熒光定量原理與分析方法08年教學(xué)課件

TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD熒光定量原理與分析方法TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,1內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類絕對定量分析方法簡介相對定量分析方法簡介SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反響中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)展定量分析與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對PCR擴(kuò)增反響的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)展定量和定性分析無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反響實(shí)時(shí)檢測實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－定義實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：與常規(guī)PCR技術(shù)比較：實(shí)時(shí)熒光定量PC

擴(kuò)增曲線熒光閾值Ct值實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－常用名詞概念擴(kuò)增曲線實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－常用名詞概念Cycle〔循環(huán)數(shù)〕Rn〔熒光強(qiáng)度〕BaselineLog－linerphaseLog－linerphase熒光基團(tuán)熒光檢測元件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－什么是擴(kuò)增曲線Cycle〔循環(huán)數(shù)〕Rn〔熒光強(qiáng)度〕BaselineLog－Cycle〔循環(huán)數(shù)〕Rn〔熒光強(qiáng)度〕BaselineLog－linerphaseLog－linerphase前15個(gè)循環(huán)信號作為熒光本底信號〔baseline〕熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段真正的信號:熒光信號超過域值Threshold實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－什么是熒光域值Cycle〔循環(huán)數(shù)〕Rn〔熒光強(qiáng)度〕BaselineLog－Cycle〔循環(huán)數(shù)〕Rn〔熒光強(qiáng)度〕Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t)value實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－什么是Ct值Cycle〔循環(huán)數(shù)〕Rn〔熒光強(qiáng)度〕Ct值的定義：C(t)橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點(diǎn)：一樣模板進(jìn)展96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－

Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點(diǎn)：實(shí)時(shí)熒光理想的PCR反響Xn＝X02n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理理想的PCR反響Xn＝X02n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增非理想的PCR反響Xn＝X0〔1＋En〕n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)En：擴(kuò)增效率實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理非理想的PCR反響Xn＝X0〔1＋En〕n*Xn：第n在擴(kuò)增產(chǎn)物到達(dá)熒光閾值時(shí)XCt＝X0〔1＋En〕Ct＝M〔1〕*XCt：熒光擴(kuò)增信號到達(dá)閾值時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個(gè)常數(shù)，定為M方程式〔1〕兩邊同取對數(shù)得：LogM＝LogX0*〔1＋En〕Ct〔2〕整理方程式〔2〕：LogX0＝LogM－CtLog〔1＋En〕實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理在擴(kuò)增產(chǎn)物到達(dá)熒光閾值時(shí)XCt＝X0〔1＋En〕Ct＝CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration模板DNA量越多，熒光到達(dá)域值的循環(huán)數(shù)越少Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系LogX0＝LogM－CtLog〔1＋En〕實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理CyclenumberCk104Ck102Sample內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類絕對定量分析方法簡介相對定量分析方法簡介SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類不同的熒光標(biāo)記方法不同的應(yīng)用目的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類不同的熒光標(biāo)記方法特異性熒光標(biāo)記：1.TaqMan2.MolecularBeacon非特異性熒光標(biāo)記：

3.SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－常用熒光標(biāo)記方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－常用熒光標(biāo)記方法1、TaqMan---水解型雜交探針

5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類1、TaqMan---水解型雜交探針5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－TaqMan法的工作原理每擴(kuò)增一條DNA分子釋放一個(gè)熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點(diǎn)檢測熒光實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－TaqMan法的工作原理每擴(kuò)增一實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類1、引物、探針的設(shè)計(jì)：探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會(huì)淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反響參數(shù)確實(shí)定：一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S〔Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高〕也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度

3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：50-900nM探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR一樣TaqMan法PCR反響的建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類1、引物、探針的設(shè)計(jì)：Taq對目標(biāo)序列的高特異性陰性結(jié)果確定設(shè)計(jì)相對簡單與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好優(yōu)點(diǎn)

只適合一個(gè)特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高不易找到本底低的探針缺點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－Taqman法優(yōu)缺點(diǎn)對目標(biāo)序列的高特異性優(yōu)點(diǎn)只適合一個(gè)特定的目標(biāo)缺標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑2、分子信標(biāo)(MolecularBeacon)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)莖熒光素淬滅劑2、分子信標(biāo)(實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類FRET分子信標(biāo)工作原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類FRET分子信標(biāo)工作原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－分子信標(biāo)優(yōu)缺點(diǎn)高特異性：對目標(biāo)序列檢測SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)點(diǎn)

只能用于一個(gè)特定目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格比較高缺點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－分子信標(biāo)優(yōu)缺點(diǎn)高特異性：對目標(biāo)序3、SYBRGreen法SYBRGreenSYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光；變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類3、SYBRGreen法SYBRGreenSYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－SYBRGreen染料SYBRGreen結(jié)合到DNA小溝部位示意圖實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－SYBRGreen染料SYB將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類原始圖譜對數(shù)圖譜SYBRGreen法融解曲線定義將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)實(shí)時(shí)熒光定量PC融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類SYBRGreen法融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針非常靈敏具有價(jià)格優(yōu)勢優(yōu)點(diǎn)容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反響條件對引物特異性要求較高缺點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－SYBR方法的優(yōu)缺點(diǎn)對DNA模板沒有選擇性優(yōu)點(diǎn)容易與非特異性雙鏈DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－幾種方法的比較方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍SYBRGreenI方法適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動(dòng)植物的研究TaqMan方法特異性高重復(fù)性好價(jià)格高只適合特定目標(biāo)病原體檢測，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷MolecularBeacon法(分子信標(biāo))高特異性熒光背景低只適合特定目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格高特定基因分析SNP分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－幾種方法的比較方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用范實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類不同的熒光標(biāo)記方法不同的應(yīng)用目的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類不同的熒光標(biāo)記方法定性分析研究：雜合或純合子鑒定，〔SNPs〕分析等絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量，GMO定量檢測等相對定量研究：mRNA表達(dá)量分析，siRNA效果確認(rèn)，基因芯片結(jié)果驗(yàn)證，差異顯示結(jié)果驗(yàn)證等實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用定性分析研究：雜合或純合子鑒定，〔SNPs〕分析等實(shí)時(shí)熒光內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類絕對定量分析方法簡介相對定量分析方法簡介SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理Sample25絕對定量分析方法簡介－－絕對定量定義Log〔起始濃度〕與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴(kuò)增反響存在的線性關(guān)系根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量Sample25絕對定量分析方法簡介－－絕對定量定義Log未知樣品與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)展比較標(biāo)準(zhǔn)品的一些標(biāo)準(zhǔn)：必需用與擴(kuò)增目的基因一樣的引物進(jìn)展擴(kuò)增，并且擴(kuò)增效率一樣標(biāo)準(zhǔn)品必需是經(jīng)過準(zhǔn)確定量的〔例如，用分光光度計(jì)定量〕標(biāo)準(zhǔn)品必需是標(biāo)準(zhǔn)化的〔例如，同一化的細(xì)胞數(shù)〕在每組實(shí)驗(yàn)時(shí)，必需用一樣的閾值設(shè)定來確定Ct值絕對定量分析方法簡介－－絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)品未知樣品與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)展比較標(biāo)準(zhǔn)品的一些標(biāo)準(zhǔn)：絕對定量分絕對定量分析方法簡介－－標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備絕對定量分析方法簡介－－標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備拷貝數(shù)的計(jì)算待測樣本濃度〔ng/ul〕＝OD260×40×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測樣本拷貝數(shù)〔copies/ul〕=待測樣本濃度/樣本分子量×6×1014倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v絕對定量分析方法簡介拷貝數(shù)的計(jì)算倍比梯度稀釋方法：絕對定量分析方法簡介乙肝病人血液中HBV的絕對定量目的：利用核酸檢測，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，提高靈敏度，為診斷用藥提供依據(jù)方法：從血液中提取病毒DNA，擴(kuò)增病毒基因，以TaqMan探針進(jìn)展檢測試劑：TIANGEN公司探針法試劑RealMasterMix〔Probe〕目錄號〔FP203〕設(shè)置對照：濃度為106、105、104、103的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè)，設(shè)陰性和空白對照實(shí)驗(yàn)步驟：提取HBVDNA設(shè)計(jì)特異引物設(shè)計(jì)TaqMan探針并標(biāo)記探針擴(kuò)增程序結(jié)果：獲取血液樣品中HBVDNA的準(zhǔn)確copy數(shù)絕對定量分析方法簡介－－舉例1乙肝病人血液中HBV的絕對定量絕對定量分析方法簡介－－舉例1絕對定量舉例：HBV病毒檢測以Taqman探針進(jìn)展Sample:HBV陽性標(biāo)準(zhǔn)品，分別含有5×103、5×104、5×105、5×106copies/mlcopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD5×10328.1828.6428.410.165×10425.2525.1425.190.045×10522.1122.4622.280.125×10618.6318.9218.770.10BLANKNoneNone實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：絕對定量分析方法簡介－－舉例2絕對定量舉例：HBV病毒檢測以Taqman探針進(jìn)展Sa擴(kuò)增效率〔E〕計(jì)算E=10-1/斜率=10-1/-3.17=2.03E%=(2.03-1)×100%=103%標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.17x+37.52R2=0.9988絕對定量分析方法簡介－－舉例2擴(kuò)增效率〔E〕計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標(biāo)如未知樣本Ct為20.5標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線將Ct值帶入線性方程：20.5=-3.1726X+37.52X=20.5-37.517-3.1726=5.36QuantityUnknown=105.36

=229087copiesy=-3.17x+37.52R2=0.9988絕對定量分析方法簡介－－舉例2如未知樣本Ct為20.5標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類絕對定量分析方法簡介相對定量分析方法簡介SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理相對定量分析方法簡介－－為什么要用相對定量模板均一性問題：起始的細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞的狀態(tài)、均一性等RNA制備：RNA純化得率、均一性等反轉(zhuǎn)錄：反轉(zhuǎn)錄的效率等

相對定量分析方法簡介－－為什么要用相對定量相對定量分析方法簡介－－內(nèi)參照GAPDHBeta-actinbeta-2-microglobulin(B2M)ribosomalproteinL13a(RPL13A)PPIA(Cyclophilin)ubiquitinC(UBC)eukaryotictranslationinitiationfactors4A(eIF4A)18SrRNA……相對定量分析方法簡介－－內(nèi)參照GAPDH方法：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

2－

△△Ct

相對定量分析方法簡介－－幾種不同的相對定量方法方法：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對定量分析方法簡介對照樣品目的基因濃度待測樣品參照基因濃度優(yōu)點(diǎn)：分析簡單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化簡單缺點(diǎn)：對每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線；必需有固定的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線；這些標(biāo)準(zhǔn)品并不代表樣品擴(kuò)增的真實(shí)狀態(tài)應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一F=待測樣品目的基因濃度對照樣品參照基因濃度公式：相對定量分析方法簡介－－雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對照樣品目的基因濃度待測樣品參照基因濃度優(yōu)點(diǎn)：分析簡單，實(shí)驗(yàn)相對定量分析方法簡介——??Ct法：公式：———優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)化的體系建立后，每次實(shí)驗(yàn)中無需再對看家基因和目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而只需對待測樣品分別進(jìn)展PCR擴(kuò)增即可要求：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率差值<0.1缺點(diǎn)：假定擴(kuò)增效率為100%；假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之際間的效率都保持一致；實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化較為復(fù)雜應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一待測組目的基因平均Ct值待測組看家基因平均Ct值對照組目的基因平均Ct值對照組看家基因平均Ct值F=2-相對定量分析方法簡介——??Ct法：公式：待測組目的基因平均實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：Sample處理前處理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952-

△△Ct法：假設(shè)目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近100％，且相對偏差不超過5％△Ct〔處理前〕＝18－17＝1△Ct〔處理后〕＝16－17.4=－1.4△△Ct=△Ct〔處理后〕－△Ct〔處理前〕＝－1.4－1＝－2.4比率〔處理后/處理前〕=2－△△Ct＝2－〔－2.4〕＝5.3所以Jun基因在處理后表達(dá)水平比處理前高5.3倍修正方法：如果我們知道目標(biāo)基因和參照基因有一樣的或增效率，但擴(kuò)增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正為：E－△△Ct，例如擴(kuò)增效率為1.95，那么計(jì)算公式可修正為1.95－△△Ct相對定量分析方法簡介－－??Ct法舉例實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：Sample處理前處理后Jun(MeanCt內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類絕對定量分析方法簡介相對定量分析方法簡介SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知樣品制備模板準(zhǔn)備引物設(shè)計(jì)反響條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數(shù)據(jù)分析儀器介紹RT上機(jī)反響體系優(yōu)化試劑選擇分析方法SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知樣品制備模板準(zhǔn)備引物設(shè)計(jì)反響條件樣品制備環(huán)境要求模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)濃度確定SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知無RNase環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具高純度，濃度均一的RNA分光光度計(jì)檢測電泳檢測樣品制備環(huán)境要求模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)濃度確定SYBR法實(shí)RT反響體系優(yōu)化試劑選擇樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析上機(jī)AMVM-MLVQuantSuper下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積選擇應(yīng)用引物高效、全長的cDNASYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知RT反響體系優(yōu)化試劑選擇樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析上機(jī)AMV下模板準(zhǔn)備引物設(shè)計(jì)濃度確定環(huán)境要求誤差控制RT樣品制備數(shù)據(jù)分析上機(jī)核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定濃度區(qū)間評價(jià)引物使用mix降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復(fù)（≥3次）設(shè)置空白和陰性對照均一的反應(yīng)液和模板混合物GC％：50－60％Tm：50－65℃單個(gè)堿基重復(fù)＜4個(gè)無二級結(jié)構(gòu)擴(kuò)增長度：100－200bp模板準(zhǔn)備引物設(shè)計(jì)濃度確定環(huán)境要求誤差控制RT樣品制備數(shù)據(jù)分析反響體系優(yōu)化上機(jī)反響條件優(yōu)化RT樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析反應(yīng)體積＞5ul，推薦20－50ulMg2＋調(diào)節(jié)，酶活調(diào)節(jié)引物濃度優(yōu)化，模板量優(yōu)化退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時(shí)間：產(chǎn)物長度決定擴(kuò)增效率：90％－110％重復(fù)性：std＜0.2標(biāo)準(zhǔn)曲線：R＞0.99或R2＞0.98SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知標(biāo)準(zhǔn)品待測樣本陽性對照陰性對照反響體系優(yōu)化上機(jī)反響條件優(yōu)化RT樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析反應(yīng)技能要求誤差控制儀器介紹上機(jī)試劑選擇RT樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析自配realmastermixRCHO-LightcyclerseriesROTOGEN-RGseriesBIO-RADOpticonseriesABI-7seriesBioer－Linegeneseries分裝控制內(nèi)參控制機(jī)器校正控制平滑曲線，重復(fù)性好，靈敏度高SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知技能要求誤差控制儀器介紹上機(jī)試劑選擇RT樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)

Rotor-gene6000MiniOpticonMx3005PTM

LINE-GENEFQD-66A

ABIPRISM7500iQ5Real-TimePCRDetectionSystem

Rotor-gene6000MiniOpticonMx數(shù)據(jù)分析儀器介紹分析方法上機(jī)RT樣品制備模板準(zhǔn)備相對定量：2－△△Ct法絕對定量：標(biāo)準(zhǔn)曲線法可靠，準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知數(shù)據(jù)分析儀器介紹分析方法上機(jī)RT樣品制備模板準(zhǔn)備相對定量：2SYBR法理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果－－梯度稀釋擴(kuò)增曲線梯度稀釋擴(kuò)增曲線SYBR法理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果－－梯度稀釋擴(kuò)增曲線梯度稀釋擴(kuò)增曲線SYBR法理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果－－梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-3.37x+36.33;R2=0.992梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線SYBR法理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果－－梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-3.37x+SYBR法理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果－－熔解曲線梯度稀釋熔解曲線SYBR法理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果－－熔解曲線梯度稀釋熔解曲線SYBR法理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果－－樣本擴(kuò)增曲線JUNGAPDHSYBR法理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果－－樣本擴(kuò)增曲線JUNGAPDH理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果－－樣本熔解曲線GAPDHJUN理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果－－樣本熔解曲線GAPDHJUNTIANGEN公司熒光產(chǎn)品SYBR法探針法FP203RealMasterMix(Probe)以DNA為模板FP202RealMasterMix〔SYBRGreen〕以RNA為模板FP302QuantqRT-PCR(SYBRGreen)FP303QuantOneStepqRT-PCR(SYBRGreen)TIANGEN公司熒光產(chǎn)品SYBR法探針法FP203ReTIANGEN公司熒光產(chǎn)品特點(diǎn)試劑盒中使用改進(jìn)后的HotmasterTaqPolymerase，具有高效率、高靈敏度、高特異性特點(diǎn)多種不同的實(shí)驗(yàn)緩沖液，滿足不同實(shí)驗(yàn)需求高效的Quant系列逆轉(zhuǎn)錄酶，滿足RT需求獨(dú)特的Mg2＋自動(dòng)調(diào)節(jié)，隨時(shí)保證為PCR提供最正確Mg2＋濃度TIANGEN公司熒光產(chǎn)品特點(diǎn)試劑盒中使用改進(jìn)后的Hotma謝謝！謝謝！TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD熒光定量原理與分析方法TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,64內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類絕對定量分析方法簡介相對定量分析方法簡介SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反響中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)展定量分析與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對PCR擴(kuò)增反響的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)展定量和定性分析無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反響實(shí)時(shí)檢測實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－定義實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：與常規(guī)PCR技術(shù)比較：實(shí)時(shí)熒光定量PC

擴(kuò)增曲線熒光閾值Ct值實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－常用名詞概念擴(kuò)增曲線實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－常用名詞概念Cycle〔循環(huán)數(shù)〕Rn〔熒光強(qiáng)度〕BaselineLog－linerphaseLog－linerphase熒光基團(tuán)熒光檢測元件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－什么是擴(kuò)增曲線Cycle〔循環(huán)數(shù)〕Rn〔熒光強(qiáng)度〕BaselineLog－Cycle〔循環(huán)數(shù)〕Rn〔熒光強(qiáng)度〕BaselineLog－linerphaseLog－linerphase前15個(gè)循環(huán)信號作為熒光本底信號〔baseline〕熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段真正的信號:熒光信號超過域值Threshold實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－什么是熒光域值Cycle〔循環(huán)數(shù)〕Rn〔熒光強(qiáng)度〕BaselineLog－Cycle〔循環(huán)數(shù)〕Rn〔熒光強(qiáng)度〕Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t)value實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－什么是Ct值Cycle〔循環(huán)數(shù)〕Rn〔熒光強(qiáng)度〕Ct值的定義：C(t)橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點(diǎn)：一樣模板進(jìn)展96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－

Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點(diǎn)：實(shí)時(shí)熒光理想的PCR反響Xn＝X02n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理理想的PCR反響Xn＝X02n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增非理想的PCR反響Xn＝X0〔1＋En〕n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)En：擴(kuò)增效率實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理非理想的PCR反響Xn＝X0〔1＋En〕n*Xn：第n在擴(kuò)增產(chǎn)物到達(dá)熒光閾值時(shí)XCt＝X0〔1＋En〕Ct＝M〔1〕*XCt：熒光擴(kuò)增信號到達(dá)閾值時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個(gè)常數(shù)，定為M方程式〔1〕兩邊同取對數(shù)得：LogM＝LogX0*〔1＋En〕Ct〔2〕整理方程式〔2〕：LogX0＝LogM－CtLog〔1＋En〕實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理在擴(kuò)增產(chǎn)物到達(dá)熒光閾值時(shí)XCt＝X0〔1＋En〕Ct＝CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration模板DNA量越多，熒光到達(dá)域值的循環(huán)數(shù)越少Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系LogX0＝LogM－CtLog〔1＋En〕實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理CyclenumberCk104Ck102Sample內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類絕對定量分析方法簡介相對定量分析方法簡介SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類不同的熒光標(biāo)記方法不同的應(yīng)用目的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類不同的熒光標(biāo)記方法特異性熒光標(biāo)記：1.TaqMan2.MolecularBeacon非特異性熒光標(biāo)記：

3.SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－常用熒光標(biāo)記方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－常用熒光標(biāo)記方法1、TaqMan---水解型雜交探針

5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類1、TaqMan---水解型雜交探針5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－TaqMan法的工作原理每擴(kuò)增一條DNA分子釋放一個(gè)熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點(diǎn)檢測熒光實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－TaqMan法的工作原理每擴(kuò)增一實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類1、引物、探針的設(shè)計(jì)：探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會(huì)淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反響參數(shù)確實(shí)定：一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S〔Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高〕也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度

3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：50-900nM探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR一樣TaqMan法PCR反響的建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類1、引物、探針的設(shè)計(jì)：Taq對目標(biāo)序列的高特異性陰性結(jié)果確定設(shè)計(jì)相對簡單與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好優(yōu)點(diǎn)

只適合一個(gè)特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高不易找到本底低的探針缺點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－Taqman法優(yōu)缺點(diǎn)對目標(biāo)序列的高特異性優(yōu)點(diǎn)只適合一個(gè)特定的目標(biāo)缺標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑2、分子信標(biāo)(MolecularBeacon)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)莖熒光素淬滅劑2、分子信標(biāo)(實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類FRET分子信標(biāo)工作原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類FRET分子信標(biāo)工作原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－分子信標(biāo)優(yōu)缺點(diǎn)高特異性：對目標(biāo)序列檢測SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)點(diǎn)

只能用于一個(gè)特定目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格比較高缺點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－分子信標(biāo)優(yōu)缺點(diǎn)高特異性：對目標(biāo)序3、SYBRGreen法SYBRGreenSYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光；變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類3、SYBRGreen法SYBRGreenSYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－SYBRGreen染料SYBRGreen結(jié)合到DNA小溝部位示意圖實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－SYBRGreen染料SYB將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類原始圖譜對數(shù)圖譜SYBRGreen法融解曲線定義將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)實(shí)時(shí)熒光定量PC融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類SYBRGreen法融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針非常靈敏具有價(jià)格優(yōu)勢優(yōu)點(diǎn)容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反響條件對引物特異性要求較高缺點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－SYBR方法的優(yōu)缺點(diǎn)對DNA模板沒有選擇性優(yōu)點(diǎn)容易與非特異性雙鏈DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－幾種方法的比較方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍SYBRGreenI方法適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動(dòng)植物的研究TaqMan方法特異性高重復(fù)性好價(jià)格高只適合特定目標(biāo)病原體檢測，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷MolecularBeacon法(分子信標(biāo))高特異性熒光背景低只適合特定目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格高特定基因分析SNP分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－幾種方法的比較方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用范實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類不同的熒光標(biāo)記方法不同的應(yīng)用目的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類不同的熒光標(biāo)記方法定性分析研究：雜合或純合子鑒定，〔SNPs〕分析等絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量，GMO定量檢測等相對定量研究：mRNA表達(dá)量分析，siRNA效果確認(rèn)，基因芯片結(jié)果驗(yàn)證，差異顯示結(jié)果驗(yàn)證等實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用定性分析研究：雜合或純合子鑒定，〔SNPs〕分析等實(shí)時(shí)熒光內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類絕對定量分析方法簡介相對定量分析方法簡介SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理Sample25絕對定量分析方法簡介－－絕對定量定義Log〔起始濃度〕與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴(kuò)增反響存在的線性關(guān)系根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量Sample25絕對定量分析方法簡介－－絕對定量定義Log未知樣品與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)展比較標(biāo)準(zhǔn)品的一些標(biāo)準(zhǔn)：必需用與擴(kuò)增目的基因一樣的引物進(jìn)展擴(kuò)增，并且擴(kuò)增效率一樣標(biāo)準(zhǔn)品必需是經(jīng)過準(zhǔn)確定量的〔例如，用分光光度計(jì)定量〕標(biāo)準(zhǔn)品必需是標(biāo)準(zhǔn)化的〔例如，同一化的細(xì)胞數(shù)〕在每組實(shí)驗(yàn)時(shí)，必需用一樣的閾值設(shè)定來確定Ct值絕對定量分析方法簡介－－絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)品未知樣品與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)展比較標(biāo)準(zhǔn)品的一些標(biāo)準(zhǔn)：絕對定量分絕對定量分析方法簡介－－標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備絕對定量分析方法簡介－－標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備拷貝數(shù)的計(jì)算待測樣本濃度〔ng/ul〕＝OD260×40×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測樣本拷貝數(shù)〔copies/ul〕=待測樣本濃度/樣本分子量×6×1014倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v絕對定量分析方法簡介拷貝數(shù)的計(jì)算倍比梯度稀釋方法：絕對定量分析方法簡介乙肝病人血液中HBV的絕對定量目的：利用核酸檢測，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，提高靈敏度，為診斷用藥提供依據(jù)方法：從血液中提取病毒DNA，擴(kuò)增病毒基因，以TaqMan探針進(jìn)展檢測試劑：TIANGEN公司探針法試劑RealMasterMix〔Probe〕目錄號〔FP203〕設(shè)置對照：濃度為106、105、104、103的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè)，設(shè)陰性和空白對照實(shí)驗(yàn)步驟：提取HBVDNA設(shè)計(jì)特異引物設(shè)計(jì)TaqMan探針并標(biāo)記探針擴(kuò)增程序結(jié)果：獲取血液樣品中HBVDNA的準(zhǔn)確copy數(shù)絕對定量分析方法簡介－－舉例1乙肝病人血液中HBV的絕對定量絕對定量分析方法簡介－－舉例1絕對定量舉例：HBV病毒檢測以Taqman探針進(jìn)展Sample:HBV陽性標(biāo)準(zhǔn)品，分別含有5×103、5×104、5×105、5×106copies/mlcopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD5×10328.1828.6428.410.165×10425.2525.1425.190.045×10522.1122.4622.280.125×10618.6318.9218.770.10BLANKNoneNone實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：絕對定量分析方法簡介－－舉例2絕對定量舉例：HBV病毒檢測以Taqman探針進(jìn)展Sa擴(kuò)增效率〔E〕計(jì)算E=10-1/斜率=10-1/-3.17=2.03E%=(2.03-1)×100%=103%標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.17x+37.52R2=0.9988絕對定量分析方法簡介－－舉例2擴(kuò)增效率〔E〕計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標(biāo)如未知樣本Ct為20.5標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線將Ct值帶入線性方程：20.5=-3.1726X+37.52X=20.5-37.517-3.1726=5.36QuantityUnknown=105.36

=229087copiesy=-3.17x+37.52R2=0.9988絕對定量分析方法簡介－－舉例2如未知樣本Ct為20.5標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類絕對定量分析方法簡介相對定量分析方法簡介SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理相對定量分析方法簡介－－為什么要用相對定量模板均一性問題：起始的細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞的狀態(tài)、均一性等RNA制備：RNA純化得率、均一性等反轉(zhuǎn)錄：反轉(zhuǎn)錄的效率等

相對定量分析方法簡介－－為什么要用相對定量相對定量分析方法簡介－－內(nèi)參照GAPDHBeta-actinbeta-2-microglobulin(B2M)ribosomalproteinL13a(RPL13A)PPIA(Cyclophilin)ubiquitinC(UBC)eukaryotictranslationinitiationfactors4A(eIF4A)18SrRNA……相對定量分析方法簡介－－內(nèi)參照GAPDH方法：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

2－

△△Ct

相對定量分析方法簡介－－幾種不同的相對定量方法方法：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對定量分析方法簡介對照樣品目的基因濃度待測樣品參照基因濃度優(yōu)點(diǎn)：分析簡單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化簡單缺點(diǎn)：對每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線；必需有固定的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線；這些標(biāo)準(zhǔn)品并不代表樣品擴(kuò)增的真實(shí)狀態(tài)應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一F=待測樣品目的基因濃度對照樣品參照基因濃度公式：相對定量分析方法簡介－－雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對照樣品目的基因濃度待測樣品參照基因濃度優(yōu)點(diǎn)：分析簡單，實(shí)驗(yàn)相對定量分析方法簡介——??Ct法：公式：———優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)化的體系建立后，每次實(shí)驗(yàn)中無需再對看家基因和目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而只需對待測樣品分別進(jìn)展PCR擴(kuò)增即可要求：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率差值<0.1缺點(diǎn)：假定擴(kuò)增效率為100%；假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之際間的效率都保持一致；實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化較為復(fù)雜應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一待測組目的基因平均Ct值待測組看家基因平均Ct值對照組目的基因平均Ct值對照組看家基因平均Ct值F=2-相對定量分析方法簡介——??Ct法：公式：待測組目的基因平均實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：Sample處理前處理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952-

△△Ct法：假設(shè)目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近100％，且相對偏差不超過5％△Ct〔處理前〕＝18－17＝1△Ct〔處理后〕＝16－17.4=－1.4△△Ct=△Ct〔處理后〕－△Ct〔處理前〕＝－1.4－1＝－2.4比率〔處理后/處理前〕=2－△△Ct＝2－〔－2.4〕＝5.3所以Jun基因在處理后表達(dá)水平比處理前高5.3倍修正方法：如果我們知道目標(biāo)基因和參照基因有一樣的或增效率，但擴(kuò)增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正為：E－△△Ct，例如擴(kuò)增效率為1.95，那么計(jì)算公式可修正為1.95－△△Ct相對定量分析方法簡介－－??Ct法舉例實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：Sample處理前處理后Jun(MeanCt內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類絕對定量分析方法簡介相對定量分析方法簡介SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知內(nèi)容概要實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及本卷須知樣品制備模板準(zhǔn)備引物設(shè)計(jì)反響條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控