Q-PCR講解解讀課件

唯我所欲、精準(zhǔn)溯源—qPCR實(shí)驗(yàn)解析

北京全式金生物技術(shù)有限公司唯我所欲、精準(zhǔn)溯源北京全式金2qPCR技術(shù)絕對定量VS相對定量一步法VS兩步法qRT-PCR概述核酸提取cDNA

合成(兩步法

qRT-PCR)引物設(shè)計(jì)方法和原則樣品準(zhǔn)備必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)選擇相應(yīng)的熒光檢測方法試劑選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析擴(kuò)增曲線、溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)常見問題分析數(shù)據(jù)分析2qPCR技術(shù)概述核酸提取樣品準(zhǔn)備必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)3qPCR基本概念3qPCR基本概念4常規(guī)PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)PCR：借助電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終對起始模板進(jìn)行精確的定量分析4常規(guī)PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)PCR：借助電泳對擴(kuò)增反5熒光定量PCR儀器工作原理激發(fā)光發(fā)射源接收裝置PCR反應(yīng)模塊5熒光定量PCR儀器工作原理激發(fā)光發(fā)射源qPCR參數(shù):擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線反映qPCR重要指標(biāo)qPCR參數(shù):擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線反映qPCR重要qPCR參數(shù):溶解曲線溶解曲線(下左):溫度和熒光值的關(guān)系，在擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行處理后溶解曲線

(下右):溫度和熒光值的關(guān)系，并取其導(dǎo)數(shù)，更為常用應(yīng)用:指示特異性，最為理想的為單峰；如出現(xiàn)多峰證明反應(yīng)不特異或存在引物二聚體確認(rèn)反應(yīng)特異性，增加數(shù)據(jù)可信度qPCR參數(shù):溶解曲線溶解曲線(下左):溫度和熒光值的qPCR的數(shù)學(xué)原理理想的PCR反應(yīng)：Xn=X0×2n非理想的PCR反應(yīng)：Xn=X0(1+Ex)n方程式兩邊同時(shí)取對數(shù)得: logXn=log(X0(1+Ex)n) 整理方程式得: logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn將C(t)和達(dá)到C(t)值時(shí)終產(chǎn)物的量Xc(t)帶入上式得：

logX0=(-log(1+Ex))×C(t)+

logXc(t)

初始濃度的對數(shù)與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)Xn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率qPCR的數(shù)學(xué)原理理想的PCR反應(yīng)：n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)9MIQEqPCR國際標(biāo)準(zhǔn)提出發(fā)表文章時(shí)所要求的最低限度的必要信息標(biāo)準(zhǔn)。對qPCR的術(shù)語；概念；研究與臨床應(yīng)用；樣本的采集、處理和制備；核酸的質(zhì)量控制；反轉(zhuǎn)錄；qPCR過程；數(shù)據(jù)分析等方面的操作標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范都做了詳盡的闡述。9MIQEqPCR國際標(biāo)準(zhǔn)提出發(fā)表文章時(shí)所要求的最低限度的10qPCR常用定量方式10qPCR常用定量方式qPCR常用實(shí)驗(yàn)方法TaqMan?/TaqMan-MGB?

MolecularBeaconSYBRGreenIMGBEclipseTMProbesScorpionsTMOthers...qPCR常用實(shí)驗(yàn)方法TaqMan?/TaqMan-MGqPCR常用實(shí)驗(yàn)方法簡單成本較低適用于多重PCR特異性較好可進(jìn)行SNP檢測特異性非常好qPCR常用實(shí)驗(yàn)方法簡單適用于多重PCR可進(jìn)行SNP檢測熒光標(biāo)記方法選擇醫(yī)療檢驗(yàn)TaqMan探針法特異準(zhǔn)確科研SYBR方法便宜方便TaqMan探針法要求嚴(yán)格的相對定量熒光標(biāo)記方法選擇醫(yī)療檢驗(yàn)14常用定量方法——相對定量vs絕對定量14常用定量方法絕對定量微生物檢測：病毒拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因檢測：轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)相對定量（差異）基因表達(dá)差異絕對定量16qPCR常用試驗(yàn)方法絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線由已知濃度的RNA、質(zhì)粒或合成的寡核苷酸鏈生成；定量未知模板；標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品必須同時(shí)反應(yīng)；相對定量

??CTMethod：使用內(nèi)參基因定量所研究樣品和參照樣品的目的基因；參照樣品基因與目的基因可以同時(shí)反應(yīng)，也可以單獨(dú)反應(yīng)；雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法：對每個(gè)樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做絕對定量，求出每個(gè)樣品中內(nèi)參基因和目的基因的絕對數(shù)量，然后根據(jù)相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達(dá)；16qPCR常用試驗(yàn)方法絕對定量絕對定量由標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算未知樣品的拷貝數(shù)絕對定量由標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算未知樣品的拷貝數(shù)利用管家基因校正并計(jì)算目的基因倍數(shù)關(guān)系相對定量利用管家基因校正并計(jì)算目的基因倍數(shù)關(guān)系相對定量一步法vs兩步法qPCR一步法vs兩步法qPCRqRT-PCR

實(shí)驗(yàn)條件RNAOneStepRT-PCR(Onetube)TwoStepRT-PCR(Twotubes)AmpliconAmpliconcDNAGeneSpecificprimersOligodTRandomPrimers可進(jìn)行PCR或qPCR需要基因特異性引物高通量使用同類的RNA(i.e.singlecell)

適合從大量的RNA樣本中得到少量基因（數(shù)目）的信息

先進(jìn)行cDNA合成再進(jìn)行PCR高效的第一鏈合成可為下游實(shí)驗(yàn)提供cDNA適合從少量的RNA樣本中得到大量基因（數(shù)目）的信息根據(jù)試驗(yàn)情況進(jìn)行選擇qRT-PCR實(shí)驗(yàn)條件RNAOneStepRT-PCR21qPCR技術(shù)絕對定量VS相對定量一步法VS兩步法qRT-PCR概述核酸提取cDNA合成(兩步法

qRT-PCR)引物設(shè)計(jì)方法和原則樣品準(zhǔn)備必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)選擇相應(yīng)的熒光檢測方法試劑選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析擴(kuò)增曲線、溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)常見問題分析數(shù)據(jù)分析21qPCR技術(shù)概述核酸提取樣品準(zhǔn)備必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)實(shí)22核酸提取RNA提取TransZolTransZolUpTransZolPlantEasyPureRNAKitEasyPureViralDNA/RNAKitEasyPurePlantRNAKitEasyPureBloodRNAKitTransZolUpPlusRNAKitEasyPuremiRNAKit好的qPCR結(jié)果來源于高質(zhì)量的模板DNA提取BloodZolPlantZolEasyPureGenomicDNAKitEasyPurePlantGenomicDNAKitEasyPureBloodGenomicDNAKitEasyPureMarineGenomicDNAKitEasyPureBacteriaDNAKit22核酸提取RNA提取TransZol23cDNA合成(兩步法qRT-PCR)好的qPCR結(jié)果依賴于成功的cDNA合成反轉(zhuǎn)錄cDNA影響qPCR敏感度全長cDNA合成增加qPCR成功率引物Oligo(dT):只識(shí)別mRNA，合成cDNA序列靠近3’隨機(jī)引物:隨機(jī)合成序列，可能合成非編碼RNA，造成定量結(jié)果高估兩者混合結(jié)合兩者優(yōu)點(diǎn)23cDNA合成(兩步法qRT-PCR)好的qPCR結(jié)果24絕對定量和相對定量實(shí)驗(yàn)要求24絕對定量和相對定量實(shí)驗(yàn)要求25絕對定量模板盡可能選擇與目的基因序列相同以保證擴(kuò)增效率相同來源質(zhì)粒DNA純化PCR產(chǎn)物

ReferenceDNA(genomicDNA)精度每次加樣要保證在2μl以上，減少誤差梯度至少3個(gè)點(diǎn)，最好5個(gè)點(diǎn)25絕對定量模板26相對定量內(nèi)參基因選擇內(nèi)參基因的作用檢測樣本材料中RNA是否降解糾正樣本加樣的差異校正cDNA合成速率差異校正PCR抑制劑的影響常用內(nèi)參基因

GAPDHβ-actin18SrRNA選擇

不同的物種選擇不同的內(nèi)參基因，有時(shí)候可選擇組合內(nèi)參基因。26相對定量內(nèi)參基因選擇內(nèi)參基因的作用27引物設(shè)計(jì)方法和原則27引物設(shè)計(jì)方法和原則維基百科/google輸入待查基因名稱選擇物種mRNA找出目的mRNA輸入要查找的蛋白或是基因名稱NCBICOPY名稱到NCBI重新檢索文獻(xiàn)目的mRNA序列或序列號(hào)Real-TimePCR引物序列Blast確定引物特異性引物設(shè)計(jì)維基百科/google輸入待查www.ncbi.nlm.ni29網(wǎng)絡(luò)免費(fèi)設(shè)計(jì)軟件Primer3（primer3.ut.ee）

引物和雙標(biāo)記水解探針的設(shè)計(jì)Tm的計(jì)算MFold（）

引物和擴(kuò)增產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測

二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性(deltaG)和融解溫度(Tm)BLAST（/）

結(jié)構(gòu)特異性29網(wǎng)絡(luò)免費(fèi)設(shè)計(jì)軟件Primer3（primer3.ut.e30SYBR引物設(shè)計(jì)原則SYBR-Green引物引物長度18-30bps，產(chǎn)物長度范圍100~400bpG/C含量:40-60%避免引物內(nèi)含有互補(bǔ)序列(尤其是3’端)避免3’端錯(cuò)配3’端不能出現(xiàn)連續(xù)三個(gè)以上的G或C避免3’端出現(xiàn)T堿基設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子引物30SYBR引物設(shè)計(jì)原則SYBR-Green引物31TaqMan探針和引物設(shè)計(jì)TaqMan探針Tm值比引物高10℃沒有連續(xù)相同的堿基

探針位置盡可能地靠近上游引物C遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于G5‘端沒有GTaqMan引物

Tm(58-60℃)15-30basesinlength

G+C含量30-80%不要有連續(xù)4個(gè)G3’端不能有連續(xù)兩個(gè)以上的G+C5‘端不要有G(AorCpreferred)引物之間的TM相差避免超過2℃擴(kuò)增長度50-150bp(max400)引物跨越內(nèi)含子31TaqMan探針和引物設(shè)計(jì)TaqMan探針Tm值比引物32qPCR技術(shù)絕對定量VS相對定量一步法VS兩步法qRT-PCR概述核酸提取cDNA合成(兩步法

qRT-PCR)引物設(shè)計(jì)方法和原則樣品準(zhǔn)備必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)選擇相應(yīng)的熒光檢測方法試劑選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析擴(kuò)增曲線、溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)常見問題分析數(shù)據(jù)分析32qPCR技術(shù)概述核酸提取樣品準(zhǔn)備必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)實(shí)33對照設(shè)置33對照設(shè)置34對照設(shè)置陰性對照Negativecontrol:Notemplate(NTC)Use:檢驗(yàn)是否有模板污染Noreversetranscriptase(NRT):Use:檢驗(yàn)RNA樣品中是否有DNA污染Noamplificationcontrol(NAC):Use:檢驗(yàn)是否有聚合酶污染Noprobecontrol(NPC):Use:檢驗(yàn)熒光污染Buffer:OnlycontainsbufferUse:檢驗(yàn)背景熒光陽性對照Calibrator:可以用帶有PCR擴(kuò)增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸；質(zhì)粒DNA；克隆到質(zhì)粒的cDNA；體外反轉(zhuǎn)錄的RNA；ReferenceRNApools；來自于特定的生物體樣本的RNA或DNA及國際上公認(rèn)的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物。Standardcurve34對照設(shè)置陰性對照35定量方式選擇35定量方式選擇36定量方式選擇SYBRGreen適用-特異性要求不是特別高的反應(yīng)，分子數(shù)（拷貝數(shù)）超過1000的反應(yīng)-探針實(shí)驗(yàn)前，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)-PCR條件非常成熟，無二聚體，無非特異擴(kuò)增TaqMan適用-特異性要求較高的實(shí)驗(yàn)-多重PCR（標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)）-SNP-靈敏度要求較高的實(shí)驗(yàn)36定量方式選擇SYBRGreen適用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和??Ct法

相對定量方法基因表達(dá)差異目的基因，內(nèi)參基因??Ct只依靠Ct值用于大通量（很多基因，如芯片結(jié)果）計(jì)算簡單估計(jì)性的結(jié)果要求目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率都比較好雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法結(jié)果精確對擴(kuò)增效率要求不高構(gòu)建目的基因與內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)于兩個(gè)絕對定量每次反應(yīng)都要作標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線法和??Ct法相對定量方法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法用目的基因和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線處理與未處理樣品同時(shí)擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因，獲得C(t)值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目的基因和內(nèi)參基因的絕對拷貝數(shù)用內(nèi)參基因?qū)δ康幕蚓换换蟮哪康幕蛑迪啾鹊贸鎏幚砼c未處理的樣本中目的基因的表達(dá)差異雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法39實(shí)例分析39實(shí)例分析相對定量實(shí)例實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

比較病毒刺激細(xì)胞后，細(xì)胞抗病毒基因ISG54的表達(dá)情況差異。樣品：病毒刺激細(xì)胞，對照細(xì)胞試劑：

TransZolUp、TransStart

TopGreenqPCRSuperMix、

TransScriptTM

IIFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix其它材料：

內(nèi)參引物（GAPDH）

目的基因引物（ISG54）相對定量實(shí)例實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩φ諛悠芳皟?nèi)參引物確定對照樣本（Calibrator）

多個(gè)樣本比較情況下，其中之一作為對照樣本，其它所有樣本中目的基因的表達(dá)都相對于對照上調(diào)或下調(diào)。確定內(nèi)參基因（GAPDH或β-actin）

在所有樣本中恒定表達(dá)的已知基因，該內(nèi)參基因可以是一個(gè)或多個(gè)。內(nèi)參基因一般是穩(wěn)定表達(dá)的，但在個(gè)別物種中可能并非穩(wěn)定表達(dá)，此時(shí)需選擇多個(gè)內(nèi)參引物。對照樣品及內(nèi)參引物確定對照樣本（Calibrator）數(shù)據(jù)分析擴(kuò)增曲線溶解曲線GAPDH內(nèi)參基因數(shù)據(jù)分析擴(kuò)增曲線溶解曲線GAPDH內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線溶解曲線ISG54目的基因數(shù)據(jù)分析擴(kuò)增曲線溶解曲線ISG54目的基因數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析△△Ct=△Ct(實(shí)驗(yàn))—△Ct(對照)△Ct(實(shí)驗(yàn))=Ct（實(shí)驗(yàn)，目的基因）—Ct（實(shí)驗(yàn)，內(nèi)參基因）△Ct(對照)=Ct（對照，目的基因）—Ct（對照，內(nèi)參基因）2－△△Ct=2－（－3.22）=9.32病毒刺激細(xì)胞后，細(xì)胞中的ISG54抗病毒基因表達(dá)上調(diào)了9.32倍。2－△△CtTemplateAssayCt(dRn)對照細(xì)胞GAPDH18.20病毒刺激細(xì)胞GAPDH18.22對照細(xì)胞ISG5426.84病毒刺激細(xì)胞ISG5423.64數(shù)據(jù)分析△△Ct=△Ct(實(shí)驗(yàn))—△Ct(對照)2如何制作標(biāo)準(zhǔn)品以Adeasy腺病毒質(zhì)粒為例：

一個(gè)質(zhì)粒MW=36820bp×2×330=2.43×1072.43×107g/mol6.023×1023個(gè)分子/mol=4.03×10-17g一個(gè)質(zhì)粒(1copy)的質(zhì)量=拷貝數(shù)1031041051061071081091010標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒質(zhì)量4.03x10-144.03x10-134.03x10-124.03x10-114.03x10-104.03x10-94.03x10-84.03x10-7-計(jì)算出拷貝數(shù)（copies/ul）-梯度稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)品（大體積稀釋10μlto90μl）-定量PCR，檢查Ct值差異-產(chǎn)物跑膠鑒定大小如何制作標(biāo)準(zhǔn)品一個(gè)質(zhì)粒(1copy)的質(zhì)量=拷貝數(shù)103如何計(jì)算擴(kuò)增效率使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定引物擴(kuò)增效率Y=-3.488×logX+55.03R2=0.999E=93.5%E=10(-1/slope)－1如何計(jì)算擴(kuò)增效率使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定引物擴(kuò)增效率Y=-3.488利用TaqMan法研究ERBB2在正?；蛉橄倌[瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)差異已知在50%的乳腺腫瘤樣本中，ERBB2表達(dá)異常，因此可以作為一個(gè)檢測標(biāo)準(zhǔn)選用GAPDH作為內(nèi)標(biāo)基因FAM標(biāo)記的ERBB2探針VIC標(biāo)記的GAPDH探針構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線雙重PCR反應(yīng)陰性對照無RNA對照（空白）無逆轉(zhuǎn)錄酶對照（基因組）實(shí)例分析-2利用TaqMan法研究ERBB2在正?；蛉橄倌[瘤組織標(biāo)本中標(biāo)準(zhǔn)曲線Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2標(biāo)準(zhǔn)曲線Color2-VICdetectionfo樣品擴(kuò)增：正常vs腫瘤PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH腫瘤正常腫瘤正常樣品擴(kuò)增：正常vs腫瘤PMT1-FAMdetection-實(shí)驗(yàn)結(jié)果MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma28.4027.3628.4627.1228.43±0.0427.24±0.17ERBB2表達(dá)MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma23.2722.8123.4122.8623.34±0.1022.83±0.03GAPDH表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果MultiplexReactions:C(t)H實(shí)驗(yàn)結(jié)果HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copiesng/μlTotalRNAERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.0110.0180.018/0.011=1.6300.81.82HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpression實(shí)驗(yàn)結(jié)果HealthyTumorGAPDHERBB21095實(shí)驗(yàn)結(jié)果ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.182-ΔΔc(t)=1.51-1.93結(jié)果與雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法相近HealthyRNAERBB2GAPDHΔC(t)28.4023.275.3128.4623.415.0528.43±0.0428.34±0.105.18±0.18CarcinomaRNAERBB2GAPDHΔC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2626.24±0.1726.83±0.034.41±0.21實(shí)驗(yàn)結(jié)果ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.153參照染料（ROX）53參照染料（ROX）參照染料選擇標(biāo)準(zhǔn)化熒光信號(hào)調(diào)整非PCR因素造成的誤差，如加樣誤差提供較穩(wěn)定的基線部分儀器在使用前會(huì)使用標(biāo)準(zhǔn)化熒光信號(hào)進(jìn)行校正參照染料的使用由儀器決定ABIandStratagene使用ROXBio-Rad使用標(biāo)準(zhǔn)化熒光信號(hào)Roche,Corbett,Cepheid和

MJResearch不使用內(nèi)參染料使用內(nèi)參染料使數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確參照染料選擇使用內(nèi)參染料使數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確55qPCR技術(shù)絕對定量VS相對定量一步法VS兩步法qRT-PCR概述核酸提取cDNA合成(兩步法

qRT-PCR)引物設(shè)計(jì)方法和原則樣品準(zhǔn)備必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)選擇相應(yīng)的熒光檢測方法試劑選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析擴(kuò)增曲線、溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)常見問題分析數(shù)據(jù)分析55qPCR技術(shù)概述核酸提取樣品準(zhǔn)備必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)實(shí)56判斷數(shù)據(jù)有效性56判斷數(shù)據(jù)有效性57用擴(kuò)增曲線檢驗(yàn)qPCR體系用融解曲線檢驗(yàn)qPCR體系用標(biāo)準(zhǔn)曲線檢驗(yàn)qPCR體系用No-TemplateControl(

NTC)檢驗(yàn)qPCR體系（引物）用NoRTControl檢驗(yàn)qPCR體系（模板）57用擴(kuò)增曲線檢驗(yàn)qPCR體系擴(kuò)增曲線平滑起始無擴(kuò)增起峰時(shí)間正常NTC和NRC無擴(kuò)增或擴(kuò)增起峰較晚CT值是判斷實(shí)驗(yàn)成功與否的重要參考擴(kuò)增曲線CT值是判斷實(shí)驗(yàn)成功與否的重要參考Ct值的可信范圍臨床檢驗(yàn)小于33科學(xué)研究小于38內(nèi)參基因小于20，樣品間差距不超過1復(fù)孔不超過0.5CT值是判斷實(shí)驗(yàn)成功與否的重要參考Ct值的可信范圍臨床檢驗(yàn)CT值是判斷實(shí)驗(yàn)成功與否的重要參考60溶解曲線分析呈現(xiàn)單峰峰的寬度較小NTC和NRC均無較高的峰出現(xiàn)60溶解曲線分析呈現(xiàn)單峰61擴(kuò)增效率r2=0.999Slope=-3.364E=10(-1/slope)－1

r2:0.95~1Slope:-3.58~-3.10E:90%~110%61擴(kuò)增效率r2=0.999Slope=-3.364熒光定量PCR--NTCNTCNTC—反應(yīng)是否存在污染NTC—引物是否特異，是否會(huì)形成引物二聚體NTC的最佳狀況NTC的CT值為零，擴(kuò)增曲線與基線重合NTC的CT值與全管反應(yīng)物的CT值相差5以上或10以上熒光定量PCR--NTCNTCNTC—反應(yīng)是否存在污染NT熒光定量PCR--NTC引物二聚體熒光定量PCR--NTC引物二聚體NoRTControlRT反應(yīng)中的陰性對照，即不加入RT酶的反應(yīng)目的：檢測RNA中是否有基因組DNA的殘留將NoRTControl產(chǎn)物與正常cDNA同時(shí)進(jìn)行qPCR觀察其結(jié)果，判斷正常cDNA的擴(kuò)增結(jié)果是否可信、該RNA是否可用NoRTControlRT反應(yīng)中的陰性對照，即不加入RT熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)參考范圍數(shù)據(jù)名稱參考范圍Tm>80℃CT18-30cyclesR2>0.95Slope(-3.58)-(-3.10)Efficiency90%-110%NTCCT(NTC)=0CT(NTC)－CT(樣品)≥5NRCCT(NTC)=0CT(NTC)－CT(樣品)≥5熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)參考范圍數(shù)據(jù)名稱參考范圍Tm>80℃C66熒光定量PCR問題解析66熒光定量PCR問題解析67擴(kuò)增曲線分析基線設(shè)置是否正確基線校準(zhǔn)基線開始值(3-10)基線終止值（指數(shù)期之前）閾值設(shè)置是否正確設(shè)置在指數(shù)增長期(可自動(dòng)或手動(dòng)設(shè)置）67擴(kuò)增曲線分析基線設(shè)置是否正確68擴(kuò)增曲線分析初始擴(kuò)增不規(guī)則主要由于模板中存在抑制物。樣品擴(kuò)增過早是由于初始模板濃度太高。68擴(kuò)增曲線分析初始擴(kuò)增不規(guī)則主要由于模板中存在抑制物。69擴(kuò)增曲線分析曲線不平滑探針或熒光染料品質(zhì)不好儀器使用過度，熒光收集不穩(wěn)定儀器未經(jīng)過校正（包括自動(dòng)校正或ROX校正)體系中抑制物較多，導(dǎo)致熒光不穩(wěn)定69擴(kuò)增曲線分析曲線不平滑探針或熒光染料品質(zhì)不好擴(kuò)增曲線問題-精密度差加樣誤差，體系配置錯(cuò)誤，反應(yīng)液沒有混勻。低拷貝基因或模板濃度過高或過低。未引入校正系統(tǒng)。擴(kuò)增曲線問題-精密度差加樣誤差，體系配置錯(cuò)誤，反應(yīng)液沒有混勻融解曲線分析分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性:單峰證明特異檢測

:-基因組污染

(NTC出現(xiàn)與目的條帶相同的峰)-非特異擴(kuò)增(不同的Tm)-引物二聚體(NTC出現(xiàn)比目的基因Tm小的峰),…

融解曲線分析分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性:單峰證明特異72標(biāo)準(zhǔn)曲線分析可能的影響因素

1.稀釋精度

2.加樣精度

3.反應(yīng)體系的優(yōu)化

4.模板降解72標(biāo)準(zhǔn)曲線分析可能的影響因素抑制物PCR抑制物-多糖類、有機(jī)溶劑、蛋白酶K等樣本質(zhì)量

-A260/A280DNA:1.8

-A260/A280RNA:2.0

RT反應(yīng)中的抑制物-RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

抑制物PCR抑制物全式金qPCR整體解決方案產(chǎn)品名稱目錄號(hào)TransZolTMET101TransZolTMUpET111TransZolTMPlantET121TransZolTMUpPlusRNAKitER501EasyPure?RNAKitER101EasyPure?PlantRNAKitER301EasyPure?ViralDNA/RNAKitER201EasyPure?BloodRNAKitER401EasyPure?miRNAKitER601全式金qPCR整體解決方案產(chǎn)品名稱目錄號(hào)TransZolTM產(chǎn)品名稱目錄號(hào)EasyScript?ReverseTranscriptaseAE101TransScript?ReverseTranscriptaseAT101TransScript?IIReverseTranscriptaseAH101EasyScript?First-StrandcDNASynthesisSuperMixAE301TransScript?First-StrandcDNASynthesisSuperMixAT301TransScript?One-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMixAT311TransScript?All-in-OneFirst-StrandcDNASynthesisSuperMixforPCRAT321TransScript?All-in-OneFirst-StrandcDNASynthesisSuperMixforqPCRAT341TransScript?IIFirst-StrandcDNASynthesisSuperMixAH301全式金qPCR整體解決方案產(chǎn)品名稱目錄號(hào)EasyScript?ReverseTra產(chǎn)品名稱目錄號(hào)TransScript?IIAll-in-OneFirst-StrandcDNASynthesisSuperMixforPCRAH321TransScript?IIAll-in-OneFirst-StrandcDNASynthesisSuperMixforqPCRAH341TransScript?IITwo-StepRT-PCRSuperMixAH401EasyScript?One-StepRT-PCRSuperMixAE411TransScript?One-StepRT-PCRSuperMixAT411TransScript?IIOne-StepRT-PCRSuperMixAH411TransScript?IIOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMixAH311TransScript?Two-StepRT-PCRSuperMixAT401TransScript-UniOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMixAU311TransScript?FlyFirst-StrandcDNASynthesisSuperMixAF301全式金qPCR整體解決方案產(chǎn)品名稱目錄號(hào)TransScript?IIAll-in-全式金qPCR整體解決方案產(chǎn)品名稱目錄號(hào)TransStart?GreenqPCRSuperMixAQ101TransStart?GreenqPCRSuperMixUDGAQ111TransStart?TopGreenqPCRSuperMixAQ131TransStart?ProbeqPCRSuperMixAQ401TransScript?Two-StepqRT-PCRSuperMixAQ201TransScript?IITwo-StepqRT-PCRSuperMixAQ301TransScript?One-StepqRT-PCRSuperMixAQ211TransScript?IIOne-StepqRT-PCRSuperMixAQ311TransScript?GreenmiRNATwo-StepqRT-PCRSuperMixAQ202TransScript?ProbeOne-StepqRT-PCRSuperMixAQ221TransScript?IIProbeOne-StepqRT-PCRSuperMixAQ321TransStart?TipGreenqPCRSuperMixAQ141全式金qPCR整體解決方案產(chǎn)品名稱目錄號(hào)TransStart謝謝！北京全式金生物技術(shù)有限公司謝謝！唯我所欲、精準(zhǔn)溯源—qPCR實(shí)驗(yàn)解析

北京全式金生物技術(shù)有限公司唯我所欲、精準(zhǔn)溯源北京全式金80qPCR技術(shù)絕對定量VS相對定量一步法VS兩步法qRT-PCR概述核酸提取cDNA

合成(兩步法

qRT-PCR)引物設(shè)計(jì)方法和原則樣品準(zhǔn)備必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)選擇相應(yīng)的熒光檢測方法試劑選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析擴(kuò)增曲線、溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)常見問題分析數(shù)據(jù)分析2qPCR技術(shù)概述核酸提取樣品準(zhǔn)備必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)81qPCR基本概念3qPCR基本概念82常規(guī)PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)PCR：借助電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終對起始模板進(jìn)行精確的定量分析4常規(guī)PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)PCR：借助電泳對擴(kuò)增反83熒光定量PCR儀器工作原理激發(fā)光發(fā)射源接收裝置PCR反應(yīng)模塊5熒光定量PCR儀器工作原理激發(fā)光發(fā)射源qPCR參數(shù):擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線反映qPCR重要指標(biāo)qPCR參數(shù):擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線反映qPCR重要qPCR參數(shù):溶解曲線溶解曲線(下左):溫度和熒光值的關(guān)系，在擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行處理后溶解曲線

(下右):溫度和熒光值的關(guān)系，并取其導(dǎo)數(shù)，更為常用應(yīng)用:指示特異性，最為理想的為單峰；如出現(xiàn)多峰證明反應(yīng)不特異或存在引物二聚體確認(rèn)反應(yīng)特異性，增加數(shù)據(jù)可信度qPCR參數(shù):溶解曲線溶解曲線(下左):溫度和熒光值的qPCR的數(shù)學(xué)原理理想的PCR反應(yīng)：Xn=X0×2n非理想的PCR反應(yīng)：Xn=X0(1+Ex)n方程式兩邊同時(shí)取對數(shù)得: logXn=log(X0(1+Ex)n) 整理方程式得: logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn將C(t)和達(dá)到C(t)值時(shí)終產(chǎn)物的量Xc(t)帶入上式得：

logX0=(-log(1+Ex))×C(t)+

logXc(t)

初始濃度的對數(shù)與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)Xn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率qPCR的數(shù)學(xué)原理理想的PCR反應(yīng)：n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)87MIQEqPCR國際標(biāo)準(zhǔn)提出發(fā)表文章時(shí)所要求的最低限度的必要信息標(biāo)準(zhǔn)。對qPCR的術(shù)語；概念；研究與臨床應(yīng)用；樣本的采集、處理和制備；核酸的質(zhì)量控制；反轉(zhuǎn)錄；qPCR過程；數(shù)據(jù)分析等方面的操作標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范都做了詳盡的闡述。9MIQEqPCR國際標(biāo)準(zhǔn)提出發(fā)表文章時(shí)所要求的最低限度的88qPCR常用定量方式10qPCR常用定量方式qPCR常用實(shí)驗(yàn)方法TaqMan?/TaqMan-MGB?

MolecularBeaconSYBRGreenIMGBEclipseTMProbesScorpionsTMOthers...qPCR常用實(shí)驗(yàn)方法TaqMan?/TaqMan-MGqPCR常用實(shí)驗(yàn)方法簡單成本較低適用于多重PCR特異性較好可進(jìn)行SNP檢測特異性非常好qPCR常用實(shí)驗(yàn)方法簡單適用于多重PCR可進(jìn)行SNP檢測熒光標(biāo)記方法選擇醫(yī)療檢驗(yàn)TaqMan探針法特異準(zhǔn)確科研SYBR方法便宜方便TaqMan探針法要求嚴(yán)格的相對定量熒光標(biāo)記方法選擇醫(yī)療檢驗(yàn)92常用定量方法——相對定量vs絕對定量14常用定量方法絕對定量微生物檢測：病毒拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因檢測：轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)相對定量（差異）基因表達(dá)差異絕對定量94qPCR常用試驗(yàn)方法絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線由已知濃度的RNA、質(zhì)?；蚝铣傻墓押塑账徭溕?；定量未知模板；標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品必須同時(shí)反應(yīng)；相對定量

??CTMethod：使用內(nèi)參基因定量所研究樣品和參照樣品的目的基因；參照樣品基因與目的基因可以同時(shí)反應(yīng)，也可以單獨(dú)反應(yīng)；雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法：對每個(gè)樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做絕對定量，求出每個(gè)樣品中內(nèi)參基因和目的基因的絕對數(shù)量，然后根據(jù)相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達(dá)；16qPCR常用試驗(yàn)方法絕對定量絕對定量由標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算未知樣品的拷貝數(shù)絕對定量由標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算未知樣品的拷貝數(shù)利用管家基因校正并計(jì)算目的基因倍數(shù)關(guān)系相對定量利用管家基因校正并計(jì)算目的基因倍數(shù)關(guān)系相對定量一步法vs兩步法qPCR一步法vs兩步法qPCRqRT-PCR

實(shí)驗(yàn)條件RNAOneStepRT-PCR(Onetube)TwoStepRT-PCR(Twotubes)AmpliconAmpliconcDNAGeneSpecificprimersOligodTRandomPrimers可進(jìn)行PCR或qPCR需要基因特異性引物高通量使用同類的RNA(i.e.singlecell)

適合從大量的RNA樣本中得到少量基因（數(shù)目）的信息

先進(jìn)行cDNA合成再進(jìn)行PCR高效的第一鏈合成可為下游實(shí)驗(yàn)提供cDNA適合從少量的RNA樣本中得到大量基因（數(shù)目）的信息根據(jù)試驗(yàn)情況進(jìn)行選擇qRT-PCR實(shí)驗(yàn)條件RNAOneStepRT-PCR99qPCR技術(shù)絕對定量VS相對定量一步法VS兩步法qRT-PCR概述核酸提取cDNA合成(兩步法

qRT-PCR)引物設(shè)計(jì)方法和原則樣品準(zhǔn)備必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)選擇相應(yīng)的熒光檢測方法試劑選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析擴(kuò)增曲線、溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)常見問題分析數(shù)據(jù)分析21qPCR技術(shù)概述核酸提取樣品準(zhǔn)備必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)實(shí)100核酸提取RNA提取TransZolTransZolUpTransZolPlantEasyPureRNAKitEasyPureViralDNA/RNAKitEasyPurePlantRNAKitEasyPureBloodRNAKitTransZolUpPlusRNAKitEasyPuremiRNAKit好的qPCR結(jié)果來源于高質(zhì)量的模板DNA提取BloodZolPlantZolEasyPureGenomicDNAKitEasyPurePlantGenomicDNAKitEasyPureBloodGenomicDNAKitEasyPureMarineGenomicDNAKitEasyPureBacteriaDNAKit22核酸提取RNA提取TransZol101cDNA合成(兩步法qRT-PCR)好的qPCR結(jié)果依賴于成功的cDNA合成反轉(zhuǎn)錄cDNA影響qPCR敏感度全長cDNA合成增加qPCR成功率引物Oligo(dT):只識(shí)別mRNA，合成cDNA序列靠近3’隨機(jī)引物:隨機(jī)合成序列，可能合成非編碼RNA，造成定量結(jié)果高估兩者混合結(jié)合兩者優(yōu)點(diǎn)23cDNA合成(兩步法qRT-PCR)好的qPCR結(jié)果102絕對定量和相對定量實(shí)驗(yàn)要求24絕對定量和相對定量實(shí)驗(yàn)要求103絕對定量模板盡可能選擇與目的基因序列相同以保證擴(kuò)增效率相同來源質(zhì)粒DNA純化PCR產(chǎn)物

ReferenceDNA(genomicDNA)精度每次加樣要保證在2μl以上，減少誤差梯度至少3個(gè)點(diǎn)，最好5個(gè)點(diǎn)25絕對定量模板104相對定量內(nèi)參基因選擇內(nèi)參基因的作用檢測樣本材料中RNA是否降解糾正樣本加樣的差異校正cDNA合成速率差異校正PCR抑制劑的影響常用內(nèi)參基因

GAPDHβ-actin18SrRNA選擇

不同的物種選擇不同的內(nèi)參基因，有時(shí)候可選擇組合內(nèi)參基因。26相對定量內(nèi)參基因選擇內(nèi)參基因的作用105引物設(shè)計(jì)方法和原則27引物設(shè)計(jì)方法和原則維基百科/google輸入待查基因名稱選擇物種mRNA找出目的mRNA輸入要查找的蛋白或是基因名稱NCBICOPY名稱到NCBI重新檢索文獻(xiàn)目的mRNA序列或序列號(hào)Real-TimePCR引物序列Blast確定引物特異性引物設(shè)計(jì)維基百科/google輸入待查www.ncbi.nlm.ni107網(wǎng)絡(luò)免費(fèi)設(shè)計(jì)軟件Primer3（primer3.ut.ee）

引物和雙標(biāo)記水解探針的設(shè)計(jì)Tm的計(jì)算MFold（）

引物和擴(kuò)增產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測

二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性(deltaG)和融解溫度(Tm)BLAST（/）

結(jié)構(gòu)特異性29網(wǎng)絡(luò)免費(fèi)設(shè)計(jì)軟件Primer3（primer3.ut.e108SYBR引物設(shè)計(jì)原則SYBR-Green引物引物長度18-30bps，產(chǎn)物長度范圍100~400bpG/C含量:40-60%避免引物內(nèi)含有互補(bǔ)序列(尤其是3’端)避免3’端錯(cuò)配3’端不能出現(xiàn)連續(xù)三個(gè)以上的G或C避免3’端出現(xiàn)T堿基設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子引物30SYBR引物設(shè)計(jì)原則SYBR-Green引物109TaqMan探針和引物設(shè)計(jì)TaqMan探針Tm值比引物高10℃沒有連續(xù)相同的堿基

探針位置盡可能地靠近上游引物C遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于G5‘端沒有GTaqMan引物

Tm(58-60℃)15-30basesinlength

G+C含量30-80%不要有連續(xù)4個(gè)G3’端不能有連續(xù)兩個(gè)以上的G+C5‘端不要有G(AorCpreferred)引物之間的TM相差避免超過2℃擴(kuò)增長度50-150bp(max400)引物跨越內(nèi)含子31TaqMan探針和引物設(shè)計(jì)TaqMan探針Tm值比引物110qPCR技術(shù)絕對定量VS相對定量一步法VS兩步法qRT-PCR概述核酸提取cDNA合成(兩步法

qRT-PCR)引物設(shè)計(jì)方法和原則樣品準(zhǔn)備必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)選擇相應(yīng)的熒光檢測方法試劑選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析擴(kuò)增曲線、溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)常見問題分析數(shù)據(jù)分析32qPCR技術(shù)概述核酸提取樣品準(zhǔn)備必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)實(shí)111對照設(shè)置33對照設(shè)置112對照設(shè)置陰性對照Negativecontrol:Notemplate(NTC)Use:檢驗(yàn)是否有模板污染Noreversetranscriptase(NRT):Use:檢驗(yàn)RNA樣品中是否有DNA污染Noamplificationcontrol(NAC):Use:檢驗(yàn)是否有聚合酶污染Noprobecontrol(NPC):Use:檢驗(yàn)熒光污染Buffer:OnlycontainsbufferUse:檢驗(yàn)背景熒光陽性對照Calibrator:可以用帶有PCR擴(kuò)增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸；質(zhì)粒DNA；克隆到質(zhì)粒的cDNA；體外反轉(zhuǎn)錄的RNA；ReferenceRNApools；來自于特定的生物體樣本的RNA或DNA及國際上公認(rèn)的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物。Standardcurve34對照設(shè)置陰性對照113定量方式選擇35定量方式選擇114定量方式選擇SYBRGreen適用-特異性要求不是特別高的反應(yīng)，分子數(shù)（拷貝數(shù)）超過1000的反應(yīng)-探針實(shí)驗(yàn)前，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)-PCR條件非常成熟，無二聚體，無非特異擴(kuò)增TaqMan適用-特異性要求較高的實(shí)驗(yàn)-多重PCR（標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)）-SNP-靈敏度要求較高的實(shí)驗(yàn)36定量方式選擇SYBRGreen適用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和??Ct法

相對定量方法基因表達(dá)差異目的基因，內(nèi)參基因??Ct只依靠Ct值用于大通量（很多基因，如芯片結(jié)果）計(jì)算簡單估計(jì)性的結(jié)果要求目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率都比較好雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法結(jié)果精確對擴(kuò)增效率要求不高構(gòu)建目的基因與內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)于兩個(gè)絕對定量每次反應(yīng)都要作標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線法和??Ct法相對定量方法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法用目的基因和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線處理與未處理樣品同時(shí)擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因，獲得C(t)值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目的基因和內(nèi)參基因的絕對拷貝數(shù)用內(nèi)參基因?qū)δ康幕蚓换换蟮哪康幕蛑迪啾鹊贸鎏幚砼c未處理的樣本中目的基因的表達(dá)差異雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法117實(shí)例分析39實(shí)例分析相對定量實(shí)例實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

比較病毒刺激細(xì)胞后，細(xì)胞抗病毒基因ISG54的表達(dá)情況差異。樣品：病毒刺激細(xì)胞，對照細(xì)胞試劑：

TransZolUp、TransStart

TopGreenqPCRSuperMix、

TransScriptTM

IIFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix其它材料：

內(nèi)參引物（GAPDH）

目的基因引物（ISG54）相對定量實(shí)例實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩φ諛悠芳皟?nèi)參引物確定對照樣本（Calibrator）

多個(gè)樣本比較情況下，其中之一作為對照樣本，其它所有樣本中目的基因的表達(dá)都相對于對照上調(diào)或下調(diào)。確定內(nèi)參基因（GAPDH或β-actin）

在所有樣本中恒定表達(dá)的已知基因，該內(nèi)參基因可以是一個(gè)或多個(gè)。內(nèi)參基因一般是穩(wěn)定表達(dá)的，但在個(gè)別物種中可能并非穩(wěn)定表達(dá)，此時(shí)需選擇多個(gè)內(nèi)參引物。對照樣品及內(nèi)參引物確定對照樣本（Calibrator）數(shù)據(jù)分析擴(kuò)增曲線溶解曲線GAPDH內(nèi)參基因數(shù)據(jù)分析擴(kuò)增曲線溶解曲線GAPDH內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線溶解曲線ISG54目的基因數(shù)據(jù)分析擴(kuò)增曲線溶解曲線ISG54目的基因數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析△△Ct=△Ct(實(shí)驗(yàn))—△Ct(對照)△Ct(實(shí)驗(yàn))=Ct（實(shí)驗(yàn)，目的基因）—Ct（實(shí)驗(yàn)，內(nèi)參基因）△Ct(對照)=Ct（對照，目的基因）—Ct（對照，內(nèi)參基因）2－△△Ct=2－（－3.22）=9.32病毒刺激細(xì)胞后，細(xì)胞中的ISG54抗病毒基因表達(dá)上調(diào)了9.32倍。2－△△CtTemplateAssayCt(dRn)對照細(xì)胞GAPDH18.20病毒刺激細(xì)胞GAPDH18.22對照細(xì)胞ISG5426.84病毒刺激細(xì)胞ISG5423.64數(shù)據(jù)分析△△Ct=△Ct(實(shí)驗(yàn))—△Ct(對照)2如何制作標(biāo)準(zhǔn)品以Adeasy腺病毒質(zhì)粒為例：

一個(gè)質(zhì)粒MW=36820bp×2×330=2.43×1072.43×107g/mol6.023×1023個(gè)分子/mol=4.03×10-17g一個(gè)質(zhì)粒(1copy)的質(zhì)量=拷貝數(shù)1031041051061071081091010標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒質(zhì)量4.03x10-144.03x10-134.03x10-124.03x10-114.03x10-104.03x10-94.03x10-84.03x10-7-計(jì)算出拷貝數(shù)（copies/ul）-梯度稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)品（大體積稀釋10μlto90μl）-定量PCR，檢查Ct值差異-產(chǎn)物跑膠鑒定大小如何制作標(biāo)準(zhǔn)品一個(gè)質(zhì)粒(1copy)的質(zhì)量=拷貝數(shù)103如何計(jì)算擴(kuò)增效率使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定引物擴(kuò)增效率Y=-3.488×logX+55.03R2=0.999E=93.5%E=10(-1/slope)－1如何計(jì)算擴(kuò)增效率使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定引物擴(kuò)增效率Y=-3.488利用TaqMan法研究ERBB2在正?；蛉橄倌[瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)差異已知在50%的乳腺腫瘤樣本中，ERBB2表達(dá)異常，因此可以作為一個(gè)檢測標(biāo)準(zhǔn)選用GAPDH作為內(nèi)標(biāo)基因FAM標(biāo)記的ERBB2探針VIC標(biāo)記的GAPDH探針構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線雙重PCR反應(yīng)陰性對照無RNA對照（空白）無逆轉(zhuǎn)錄酶對照（基因組）實(shí)例分析-2利用TaqMan法研究ERBB2在正?；蛉橄倌[瘤組織標(biāo)本中標(biāo)準(zhǔn)曲線Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2標(biāo)準(zhǔn)曲線Color2-VICdetectionfo樣品擴(kuò)增：正常vs腫瘤PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH腫瘤正常腫瘤正常樣品擴(kuò)增：正常vs腫瘤PMT1-FAMdetection-實(shí)驗(yàn)結(jié)果MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma28.4027.3628.4627.1228.43±0.0427.24±0.17ERBB2表達(dá)MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma23.2722.8123.4122.8623.34±0.1022.83±0.03GAPDH表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果MultiplexReactions:C(t)H實(shí)驗(yàn)結(jié)果HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copiesng/μlTotalRNAERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.0110.0180.018/0.011=1.6300.81.82HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpression實(shí)驗(yàn)結(jié)果HealthyTumorGAPDHERBB21095實(shí)驗(yàn)結(jié)果ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.182-ΔΔc(t)=1.51-1.93結(jié)果與雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法相近HealthyRNAERBB2GAPDHΔC(t)28.4023.275.3128.4623.415.0528.43±0.0428.34±0.105.18±0.18CarcinomaRNAERBB2GAPDHΔC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2626.24±0.1726.83±0.034.41±0.21實(shí)驗(yàn)結(jié)果ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.1131參照染料（ROX）53參照染料（ROX）參照染料選擇標(biāo)準(zhǔn)化熒光信號(hào)調(diào)整非PCR因素造成的誤差，如加樣誤差提供較穩(wěn)定的基線部分儀器在使用前會(huì)使用標(biāo)準(zhǔn)化熒光信號(hào)進(jìn)行校正參照染料的使用由儀器決定ABIandStratagene使用ROXBio-Rad使用標(biāo)準(zhǔn)化熒光信號(hào)Roche,Corbett,Cepheid和

MJResearch不使用內(nèi)參染料使用內(nèi)參染料使數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確參照染料選擇使用內(nèi)參染料使數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確133qPCR技術(shù)絕對定量VS相對定量一步法VS兩步法qRT-PCR概述核酸提取cDNA合成(兩步法

qRT-PCR)引物設(shè)計(jì)方法和原則樣品準(zhǔn)備必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)選擇相應(yīng)的熒光檢測方法試劑選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析擴(kuò)增曲線、溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)常見問題分析數(shù)據(jù)分析55qPCR技術(shù)概述核酸提取樣品準(zhǔn)備必要的對照、內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)實(shí)134判斷數(shù)據(jù)有效性56判斷數(shù)據(jù)有效性135用擴(kuò)增曲線檢驗(yàn)qPCR體系用融解曲線檢驗(yàn)qPCR體系用標(biāo)準(zhǔn)曲線檢驗(yàn)qPCR體系用No-TemplateControl(

NTC)檢驗(yàn)qPCR體系（引物）用NoRTControl檢驗(yàn)qPCR體系（模板）57用擴(kuò)增曲線檢驗(yàn)qPCR體系擴(kuò)增曲線平滑起始無擴(kuò)增起峰時(shí)間正常NTC和NRC無擴(kuò)增或擴(kuò)增起峰較晚CT值是判斷實(shí)驗(yàn)成功與否的重要參考擴(kuò)增曲線CT值是判斷實(shí)驗(yàn)成功與否的重要參考Ct值的可信范圍臨床檢驗(yàn)小于33科學(xué)研究小于38內(nèi)參基因小于20，樣品間差距不超過1復(fù)孔不超過0.5CT值是判斷實(shí)驗(yàn)成功與否的重要參考Ct值的可信范圍臨床檢驗(yàn)CT值是判斷實(shí)驗(yàn)成功與否的重要參考138溶解曲線分析呈現(xiàn)單峰峰的寬度較小NTC和NRC均無較高的峰出現(xiàn)60溶解曲線分析呈現(xiàn)單峰139擴(kuò)增效率r2=0.999Slope=-3.364E=10(-1/slope)－1

r2:0.95~1Slope:-3.58~-3.10E:90%~110%61擴(kuò)增效率r2=0.999Slope=-3.364熒光定量PCR--NTCNTCNTC—反應(yīng)是否存在污染NTC—引物是否特異，是否會(huì)形成引物二聚體NTC的最佳狀況NTC的CT值為零，擴(kuò)增曲線與基線重合NTC的CT值與全管反應(yīng)物的CT值相差5以上或10以上熒光定量PCR--NTCNTCNTC—反應(yīng)是否存在污染NT熒光定量PCR--NTC引物二聚體熒光定量PCR--NTC引物二聚體NoRTControlRT反應(yīng)中的陰性對照，即不加入RT酶的反應(yīng)目的：檢測RNA中是否有基因組DNA的殘留將NoRTControl產(chǎn)物與正常cDNA同時(shí)進(jìn)行qPCR觀察其結(jié)果，判斷正常cDNA的擴(kuò)增結(jié)果是否可信、該RNA是否可用NoRTControlRT反應(yīng)中的陰性對照，即不加入RT熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)參考范圍數(shù)據(jù)名稱參考范圍Tm>80℃CT18-30cyclesR2>0.95Slope(-3.58)-(-3.10)Efficiency90%-110%NTCCT(NTC)=0CT(NTC)－CT(樣品)≥5NRCCT(NTC)=0CT(NTC)－CT(樣品)≥5熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)參考范圍數(shù)據(jù)名稱參考范圍Tm>80℃C144熒光定量PCR問題解析66熒光定量PCR問題解析145擴(kuò)增曲線分析基線設(shè)置是否正確基線校準(zhǔn)基線開始值(3-10)基線終止值（指數(shù)期之前）閾值設(shè)置是否正確設(shè)置在指數(shù)增長期(可自動(dòng)或手動(dòng)設(shè)置）67擴(kuò)增曲線分析基線設(shè)置是否正確146擴(kuò)增曲線分析初始擴(kuò)增不規(guī)則主要由于模板中存在抑制物。樣品擴(kuò)增過早是由于初始模板濃度太高。68擴(kuò)增曲線分析初始擴(kuò)增不規(guī)則主要由于模板中存在抑制物。147擴(kuò)增曲線分析曲線不平滑探針或熒光染料品質(zhì)不好儀器使用過度，熒光收集不穩(wěn)定儀器未經(jīng)過校正（包括自動(dòng)校正或ROX校正)體系中抑制物較多，導(dǎo)致熒光不穩(wěn)定69擴(kuò)增曲線分析曲線不平滑探針或熒光染料品質(zhì)不好擴(kuò)增曲線問題-精密度差加樣誤差，體系配置錯(cuò)誤，反應(yīng)液沒有混勻。低拷貝基因或模板濃