）的表面，利用其可以再擴增的特性，將靶分子固定化，通過親和篩選-洗脫-擴增，可篩選到靶分子的配體肽鏈或Fab段。

兩種絲狀噬菌體呈現(xiàn)系統(tǒng)，外殼蛋白cpIII系統(tǒng)及cpVII系統(tǒng)。其中cpVIII系統(tǒng)是一種多價選擇系統(tǒng),可同時呈現(xiàn)多達2O00拷貝/噬菌體的多拷貝結(jié)合蛋白，因而可以大大提高親和力較低的抗體片段的整體親和性，更有利于篩選得到陽性克隆cpIII產(chǎn)物僅約4拷貝／噬菌體，為單價選擇系統(tǒng)，因而篩選獲得的抗體親和力一般較高。噬菌體抗體693.有效的篩選系統(tǒng)（噬菌體表面表達技術(shù)）的建立噬菌體抗6970篩選技術(shù)的發(fā)展篩選抗細胞表面抗原抗體抗原陰性細胞（antigen-negativecell）作為非特異性噬菌體的吸附體

e.g.以人血細胞Rh(D)+為靶細胞，Rh(D)-為非特異性噬菌體吸附體，從而成功地從Fab噬菌體抗體庫中篩選出一系列的抗Rh(D)抗體。噬菌體抗體的克隆和表達70篩選技術(shù)的發(fā)展噬菌體抗體的克隆和表達7071高親和力抗體的獲得

1.模擬體內(nèi)親和力成熟的過程定點突變、模擬體內(nèi)過程，先造成大量的隨機突變，再經(jīng)抗原選擇、在致突變株體內(nèi)進行突變、半隨機突變法2.鏈更替固定VH基因而置換選擇VL基因選出匹配最好的高親和力的VH—VL組合(親和力提高20倍)

固定H3—VL基因而置換選擇H1一H2基因(親和力提高15倍)

將H1一H2節(jié)段(庫)與單一H3-VL基因連接(不用接頭)噬菌體抗體的克隆和表達71高親和力抗體的獲得噬菌體抗體的克隆和表達7172高親和力抗體的獲得

3.增加抗體庫的多樣性聯(lián)合感染技術(shù)(combinatorialinfection)增加鏈組合105不同的輕鏈、107不同的重鏈，用聯(lián)合感染技術(shù)，經(jīng)CoxP位點使兩鏈在體外有效地組合在同一噬菌體中，這就可以直接分離獲得庫容量為1012的高親和力抗體；提高噬菌粒的包裝滴度和提高細菌的轉(zhuǎn)化效率、構(gòu)建載體時酶切位點的合理選擇，以及PCR引物的設(shè)計等進行。4.分子伴侶輔助噬菌體抗體表達噬菌體抗體的克隆和表達72高親和力抗體的獲得噬菌體抗體的克隆和表達7273應用之一：醫(yī)學微生物學研究

針對病原微生物的抗體，如HAV、HBV、HCV、HIV、風疹病毒、CMV、流感嗜血桿菌和破傷風毒素

HIV感染者體內(nèi)抗體水平高而抗病毒反應弱？Burton等噬菌體抗體庫（長期無癥狀HIV攜帶者骨髓）－篩選出一批抗HIV胞膜蛋白的特異性抗體中和性抗體識別的是天然構(gòu)象的抗原（病毒顆粒）,非中和性抗體識別的為變性的包膜蛋白(病毒碎片)。抗HIV-1抗體由病毒裂解物中未經(jīng)加工的gp160激發(fā)，與天然構(gòu)象的gp120發(fā)生交叉反應，但親和力較低，而且對gp120本身所激發(fā)的抗體反應有抑制作用。因此,感染者體內(nèi)抗體滴度雖高卻不能有效地清除病毒顆粒。噬菌體抗體的克隆和表達73應用之一：醫(yī)學微生物學研究噬菌體抗體的克隆和表達7374應用之二：自身免疫性疾病的研究

噬菌體抗體庫獲得大量自身抗體

1993～1995年間:IgG類自身抗體有64種（49種噬菌體抗體庫）1996年、Mclntosh等從抗體庫中一次性得到19種抗甲狀腺球蛋白的人單抗。以人自身抗體為探針分析自身免疫疾病患者血清中自身抗體的“表位指紋”(epitopicfingerprint)，有助于了解B細胞表位和疾病表現(xiàn)之間的關(guān)系。通過分析自身抗體可變區(qū)的編碼基因，能夠了解此類抗體的基因取用規(guī)律。E.g.從橋本氏甲狀腺炎病人頸淋巴結(jié)抗體庫中得到的抗甲狀腺球蛋白抗體基因明顯存在限制性取用，其親和力高低與體細胞突變水平直接相關(guān)。噬菌體抗體的克隆和表達74應用之二：自身免疫性疾病的研究噬菌體抗體的克隆和表達7475應用之三：腫瘤研究

利用腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原篩選噬菌體抗體庫,能夠得到特異性人單抗，并有助于腫瘤的診斷和治療。癌胚抗原(CEA)的特異性ScFv，親和力提高了10倍。

c-erbB-2人單鏈抗體可用于腫瘤打靶。噬菌體抗體的克隆和表達75應用之三：腫瘤研究噬菌體抗體的克隆和表達7576應用之四：診斷和治療

噬菌體抗體庫技術(shù)與單抗技術(shù)相比，其優(yōu)勢在于能夠制備人單抗；抗體靶向治療是腫瘤治療的一種新而重要的手段；用噬菌體抗體制備的免疫毒素具有良好的穩(wěn)定性；用噬菌體抗體技術(shù)已研制出抗EGFRVⅢ的免疫毒素，其具有高度的特異性及良好的穩(wěn)定性噬菌體抗體的克隆和表達76應用之四：診斷和治療噬菌體抗體的克隆和表達7677Thankyou!77Thankyou!7778基因工程抗體INSTITUTEFORIMMUNOBIOLOGYDEPARTMENTOFIMMUNOLOGYBoGao,Ph.D.Email:gaobo@Tel:542371542013-9-301基因工程抗體INSTITUTEFORIMMUNOBIO78791888年 Roux/Yersin 白喉外毒素1890年 Behring/Kitasato 抗毒素；血清療法1939年 Tiselius/Kabat g-globulin1959年 Porter Fab、Fc1962年 Edelman H、L1962年 Porter Fab(H+L)、Fc(H)

1975年 Kohler/Milstein McAb1980年 Tonegawa Abdiversity1984年 Sharon Engineeringantibody1989年 Winter/Lerner AntibodyLibraries21888年 Roux/Yersin 白喉外毒素197980EmilvonBehring,

1901,antitoxinsGeoregesKohlerandCesarMilstein,

1984,monoclonalantibodySusumuTonegama,1987,structureofIggeneGeraldEdelmanandRodneyPorter,

1972,structureofantibodyPaulEhrlich,

1908,productionofantibodyNobelPrizewinners3EmilvonBehring,1901,antit8081481825828368384抗體占所有生物技術(shù)藥品的25%2010年440億美元2015年將超過980億美元2011年TOP50的生物藥物14個是抗體藥物，前六位均是抗體藥物抗體相關(guān)信息7抗體占所有生物技術(shù)藥品的25%抗體相關(guān)信息84858858698687108788118889128990139091149192159293抗體的發(fā)展抗血清的制備：19世紀末，Behring單克隆抗體：1975，Koehler和MilsteinNature1975Aug7;256(5517):495-7Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.

基因工程抗體：1984，Sharon

Nature1984May24-30;309(5966):364-7

ExpressionofaVHCkappachimaericproteininmousemyelomacells.16抗體的發(fā)展抗血清的制備：19世紀末，Behring9394抗血清（多克隆抗體）的制備ForeignproteinsVirusesBacteriaParasitesFungiAntigensBcellBcellactivatedHumoralresponsePlasmacellssecreteantibodies+THcellAntigen+Vertebratebody17抗血清（多克隆抗體）的制備Foreignprotein9495多克隆抗血清對健康人用疫苗進行主動免疫，免疫前（a）和免疫后10天（b）分別采血并對血清蛋白進行凝膠電泳分析。免疫前血清中的球蛋白條帶較寬，免疫之后則相對集中。Bruton氏病患者血清蛋白中的球蛋白條帶缺失（c）。a1a2bg白蛋白球蛋白（c）（a）（b）18多克隆抗血清對健康人用疫苗進行主動免疫，免疫前（a）和免9596小鼠體系：半衰期短、HAMA大鼠體系：單抗腹水比小鼠高10倍，易親合層析人體系：人－鼠雜交瘤、人－人雜交瘤

單克隆抗體的制備19小鼠體系：半衰期短、HAMA單克隆抗體的制備9697209798

雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)DNA合成的途徑：氨基喋呤(Aminopterin,A)糖+氨基酸核苷酸胸腺嘧啶核苷(Thymidine,T)TKTMP次黃嘌呤IMPHGPRT核苷酸前體DNA(Hypoxanthine,H)21雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)DNA合成的途徑：氨基喋呤(Am9899融合后細胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況脾細胞〔HGPRT+,TK+,不能長期生長〕骨髓瘤細胞〔HGPRT-,TK-，不能生長〕雜交瘤細胞〔HGPRT+,TK+，能夠生長〕22融合后細胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況99100蛇毒單抗的制備23蛇毒單抗的制備10010124101102鼠源單克隆抗體的應用基礎(chǔ)研究細胞抗原研究及鑒定分類細胞受體研究分子克隆及功能研究醫(yī)學研究及診斷感染性疾病診斷腫瘤診斷及預后判斷其它診斷及研究不足：半衰期短、人抗鼠抗體反應（HAMA）25鼠源單克隆抗體的應用基礎(chǔ)研究細胞抗原研究及鑒定分類細胞受102103

將制備單抗的細胞工程技術(shù)與生產(chǎn)重組分子的基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)結(jié)合起來，對編碼抗體的基因按不同需要進行加工改造和重新組裝，轉(zhuǎn)染適當?shù)氖荏w細胞后表達出抗體分子，這種經(jīng)基因重組的抗體稱為基因工程抗體?；蚬こ炭贵w概念26將制備單抗的細胞工程技術(shù)與生產(chǎn)重組分子的基因工程1031041.從雜交瘤或免疫脾細胞、外周血淋巴細胞等提取mRNA

逆轉(zhuǎn)錄成cDNA2.PCR分別擴增出抗體的重鏈及輕鏈基因3.構(gòu)建表達載體4.在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_并折疊成有功能的抗體分子5.篩選出高表達細胞株6.親和層折等手段純化抗體片段基因工程抗體基本原理271.從雜交瘤或免疫脾細胞、外周血淋巴細胞等提取mRNA104105基因工程抗體人源化(Humanization)抗體28基因工程抗體人源化(Humanization)抗體105106Humanization

（Chimeric/ReshapedAntibody)Constantregion(Fc)MouseantibodyAntigen-bindingregion(Fab)Antigen-bindingregionsfrommouseSpecifivantigen-bindingsitesfrommouseChimericantibody(66%)Fullyhuamnantibody(100%)Humanizedantibody(90%)29Humanization（Chimeric/Resha106107FR：為CDR的構(gòu)象提供環(huán)境；參與抗體結(jié)合位點正確構(gòu)象的形成；簡單的CDR移植會喪失或降低原親本抗體的親和力方法：模板替換 較大同源性人FR替換鼠FR

表面重塑 對鼠CDR及FR表面殘基鑲飾或重飾－類似人補償變換 CDR移植后更換部分的人FR－鼠定位保留 以人FR保守序列為模板進行人源化

人源化抗體的構(gòu)建策略30FR：為CDR的構(gòu)象提供環(huán)境；參與抗體結(jié)合位點正確構(gòu)象的107108從同源抗體或抗體的共同序列中選擇人源FR確定在FR中起關(guān)鍵作用的氨基酸以鼠單抗可變區(qū)的立體模型作指導人源化抗體的構(gòu)建策略關(guān)鍵目標保持抗體的親和力降低免疫原性31從同源抗體或抗體的共同序列中選擇人源FR人源化抗體的構(gòu)建108109

從分泌某種鼠單抗的雜交瘤細胞基因組中分離并鑒定出重排的功能性V區(qū)基因，并與人抗體C區(qū)基因按一定的方式重組，克隆到表達載體中構(gòu)建鼠－人嵌合的輕重鏈基因表達載體，再轉(zhuǎn)入宿主細胞表達，經(jīng)篩選后制備成特異性的嵌合抗體。人－鼠嵌合抗體概念32從分泌某種鼠單抗的雜交瘤細胞基因組中分離109110PCR鼠抗體基因人抗體基因VLCLVHCH1CH2CH3VLCLVHCH1CH2CH3嵌合輕鏈嵌合重鏈IgG33PCR鼠抗體基因人抗體基因VLCLVH110111人－鼠嵌合抗體特點完全保留鼠單抗的特異性和親和力降低了HAMA不良反應一定的免疫原性，V區(qū)完全鼠源性34人－鼠嵌合抗體特點完全保留鼠單抗的特異性和親和力降低111112改型抗體

抗體分子輕、重鏈可變區(qū)的6個CDR形成CDR平面直接接觸抗原，決定了抗體的特異性，骨架區(qū)只是作為支持CDR襻的支架，而且其立體構(gòu)象極為保守。因此，將鼠單抗的CDR移植到人單抗的骨架區(qū)上，有可能使人單抗獲得鼠單抗的特異性，并最大限度地減少鼠單抗的異源性，僅有9%的序列來源于親本鼠單抗，這種CDR移植的人單抗稱為改型抗體。35改型抗體抗體分子輕、重鏈可變區(qū)的6個CDR形成CDR112113CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體（改型抗體）鼠單克隆V區(qū)人源化（CDR移植）36CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體（113114治療性抗體的開發(fā)幾經(jīng)反復終于形成蓬勃發(fā)展-——鼠單抗人源化的技術(shù)功不可沒。

鼠單抗人源化時基本選擇IgG同種型，在體內(nèi)IgG與存在于內(nèi)皮細胞表面的受體FcRn相互作用，在細胞內(nèi)受到保護不被降解而具有較長的半衰期。同時鼠IgG通過激活補體和結(jié)合Fc受體激發(fā)一系列生物效應功能的效率較低，無論是嵌合抗體還是改型抗體均通過使用人恒定區(qū)克服了這一缺陷。人源化抗體的評價37治療性抗體的開發(fā)幾經(jīng)反復終于形成蓬勃發(fā)展-——鼠單抗人源114115對于人源化的最主要的初衷，消除異源性的評價卻要復雜的多。除了降低抗體分子的鼠源序列外，其免疫原性還受到其它因素如給予抗體的途徑和劑量、病人的病情和免疫狀況、抗體所針對的抗原的特性和部位以及抗體本身激活生物學效應的特性等均相關(guān)，因此應該綜合考慮。人源化抗體的評價38對于人源化的最主要的初衷，消除異源性的評價卻要復雜的多。115116不同種屬之間抗體分子可變區(qū)的差別遠低于恒定區(qū)的差別；構(gòu)建改型抗體要比構(gòu)建嵌合抗體的工作量大的多，還常常導致親和力不同程度的降低，付出親和力和增加研制成本的代價是否值得的問題。人源化抗體的評價改型抗體相對于嵌合抗體的優(yōu)越性存在質(zhì)疑：39不同種屬之間抗體分子可變區(qū)的差別遠低于恒定區(qū)的差別；人源116117應當制備配對的改型和嵌合抗體，用于足夠量的可比較的人群，觀察其誘發(fā)抗抗體的生成情況，這是難以做到的。迄今大量臨床應用的情況揭示其他影響免疫原性的因素值得重視，因此一味追求序列的同源性而摒棄嵌合抗體是值得商榷的。事實上即使完全人源化的抗體也可以誘發(fā)抗獨特型抗體，并不可能完全消除治療性抗體的免疫原性，而這種抗獨特型反應的后果如何待進一步觀察。人源化抗體的評價欲確切評判人源化對免疫原性的影響：40應當制備配對的改型和嵌合抗體，用于足夠量的可比較的人群，117118V區(qū)片斷，1/3～1/80，具有與抗原結(jié)合的功能種類：Fab抗體單鏈抗體（ScFv）

Fv片斷抗體單域抗體SDAb

最小識別單位MRU小分子抗體41V區(qū)片斷，1/3～1/80，具有與抗原結(jié)合的功能小分子抗118119(1)小分子抗體42(1)小分子抗體119120組成：由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與輕鏈二硫鍵連接，50KD，為完整IgG的1/3。應用前景：較好的滲透性和藥代動力學特征

HAMA反應存在親和力較低、穩(wěn)定性差Fab抗體43組成：由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與輕鏈二硫鍵連接，50KD120121將抗體分子的重鏈V區(qū)和CH1功能區(qū)的cDNA與輕鏈完整的cDNA序列重組并克隆到適當?shù)谋磉_載體中在大腸桿菌等宿主細胞中表達整個制備過程包括Fab抗體基因的擴增，表達載體的構(gòu)建、表達及產(chǎn)物鑒定基因工程手段構(gòu)建Fab抗體的原理44將抗體分子的重鏈V區(qū)和CH1功能區(qū)的cDNA與輕鏈完整的121122Fab抗體基因的擴增方法Fab基因擴增的方法主要有二種：

采用PCR技術(shù)直接從基因組中擴增，但這種方法不確定的影響因素較多。通過RT-PCR技術(shù)從cDNA中擴增

兩種方法成功的關(guān)鍵均取決于PCR引物的設(shè)計。不同F(xiàn)ab抗體引物的設(shè)計有所不同，但一般均使用同源性較高的序列，其中5’端的引物必須包含克隆位點，3’端的引物除克隆位點外還應含有翻譯終止信號。45Fab抗體基因的擴增方法Fab基因擴增的方法主要有二種：122123免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈表達載體L鏈表達載體共轉(zhuǎn)染細胞PrVHCH1PrVLCLFab抗體分子的制備Fab抗體46免疫球蛋白H鏈表達載體L鏈表達載體共轉(zhuǎn)染細胞Pr123124抗體分泌細胞VHVLCL-S-S-CH1Fab抗體分子的制備Fab抗體47抗體分泌細胞VHVLCL-S-S-CH1Fab抗體分子124125單鏈抗體（ScFv）組成特點VH和VL通過連接肽重組表達分子量小、穿透力強、體內(nèi)循環(huán)半衰期短、免疫原性低可作為其它抗體的基本元件48單鏈抗體（ScFv）組成特點VH和VL通過連接肽125126

單鏈抗體基因的構(gòu)建一般采用從雜交瘤細胞提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過PCR擴增其VL及VH基因，再用人工合成的寡核苷酸序列即接頭把VL的C端與VH的N端或VH的C端與VL的N端連接，即成單鏈抗體基因。

單鏈抗體（ScFv）構(gòu)建方法49單鏈抗體基因的構(gòu)建一般采用從雜交瘤細胞提取mRN126127VHVL接頭DNA(Gly4Ser)3VH引物PCRVH接頭DNA酶切、克隆ScFv(singlechainFv,scFv)的構(gòu)建變性、復性VL引物VL單鏈抗體（ScFv）50VH127128單鏈ScFv：抗原含重復抗原決定簇時，親和力下降8倍以上雙價ScFv：改善ScFv的親和活性雙特異性ScFv：與細胞因子IL-2、TNF相連：特異性殺傷應用前景51單鏈ScFv：抗原含重復抗原決定簇時，親和力下降8倍以上128129保持抗體的可溶性接頭：長度、V區(qū)空間結(jié)構(gòu)組成單域抗體一個VH或VL功能結(jié)構(gòu)域特點分子量小Ig分子的1/12、抗原性弱、穿透力強抗原性弱、相對較粘（疏水面的暴露有關(guān)。在全抗體分子中，疏水面被VL遮蓋）細菌LPS的單域抗體在雜交瘤細胞中的表達量比親本單克隆抗體高50倍以上設(shè)計原則52保持抗體的可溶性組成單域抗體一個VH或VL功能結(jié)構(gòu)域129130最小識別單位(minimalrecognitionunit,MRU)組成高多變區(qū)多肽（hypervariableregionpolypeptides,HRP）一個CDR多肽特點設(shè)計原理應用16－30氨基酸、抗原性弱、穿透力強非特異性吸附每個CDR的作用不同尋找在抗原識別和親和力方面有重要意義的CDR抗血小板纖維蛋白原受體CDR3，抑制纖維蛋白原、PACI與血小板的結(jié)合 53最小識別單位(minimalrecognitionu130131傳統(tǒng)單抗分子量大，穿透力弱基因工程小分子抗體穿透力強，親和力低多價微型抗體 雙鏈抗體（diabody） 雙特異性抗體（bispecificantibody） 微型抗體（minibody） 三鏈抗體（triabody） 四鏈抗體（tetrabody）多價微型抗體54傳統(tǒng)單抗分子量大，穿透力弱多價微型抗體131132VL－VH－CH380kD易于構(gòu)建及生產(chǎn)血中停留時間長靶部位吸收好

CH3-dimerizedscFVCH3CH3微型抗體55VL－VH－CH3CH3-dimerizedscF132133LD型LDLEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSGFlex型連接肽序列VHVLVHVLCH356LD型LEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSG133134價肽取決于連接肽段所形成的聚合物特性多價ScFv與單價ScFv和Fab片斷相比，與靶抗原結(jié)合的功能親和力提高四鏈抗體4helix-stabilizedscFvtetramers57價肽取決于連接肽段所形成的聚合物特性多價ScFv與單價S134135Leucine-zipperstabilizedscFvdimersHelix-stabilizedscFvdimers4helix-stabilizedscFvtetramersStreptavidin-scFvscFvfusionswithdi-andmultimeriaztiondomains58Leucine-zipperstabilizedsc135136雙鏈抗體的分子量為60KD左右，三鏈抗體為90KD左右，二者均顯著大于ScFv單體的分子量(約30KD)。因而在體內(nèi)應用多價微抗時，可以降低抗體在循環(huán)中的清除速度，但這種優(yōu)勢也可能因穿透能力的降低而抵消。雙鏈抗體和三鏈抗體的較短接頭不易被蛋白酶水解，而單價ScFv的較長接頭卻易被水解。多價ScFv與單價ScFv和Fab片段比較，最突出的特點是與靶抗原結(jié)合的功能親合力提高。ScFv多聚體能同時結(jié)合幾個靶抗原，也可多價結(jié)合于癌細胞的表面，因而具有較高的親和力。單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體及多價抗體的比較59雙鏈抗體的分子量為60KD左右，三鏈抗體為90KD左右，136137

人-鼠嵌合抗體 鼠源V區(qū)或Fab 15025%~30%

人源C區(qū)或Fc改型抗體 以鼠源CDR 15015%

替換人源CDR雙特異性抗體 異源性H2/L2 150－小分子抗體Fab 完整L和部分H 50 15％Fv VH和VL 25 15％單鏈抗體 VH-連接肽-VL 26 15％單域抗體 VH 12.5 7.5％最小識別單位 單一CDR 2 1.5％基因工程抗體的種類及其特性種類基本結(jié)構(gòu)相對分子量（kD）鼠源性成分60

人-鼠嵌合抗體 鼠源V區(qū)或Fab 137138BsAb，兩個不同的VL和VH－兩個不同的抗原結(jié)合位點雙特異性抗體61BsAb，兩個不同的VL和VH－兩個不同的抗原結(jié)合位點雙138139CTLCD3TUMORCELL-S-S-VHCH1VL-S-S-CH1抗原A抗原B雙特異性抗體62CTLCD3TUMOR-S-S-VHCH1VL-S-S-139140雙特異性抗體63雙特異性抗體1401411.高效的表達、篩選抗體的體系

將表型（與抗原特異結(jié)合）和基因型（含有片段抗體基因）聯(lián)系起來，使識別抗原的能力與進行再擴增的能力結(jié)合在一起，可以模擬生物體內(nèi)B細胞的有關(guān)特性—識別與擴增的統(tǒng)一。2.繞過免疫制備全人源性抗體，避免了鼠源性抗體在人體應用時誘發(fā)的HAMA等不良反應。噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)及噬菌體抗體的研制成功已成為生命科學研究的突破性進展之一。噬菌體抗體特色641.高效的表達、篩選抗體的體系噬菌體抗體特色141142

以噬菌體為載體，將抗體基因(Fab或ScFv基因等)與噬菌體編碼的外殼蛋白Ⅲ(cpⅢ)或Ⅷ(cpⅧ)相連，在噬菌體表面以抗體-外殼蛋白融合蛋白的形式表達；經(jīng)輔助病毒感染后，借助cpⅢ的信號肽穿膜作用，進入宿主外周基質(zhì)，在正確折疊后被包裝于噬菌體尾部，隨后攜帶有表達載體的宿主菌就會釋放出帶有抗體片段的噬菌體顆粒；這種噬菌體抗體可以特異識別抗原，又能感染宿主菌進行再擴增；采用類似于親和層析原理從噬菌體抗體庫中篩選出特異性抗體。噬菌體抗體基本原理65以噬菌體為載體，將抗體基因(Fab或ScFv基因1421431InsertFabgenesintophages2Infectedbacteriamakenewphages3Screenthephagesspecifictotheantigen4Addtheselectedphagesbacktobacteria5PuttheFabontoAbbackbonesPhage-displacecanbeusedinsteadofhybridomas噬菌體抗體661InsertFabgenesintopha143144噬菌體抗體的克隆和表達antigenantigenRepertoireofdiversesequencesdisplayedonphageIncubationofphage-displayedrepertoirewithantigenEliminationofunboundphageElutionofboundphageSelectionofligandsfromphage-displaylibraries67噬菌體抗體的克隆和表