基因工程第二章Jun

第二章

基因工程中常用的工具酶基因工程的基本流程TOOLSFORGENECLONINGSCISSORS:RESTRICTIONENZYMESGLUE:DNALIGASEVEHICLE:PLASMIDORVIRALVECTORS第二章

基因工程中常用的工具酶

第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體外切割第二節(jié)

DNA連接酶和DNA分子的體外連接第三節(jié)

其他工具酶一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性內(nèi)切酶的定義三、限制性內(nèi)切酶的命名四、限制性內(nèi)切酶的分類五、II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體外切割一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和細(xì)菌的限制—修飾作用1、細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)1950年代初期，兩組科學(xué)家?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了限制修飾現(xiàn)象，當(dāng)時稱為宿主專一性:1952年，Luria,Humann等：T偶數(shù)噬菌體,

1953年，Bertani,Weigle等：λ和P2噬菌體。大量的研究結(jié)果證實(shí)λ噬菌體所表現(xiàn)的宿主限制和修飾現(xiàn)象更具普遍性和代表性。E.coli-λ噬菌體的限制修飾模式

噬菌體在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時會受到限制。仍有少量λ(K)可在E.coliB中生存，是因E.coliB對λ(K)進(jìn)行了修飾。1959年，瑞士塞爾生物研究中心Arber提出限制一修飾理論：

核酸內(nèi)切酶降解細(xì)菌外源DNA,

修飾酶保護(hù)自身DNA2.細(xì)菌的限制—修飾理論的提出侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA（非甲基化），能被限制性內(nèi)切酶識別和降解，細(xì)菌通過這種方式進(jìn)行自我保護(hù)。細(xì)菌自身的DNA可被甲基化酶修飾，①Dam甲基化酶--在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。②Dcm甲基化酶--在CCAGG序列的第2個胞嘧啶C5位引入甲基。2.細(xì)菌的限制—修飾理論細(xì)菌自身的DNA可被甲基化酶修飾，從而防止限制性內(nèi)切酶的識別和水解。WernerArber于1962-1968年發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)限限制制與與修修飾飾體體系系，，1968年分分離離得得到到I型限限制制酶酶EcoB.1970年，，H.Smith首次次從從流流感感嗜嗜血血桿桿菌菌（（H.influenzae）中發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)并并分分離離到到II型限制酶HindⅡ.1971年，D.Nathans用HindII繪制了猿猴病病毒SV40的限制酶譜。。Arber,Smith和Nathans獲得了1978年Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)學(xué)獎。3.限制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)到1986年下半年，發(fā)發(fā)現(xiàn)615種限制酶和98種甲基化酶。。到2006年2月，共發(fā)現(xiàn)4583種限制酶和甲甲基化酶，其其中限制酶有有3773種，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型限制酶各有有68、3692、10種。3.限制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)一、限制性內(nèi)內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)二、限制性內(nèi)內(nèi)切酶的定義義三、限制性內(nèi)內(nèi)切酶的命名名四、限制性內(nèi)內(nèi)切酶的分類類五、II型限制內(nèi)切酶酶的基本特性性六、影響酶活活性的因素七、限制內(nèi)切切酶的用途第一節(jié)限制制性核酸內(nèi)切切酶與DNA分子的體外切切割限制性內(nèi)切酶酶系統(tǒng)中有兩兩個部分組成成：1.核酸酶2.甲基化酶?來源：細(xì)菌染染色體、噬菌菌體/病毒?限制性內(nèi)切酶酶不僅受病毒毒感染的影響響，還可隨DNA的連接、轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染而傳傳給其他個體體二、限制性核核酸內(nèi)切酶的的定義?限制性內(nèi)切酶酶是一組組可以特異性性地識別DNA上的某一特定定序列，并將將之水解的核核酸酶。限制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶，是一一類能夠識別別雙鏈DNA分子中的某種種特定核苷酸酸序列，并由由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核核酸內(nèi)切酶。。限制酶裂解DNA雙鏈的磷酸二二酯鍵酶切得到5`-P和3`-OH一、限制性內(nèi)內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)二、限制性內(nèi)內(nèi)切酶的定義義三、限制性內(nèi)內(nèi)切酶的命名名四、限制性內(nèi)內(nèi)切酶的分類類五、II型限制內(nèi)切酶酶的基本特性性六、影響酶活活性的因素七、限制內(nèi)切切酶的用途第一節(jié)限制制性核酸內(nèi)切切酶與DNA分子的體外切切割三、限制性核核酸內(nèi)切酶的的命名①第1個字母大寫，，表示來源物物種屬名的第第一個字母。。②第2、3個字母母小寫寫，表表示來來源物物種種種名的的前二二個字字母。。③如果果細(xì)菌菌有不不同的的血清清型，，則有有第四四個字字母，，小寫寫，且且與前前3個字母母緊緊緊排在在一起起。HindⅢ：Haemophilusinfluensaed④當(dāng)控制制宿主主的限限制、、修飾飾系統(tǒng)統(tǒng)的遺遺傳因因子位位于病病毒和和質(zhì)粒粒上時時，需需要在在名稱稱中標(biāo)標(biāo)出遺遺傳成成分。。EcoRI：EscherichiacoliR⑤若從一一種細(xì)細(xì)菌中中分離離出幾幾種不不同的的酶，，則根根據(jù)發(fā)發(fā)現(xiàn)順順序用用羅馬馬數(shù)字字表示示。SacI(II)：StreptomycesachromagenesI(ⅡⅡ)一、限限制性性內(nèi)切切酶的的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)二、限限制性性內(nèi)切切酶的的定義義三、限限制性性內(nèi)切切酶的的命名名四、限限制性性內(nèi)切切酶的的分類類五、II型限制制內(nèi)切切酶的的基本本特性性六、影影響酶酶活性性的因因素七、限限制內(nèi)內(nèi)切酶酶的用用途第一節(jié)節(jié)限限制性性核酸酸內(nèi)切切酶與與DNA分子的的體外外切割割性質(zhì)酶Ⅰ酶Ⅱ酶Ⅲ結(jié)構(gòu)與功能三亞基多功能酶單一功能的酶同型二聚體二亞基雙功能的酶限制與修飾酶蛋白同時具有甲基化作用酶蛋白不具有甲基化作用酶蛋白同時具有甲基化作用限制作用的輔助因子ATP,Mg2+,SAM（S-腺苷甲硫氨酸）Mg2+ATP,Mg2+,SAM寄主特異性位點(diǎn)序列特異性,非對稱序列特異性,旋轉(zhuǎn)對稱序列特異性,非對稱序列切割位點(diǎn)在距寄主特異性位點(diǎn)至少1kb的地方位于寄主特異性位點(diǎn)或其附近在距寄主特異性位點(diǎn)3′端24~26bp處切割方式隨機(jī)切割特異切割特異切割甲基化作用位點(diǎn)寄主特異性的位點(diǎn)寄主特異性的位點(diǎn)寄主特異性的位點(diǎn)在DNA克隆中的用途無十分有用有用四、限限制性性核酸酸內(nèi)切切酶的的分類類及主主要特特征一、限限制性性內(nèi)切切酶的的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)二、限限制性性內(nèi)切切酶的的定義義三、限限制性性內(nèi)切切酶的的命名名四、限制制性內(nèi)切切酶的分分類五、II型限制內(nèi)內(nèi)切酶的的基本特特性六、影響響酶活性性的因素素七、限制制內(nèi)切酶酶的用途途第一節(jié)限限制性性核酸內(nèi)內(nèi)切酶與與DNA分子的體體外切割割五、II型限制性性核酸內(nèi)內(nèi)切酶的的基本特特性?是用途最最廣、最最簡單的的一種限限制性內(nèi)內(nèi)切酶。。?II型限制性性內(nèi)切酶酶的形式式多樣，，從大小小上來說說，它們們可以小小到如PvuII(157個氨基酸酸)，也可以以比1250個氨基酸酸的CjeI更大。在在已純化化分類的的3000種限制性性內(nèi)切酶酶中，已已發(fā)現(xiàn)了了超過250種的特異異識別序序列。?根據(jù)酶的的作用特特點(diǎn)，II型限制性性內(nèi)切酶酶分為3類：A.最普遍的的是HhaI、HindIII和NotI這樣在識識別序列列中進(jìn)行行切割的的酶。有有以下4種情況：：a)大部分這這類酶都都以同源源二聚體體的形式式結(jié)合到到DNA上，因而而識別的的是對稱稱序列；；b)但有極少少的酶作作為單聚聚體結(jié)合合到DNA上，識別別非對稱稱序列。。c)一些酶識識別連續(xù)續(xù)的序列列(如EcoRI識別GAATTC)d)而另一些些識別不不連續(xù)的的序列(如BglI識別GCCNNNNNGGC)1、根據(jù)酶酶作用特特點(diǎn)進(jìn)行行的分類類五、II型限制性性核酸內(nèi)內(nèi)切酶的的基本特特性B.IIS型酶?另一種比比較常見見的酶是是所謂的的IIS型酶，比比如FokI和AlwI，它們在在識別位位點(diǎn)之外外切開DNA。這些些酶的的大小小居中中，約約為400-650個氨基基酸左左右；；它們們識別別連續(xù)的非對稱稱序列列，有一一個結(jié)合識識別位位點(diǎn)的的域和一個個專門門切割DNA的功能域域。一般般認(rèn)為為這些些酶主主要以以單體體的形形式結(jié)結(jié)合到到DNA上，，但但與與臨臨近近的的酶酶結(jié)結(jié)合合成成二二聚聚體體，，協(xié)協(xié)同同切切開開DNA鏈。。因因此此一一些些IIS型的的酶酶在在切切割割有有多多個個識識別別位位點(diǎn)點(diǎn)的的DNA分子子時時，，活活性性可可能能更更高高。。C.第三種II型限制性內(nèi)內(nèi)切酶?第三種II型限制性內(nèi)內(nèi)切酶(有時也被稱稱為IV型限制性內(nèi)內(nèi)切酶)是一類較大大的、集限制和修飾飾功能于一體體的酶，通通常由850-1250個堿基組成成，在同一一條多肽鏈鏈上同時具具有限制和和修飾酶活活性。有些些酶識別連續(xù)序列，并在識別別位點(diǎn)的一一端切開DNA鏈；而另一一些酶識別別不連續(xù)的序序列(如BcgI：CGANNNNNNTGC)，并在識別別位點(diǎn)的兩兩端切開DNA鏈，產(chǎn)生一一小段含識識別序列的的片段。這些酶的氨氨基酸序列列各不相同同，但其結(jié)結(jié)構(gòu)組成是是一致的。。他們在N端由一個負(fù)責(zé)責(zé)切開DNA的功能域，這個域又又與DNA修飾域連接接；此外還還有一到兩兩個識別特異序序列的功能能域構(gòu)成C端，或以獨(dú)立立的亞基形形式存在。。當(dāng)這些酶酶與底物結(jié)結(jié)合時，它它們或行使使限制性內(nèi)內(nèi)切酶的功功能切開底底物，或作作為修飾酶酶將其甲基基化。識別位點(diǎn)與與酶切位點(diǎn)點(diǎn)高度一致致，具有高高度特異性性極為穩(wěn)定輔酶:Mg2+2、II型限制性內(nèi)內(nèi)切酶的特特點(diǎn)五、II型限制性核核酸內(nèi)切酶酶的基本特特性（1）限制酶識識別序列的的長度限制性內(nèi)內(nèi)切酶在在雙鏈DNA上能夠識識別的特殊核苷苷酸序列列被稱為識別序列列。識別序列列的長度度一般為為4～8個堿基，，最常見見的為6個堿基。。切割頻率率理論上上為1/4n（n為識別序序列長度度），實(shí)實(shí)際上與與序列有有關(guān)。3、識別序序列MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGGFokI5’’-ＧＧＡＴＧＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣＣ(Ｎ)13-5’外側(cè)，產(chǎn)生生５’-端突起五、II型限制性核核酸內(nèi)切酶酶的基本特特性（3）限制酶識識別序列的的結(jié)構(gòu)限制酶識別別序列大多多具有回文文對稱結(jié)構(gòu)構(gòu)

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’有些限制酶酶的識別序序列不對稱稱AccBSⅠCCG↓CTCGGC↑GAG（2）富含GCⅡ型酶識別回文序列有些限制酶酶可識別多多種序列有些限制酶酶識別的序序列呈間斷對稱，對稱序列列之間含有有若干個任任意堿基。。

AlwNⅠCAGNNNCTGGTCNNNGAC

AccⅠGTMKACCAKMTGM=A、CK=G、T（4）限制酶切切割的位置置限制酶對DNA的切割位置置大多數(shù)在在識別序列列內(nèi)部，但但也有在外外部的。（5）限制酶切切后產(chǎn)生兩兩個末端，，末端結(jié)構(gòu)構(gòu)是５’-Ｐ和３’-ＯＨ4．末端種類類(切割方式)（1）5’-黏性末端和和3’-黏性末端（cohesiveend）識別位點(diǎn)為為回文對稱稱結(jié)構(gòu)的序序列經(jīng)限制制酶切割后后，產(chǎn)生的的末端為黏黏性末端，，這樣形成成的兩個末末端是相同同的，也是是互補(bǔ)的。。（2）平末端（（Bluntend）在回文對稱稱軸上同時時切割DNA的兩條鏈，，則產(chǎn)生平平末端。如HaeⅢ（GG↓CC）和EcoRV（GAT↓ATC）五、II型限制性核核酸內(nèi)切酶酶的基本特特性粘性末端的的意義連接方便不同的DNA雙鏈：只要粘性末末端堿基互互補(bǔ)就可以以連接。這這比連接兩兩個平齊末末端容易的的多。同一個DNA分子內(nèi)連接接：通過兩個相相同的粘性性末端可以以連接成環(huán)環(huán)形分子。。5’末端標(biāo)記凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。3’末端標(biāo)記凸出的3’端可以通過過末端轉(zhuǎn)移移酶添加幾幾個多聚核核苷酸的尾尾巴（如AAA或TTT等）造成人人工粘性末末端。補(bǔ)平成平齊齊末端粘性末端可可以用DNA聚合酶補(bǔ)平平成平齊末末端。粘性末端的的意義部分常用的的限制性內(nèi)內(nèi)切酶（3）非互補(bǔ)黏黏性末端(不對稱末端端)當(dāng)識別序列列為非對稱稱序列時，，切割的DNA產(chǎn)物的末端端是不同的的。BbvCⅠ

CCTCAGCGGAGTCGCCTCAGCGGAGTCG能識別簡并并順序的，，如：AvaIAvaI5’-CPyCGPuG-3’CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG(1).識別別不不同同，，切切割割不不同同eg:BamHIEcoRI-GGATCC--AGATCT--CCTAGG--TCTAGA-(2).識別別不不同同，，切切割割產(chǎn)產(chǎn)生生末末端端相相同同(同尾尾酶酶)eg:BamHIBg1ⅡⅡ-AGATCT-GGATCC-TCTAGA-CCTAGG5.識別別位位點(diǎn)點(diǎn)與與切切割割方方式式之之間間的的關(guān)關(guān)系系五、、II型限限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶的的基基本本特特性性(3).識別別相相同同，，切切割割不不同同eg:SmaIXmaI-CCCGGG--CCCGG-GGGCCC--GGGCCC-(4)．識識別別相相同同，，切切割割相相同同────同同工工酶酶同裂裂酶酶eg:HpaⅡⅡMspⅠⅠ-CCGG--C*CGG--GGCC--GGCC-同裂裂酶酶（（isoschizomers）概念念用途途有一一些些同同裂裂酶酶對對于于切切割割位位點(diǎn)點(diǎn)上上的的甲甲基基化化堿堿基基的的敏敏感感性性有有所所差差別別，，所所以以可可以以用用來來研研究究DNA甲基基化化作作用用。。KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG有一一些些來源源不不同同的限限制制性性酶酶識識別別的的是是相同同的的核核苷苷酸酸靶靶序序列列，這這類類酶酶稱稱為為同同裂裂酶酶。。用途途如：：限限制制酶酶HpaⅡⅡ和MspⅠⅠ是一一對對同同裂裂酶酶，，共共同同的的靶靶序序列列是是CCGG。當(dāng)當(dāng)其其靶靶序序列列中中含含有有一一個個5-甲基基胞胞嘧嘧啶啶（（CCGG，*號號表表示示甲甲基基化化的的堿堿基基）），，HpaⅡⅡ不能能夠夠切切割割它它，，而而MspⅠⅠ對于于這這個個核核苷苷酸酸的的甲甲基基化化作作用用的的反反應(yīng)應(yīng)則則是是中中性性的的，，它它不不管管C殘基甲基基化與否否都能夠夠切割之之。*現(xiàn)已研究究發(fā)現(xiàn)，，許多動動物DNA中90%以上的甲甲基，都都是在序序列CG處以5-甲基胞嘧嘧啶的形形式出現(xiàn)現(xiàn)。所以以，通過過比較HpaⅡⅡ和MspⅠⅠ的DNA消化產(chǎn)物物就可以以檢測出出甲基化化的存在在。同尾酶（（isocaudamer）概念常用的限限制酶BamHⅠ、BacⅡⅡ、BglⅡⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡⅡ就是一組組同尾酶酶，它們們切割DNA后都形成成由GATC4個核苷酸酸組成的的粘性末末端。舉例與同裂酶酶對應(yīng)的的一類限限制性酶酶，它們們雖然來源各異異，識別的的靶序列也也各不相相同，但都產(chǎn)產(chǎn)生出相同的粘粘性末端端，這類酶酶稱為同同尾酶。。BamHI5′...G^GATCC...3′3′...CCTAG^G...5′BglII5′...A^GATCT...3′3′...TCTAG^A...5′Sau3A5′...^GATC...3′′3′...CTAG^...5′用途由于同同尾酶酶切割割DNA后產(chǎn)生生的是是粘性性末端端，因因此，，可以以通過過粘性性末端端之間間的互互補(bǔ)作作用而而彼此此連接接起來來，這這在基基因克克隆實(shí)實(shí)驗(yàn)中中是很很有用用處的的。由一對同同尾酶酶分別產(chǎn)產(chǎn)生的的粘性末末端共價結(jié)結(jié)合形形成的的位點(diǎn)，特稱稱為雜種位位點(diǎn)（（hybridsite）同尾酶酶的粘粘性末末端互互相結(jié)結(jié)合后后，形形成的的新位位點(diǎn)，，不能能再被被原來來的酶酶所識識別。。5’-G3’-CCTAGGATCT-3’’A-5’’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’’3’-CCTAGA-5’’BamHIBglⅡSau3A同尾酶酶的粘粘性末末端結(jié)結(jié)合形形成的的新位位點(diǎn)不不能再再被原原來的的酶識識別BamHIGGATCCBglIIAGATCTMboI,Sau3AINGATCN6、酶切切位點(diǎn)點(diǎn)在DNA上出現(xiàn)現(xiàn)的頻頻率?II型限制制性內(nèi)內(nèi)切酶酶的酶酶切位位點(diǎn)在在DNA上出現(xiàn)現(xiàn)的頻頻率受受DNA的長度度、識識別位位點(diǎn)的的長度度以及及GC含量的的影響響。?當(dāng)GC：AT＝1：14bp的識別別位點(diǎn)點(diǎn)：1/44＝256bp如：HaeIIIGGCC6bp的識別別位點(diǎn)點(diǎn)：1/46＝4096bp?因此當(dāng)一個個酶的識別別位點(diǎn)為6bp時，在DNA上每4000bp才會出現(xiàn)一一次。五、II型限制性核核酸內(nèi)切酶酶的基本特特性?另外一些不不常見的酶酶識別位點(diǎn)點(diǎn)相對較長長，在DNA鏈上出現(xiàn)頻頻率也相對對較低。①如FseIGGCCGGCC，出現(xiàn)頻率率為1/48。?實(shí)際上由于于不同生物物體的DNA堿基含量不不同，酶的的識別位點(diǎn)點(diǎn)的分布和和頻率也不不同。②大腸桿菌菌基因組中中AT含量較豐富富，所以富富含AT的識別序列列(如DraI：TTTAAA；PshBI：ATTATT；SspI：AATTAA)較為為頻頻繁繁的的出出現(xiàn)現(xiàn)；；③鏈鏈霉霉菌菌基基因因組組因因GC含量量高高，，相相應(yīng)應(yīng)的的富富含含GC堿基基對對的的識識別別序序列列(NaeI：GCCGGC；SmaI：CCCGGG-；SacII：CCGCGG)較常常見見。。?真核核生生物物中中，，DNA中的的CG:GC=1:3，這這也也影影響響酶酶切切位位點(diǎn)點(diǎn)的的出出現(xiàn)現(xiàn)頻頻率率。。7五、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性8、對對寡寡核核苷苷酸酸的的活活性性?盡管管是是雙雙鏈鏈、、有有識識別別位位點(diǎn)點(diǎn)，，但但因因?yàn)闉樘潭?，，酶酶不不能能與與DNA有效效結(jié)結(jié)合合，，所所以以不不能能切切割割。。?當(dāng)2個酶酶切切位位點(diǎn)點(diǎn)距距離離非非常常近近的的時時候候，，它它們們之之間間由由于于競競爭爭結(jié)結(jié)合合位位點(diǎn)點(diǎn)，，所所以以也也會會相相互互干干擾擾。。五、、II型限限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶的的基基本本特特性性9.其它它特特異異性性的的內(nèi)內(nèi)切切酶酶及及其其用用途途1.λλ末端端酶酶（（λterminase）：：5’’-GGGCGGCGACCTN--3’’N--5’’，出出現(xiàn)現(xiàn)的的頻頻率率約約412分子子量量為為117,000=1A（74,000）+2Nul（21,000）2.Omega核酸酸酶酶（（I-SceI）：：由內(nèi)內(nèi)含含子子編編碼碼，，用用于于rRNA的剪剪切切，，出出現(xiàn)現(xiàn)的的頻頻率率約約418=6.9X1010bp，其識識別別順順序序?yàn)闉?’’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’’TATT3.I-PpoI：來自自于于Physarumpolycephalum識別別序序列列：：CTCTCTTAAGGTAGCAATT4.用途:遺傳標(biāo)記，，構(gòu)建載載體五、II型限制性核核酸內(nèi)切酶酶的基本特特性一、限制性性內(nèi)切酶的的發(fā)現(xiàn)二、限制性性內(nèi)切酶的的定義三、限制性性內(nèi)切酶的的命名四、限制性性內(nèi)切酶的的分類五、II型限制內(nèi)切切酶的基本本特性六、影響限限制性內(nèi)切切酶活性的的因素七、限制內(nèi)內(nèi)切酶的用用途第一節(jié)限限制性核酸酸內(nèi)切酶與與DNA分子的體外外切割Ⅱ型限制性內(nèi)內(nèi)切酶的反反應(yīng)條件五、影響限限制性內(nèi)切切酶活性的的因素酶的純度DNA樣品的純度度DNA的甲基化程程度酶切反應(yīng)的的溫度和時時間DNA分子的結(jié)構(gòu)構(gòu)限制性內(nèi)切切核酸酶的的反應(yīng)緩沖沖液六、影響限限制性內(nèi)切切酶活性的的因素高質(zhì)量的限限制性核酸酸內(nèi)切酶，，要求:不存在其他他核酸內(nèi)切切酶或外切切酶的污染染;長時間酶解解不出現(xiàn)識識別順序特特異性的下下降;酶解的DNA片段連接后后能重新被被識別和切切割等.酶的的純純度度1.DNA制劑劑中中可可能能抑抑制制限限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶活活性性的的物物質(zhì)質(zhì):蛋白白質(zhì)質(zhì)、、酚酚、、氯氯仿仿、、酒酒精精乙二二胺胺四四乙乙酸酸（（EDTA）十二二烷烷基基硫硫酸酸鈉鈉（（SDS）高濃濃度度的的鹽鹽離離子子等等DNA樣品品的的純純度度2.提高高限限制制性性內(nèi)內(nèi)切切核核酸酸酶酶對對低濃濃低低純純度度DNA制劑劑反反應(yīng)應(yīng)效效率率的的方方法法①純化化DNA；②增加加核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶的的用用量量，，平平均均每每微微克克底底物DNA可高高達(dá)達(dá)10單位位甚甚至至更更多多些些；；③擴(kuò)大大酶酶催催化化反反應(yīng)應(yīng)的的體體積積，，以以使使?jié)摑撛谠诘牡囊忠种埔蛞蛩厮乇槐豁戫憫?yīng)應(yīng)地地稀稀釋釋；；④延長長酶酶催催化化反反應(yīng)應(yīng)的的保保溫溫時時間間。。DNA的甲甲基基化化1.原核生物的限制-修飾系統(tǒng)的組成成分是：甲基化酶：對自身DNA起修飾作用，從而使限制性內(nèi)切核酸酶不能識別，保護(hù)自身DNA免受降解。限制性內(nèi)切核酸酶：破壞入侵的外源DNA，防御異源遺傳信息進(jìn)入體內(nèi)。因此此，，甲甲基基化化作作用用直直接接影影響響限限制制性性內(nèi)內(nèi)切切核核酸酸酶酶的的活活性性?大多多數(shù)數(shù)大大腸腸桿桿菌菌菌菌株株中中含含有有Dam甲基化酶酶和Dcm甲基化酶酶，前者者可以在在GATC序列中腺腺嘌呤N-6位上引入入甲基，，后者在在CCA/TGC序列的第第一個胞胞嘧啶C-5位置上引引入甲基基。部分分限制性性內(nèi)切酶酶對甲基基化的DNA不能切割割，如FbaI和MboI等。而要要解除這這種限制制修飾作作用通常常有兩種種方法：：①選用用上述酶酶的同功功酶，如如Sau3AI，DNA識別切割割位點(diǎn)與與MboI相同；但但不受甲甲基化影影響；DNA的甲基化化?解除限制制修飾作作用的方方法：②利用用甲基化化酶缺失失的受體體細(xì)胞進(jìn)進(jìn)行DNA的制備，，如E.coliJM110和鏈霉菌菌等，前前者Dam和Dcm甲基化酶酶已敲除除，而后后者細(xì)胞胞內(nèi)本就就沒有甲甲基化酶酶，從這這些細(xì)胞胞中抽提提的DNA就能被上上述酶切切割。DNA的甲基化化酶切反應(yīng)應(yīng)的溫度度DNA酶切反應(yīng)應(yīng)的溫度度是影響響限制性性內(nèi)切核核酸酶活活性的另另一個重重要因素素。不同同的核酸酸內(nèi)切酶酶，具有有不同的的最適溫溫度，而而且彼此此之間有有很大的的變動范范圍。但是大多多數(shù)限制制性核酸酸內(nèi)切酶酶的標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)反應(yīng)溫度度都是37℃。酶反應(yīng)溫度（℃）ApaⅠBanⅠBstEⅡMaeⅠMaeⅡMaeⅢSmaⅠTaqⅠ3050604550552565部分限制制性內(nèi)切切核酸酶酶的最適適反應(yīng)溫溫度DNA分子結(jié)構(gòu)構(gòu)DNA分子的不不同的構(gòu)構(gòu)型對限限制性內(nèi)內(nèi)切核酸酸酶的活活性也有有很大的的影響。。某些核酸酸內(nèi)切酶酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要的的酶量，要比消消化線性DNA高出許多倍倍，最高高的可達(dá)達(dá)20倍。DNA末端長度度對限制制酶切割割的影響響:限制酶切切割DNA時對識別別序列兩兩端的非非識別序序列有長長度的要要求，也也就是說說在識別序序列兩兩端必必須有有一定定數(shù)量量的核核苷酸酸，否則則限制制酶將將難以以發(fā)揮揮切割割活性性。DNA分子結(jié)結(jié)構(gòu)近末端端的切切割：：eg:AccIGGTCGACC切不動動CGGTCGACCG切不動動CCGGTCGACCGG切不動動eg:EcoRIGGAATTCCCGGAATTCCG2小時內(nèi)內(nèi)90%完全酶酶切eg:PmeIGTTTAAAC20小時不不能切切GGTTTAAACC20小時，，25%切開GGGTTTAAACCC20小時，，50%切開AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG20小時，，90%切開位點(diǎn)偏偏愛（（Sitepreference）某些限限制酶酶對不不同位位置的的同一一個識識別序序列表表現(xiàn)出出不同同的切切割效效率的的現(xiàn)象象稱作作位點(diǎn)點(diǎn)偏偏愛愛。λ噬菌菌體體DNA全長長48,502bp，有有5個EcoRⅠⅠ酶切切位位點(diǎn)點(diǎn)。。切切割割時時并并非非在在5個位位點(diǎn)點(diǎn)隨隨機(jī)機(jī)進(jìn)進(jìn)行行，，靠靠近近右右端端的的位位點(diǎn)點(diǎn)比比分分子子中中間間的的位位點(diǎn)點(diǎn)切切割割快快10倍。。DNA分子子結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)一般般來來說說，，一一種種限限制制性性內(nèi)內(nèi)切切核核酸酸酶酶對對其其不不同同識識別別位點(diǎn)點(diǎn)切切割割速速率率的的差差別別最最多多不不會會超超過過10倍。造成成位位點(diǎn)點(diǎn)偏偏愛愛現(xiàn)現(xiàn)象象的的原原因因限制制酶酶在在切切割割DNA之前前需需要要同同時時與與兩兩個個識識別別位位點(diǎn)點(diǎn)作作用用；；限制制酶酶對對要要求求作作用用的的DNA序列列有有兩兩個個明明顯顯不不同同的的結(jié)結(jié)合合位位點(diǎn)點(diǎn)，，其其中中一一個個是是為為DNA切割割時時激激活活另另一一個個的的變變構(gòu)構(gòu)位位點(diǎn)點(diǎn)。。DNA分子結(jié)構(gòu)構(gòu)限制性核核酸內(nèi)切切酶的反反應(yīng)緩沖沖液1.緩沖液的的主要成成分Tris-Cl：使反應(yīng)混混合物的的pH恒定在酶酶活性所所要求的最佳數(shù)值值范圍內(nèi)。。對絕大大數(shù)限制制酶來說，，最佳pH=7.4。MgCl2：保證酶活活性的正常發(fā)揮。NaCl或KCl：同上。35β-巰基乙醇醇：防止限制制酶的氧氧化，保保持酶的的穩(wěn)定性性（但也可可能有利利于潛在在污染雜雜質(zhì)的穩(wěn)穩(wěn)定性）。牛血清白白蛋白（（BSA）：對某些些限制酶酶是必需需的，它它是一種中中性蛋白白，可防防止酶在在低濃度度蛋白質(zhì)溶溶液中變變性。限制性核核酸內(nèi)切切酶的反反應(yīng)緩沖沖液1.緩沖液的的主要成成分2.緩沖液的的分類不同酶對對緩沖液液的離子子強(qiáng)度要要求不同同，據(jù)此此緩沖液液可分為為如下三三種：低鹽緩沖沖液（L）：10mmol/LNaCl中鹽緩沖沖液（M）：50mmol/LNaCl高鹽緩沖沖液（H）：100mmol/LNaCl限制性核核酸內(nèi)切切酶的反反應(yīng)緩沖沖液限制性核核酸內(nèi)切切酶的反反應(yīng)緩沖沖液3.限制性內(nèi)內(nèi)切核酸酸酶的多多酶聯(lián)合合酶解對鹽濃度度要求相相同的酶酶，原則則上可同同時酶切切對鹽濃度度要求不不同的酶酶，可采采取下列列方法：：①低鹽酶先先切，然然后補(bǔ)加加NaCl，再用高高鹽酶切切②一種酶先先切，然然后用乙乙醇沉淀淀酶解產(chǎn)產(chǎn)物，再再重懸于于另一種種緩沖液液中用另另一種酶酶切。③使用適合合所有限限制酶的的通用緩緩沖液，，如KGB（谷氨酸酸鉀緩沖沖液）限制性核核酸內(nèi)切切酶的反反應(yīng)緩沖沖液3.限制性內(nèi)內(nèi)切核酸酸酶的多多酶聯(lián)合合酶解限制性核核酸內(nèi)切切酶的反反應(yīng)緩沖沖液4.星號活性性（staractvity）限制性內(nèi)內(nèi)切核酸酸酶的識識別位點(diǎn)點(diǎn)是在特特定的消消化條件件下測定定的，當(dāng)當(dāng)條件改變變時，有些些酶的識別位點(diǎn)點(diǎn)也隨之改變，可能切切割一些些與特異異識別序序列相類似的序列，，這種現(xiàn)現(xiàn)象稱為為星號活性性。①概念實(shí)際上星星號活性性是限制制性內(nèi)切切酶的一一般性質(zhì)質(zhì)，任何何一種限限制酶在在極端非非標(biāo)準(zhǔn)條條件下都都能切割割非典型型位點(diǎn)。。限制性核核酸內(nèi)切切酶的反反應(yīng)緩沖沖液4.星號活性性（staractvity）①概念（以以EcoRⅠ為例）EcoRⅠ在正常條條件下識識別并切切割GAATTC，但在甘油濃度超過5%（V/V）時，也也可切割割NAATTN（其中N=A、T、C、G），用EcoRⅠ*表示。限制性核核酸內(nèi)切切酶的反反應(yīng)緩沖沖液4.星號號活活性性（（staractvity）②誘發(fā)發(fā)星星號號活活性性產(chǎn)產(chǎn)生生的的常常見見原原因因甘油油濃濃度度高高（（>5%）限制制酶酶過過量量（（>100U/l）離子子強(qiáng)強(qiáng)度度低低（（<25mM）pH值過過高高（（>8.0）反應(yīng)應(yīng)體體系系含含DMSO、乙乙醇醇、、乙乙二二醇醇、、二二甲甲基基乙乙酰酰胺胺、、二二甲甲基基甲甲酰酰胺胺等等有有機(jī)機(jī)溶溶劑劑Mg++被其其它它二二價價陽陽離離子子如如Mn++、Cu++、Co++或Zn++代替替具有有星星反反應(yīng)應(yīng)的的限限制制性性內(nèi)內(nèi)切切酶酶與與條條件件限制制酶酶誘誘發(fā)發(fā)星星活活性性的的條條件件a識別別序序列列AvaI1,2,4BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCCBstI2,4BsuI2,4,6EcoRI1,2,4-6NAATTNHaeⅢ2,4HhaI2,4,7HindⅢ6HpaI1,2,4PstI1,2,4,7PvuⅡ2,4SalI1,2,4,7ScaI4-6,8SstⅡ2,4XbaI2,4,7a.1：亞乙乙二醇醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇醇(12%)；4：高酶酶/DNA比(>25U/μμg)；5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5;7:二甲基基亞砜砜(8%);8:無NaCl。抑制星星星活活性的的措施施減少酶酶的用用量（（可避避免過過分酶酶切））減少甘甘油濃濃度保證反反應(yīng)體體系中中無有有機(jī)溶溶劑或或乙醇醇提高離離子強(qiáng)強(qiáng)度到到100～150mM（但不不能抑抑制酶酶活性性）降低反反應(yīng)pH至pH7.0保證使使用Mg++作為二二價陽陽離子子一、限限制性性內(nèi)切切酶的的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)二、限限制性性內(nèi)切切酶的的定義義三、限限制性性內(nèi)切切酶的的命名名四、限限制性性內(nèi)切切酶的的分類類五、II型限制制內(nèi)切切酶的的基本本特性性六、影影響酶酶活性性的因因素七、限限制內(nèi)內(nèi)切酶酶的用用途第一節(jié)節(jié)限限制性性核酸酸內(nèi)切切酶與與DNA分子的的體外外切割割DNA重組突變分分析（（RFLP分析））限制酶酶（物物理））圖譜譜繪制制限制酶酶的部部分酶酶切與與完全全酶切切七、限限制內(nèi)內(nèi)切酶酶的用用途限制性性內(nèi)切切酶酶酶切圖圖譜(Restrictionmapping)1.限制酶酶對DNA的酶切切方法法完全酶酶切/消化對DNA上所有有的識識別位位點(diǎn)都都被酶酶切開開。應(yīng)應(yīng)用有有限。。部分酶酶切/消化DNA上只有有部分分酶切切位點(diǎn)點(diǎn)被切切開。。部分酶酶切的的方法法：縮短保保溫時時間、、降低低反應(yīng)應(yīng)溫度度、減減少酶酶的用用量。。完全酶酶切如EcoRI（GAATTC）的4個位點(diǎn)點(diǎn)都被被切開開。12341234部分酶酶切4個EcoRI位點(diǎn)中中，僅僅酶切切2個位點(diǎn)點(diǎn)。1234142.限制性性內(nèi)切切酶圖圖譜定義DNA上某些些限制制性內(nèi)內(nèi)切酶酶酶切切位點(diǎn)點(diǎn)的圖圖譜，，可作作為DNA片段的特殊標(biāo)標(biāo)記。也稱DNA物理圖譜。3.限制酶酶切圖圖譜的分析EcoR1NotIEcoRINotI2.0kb3.0kb1.0kbEcoRINotIEcoRI/NotI3.0kb6.0kb2.0kb3.0kb5.0kb4.0kb1.0kb4.酶切產(chǎn)物的檢檢測瓊脂糖凝膠電電泳法DNA經(jīng)內(nèi)切酶酶切切，然后在瓊瓊脂糖凝膠電電泳分析。適適合小分子DNA分析。SouthernBlot法DNA酶切后，電泳泳分離。后變變性后轉(zhuǎn)移到到尼龍膜或硝硝酸纖維膜，，然后與同位位素標(biāo)記的探探針雜交，最最后做放射自自顯影，檢測測多態(tài)性條帶帶。9、靜夜四四無鄰，，荒居舊舊業(yè)貧。。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中黃葉樹樹，燈下白頭頭人。。06:01:4506:01:4506:0112/23/20226:01:45AM11、以我我獨(dú)沈沈久，，愧君君相見見頻。。。12月月-2206:01:4506:01Dec-2223-Dec-2212、故人人江海海別，，幾度度隔山山川。。。06:01:4506:01:4506:01Friday,December23,202213、乍乍見見翻翻疑疑夢夢，，相相悲悲各各問問年年。。。。12月月-2212月月-2206:01:4506:01:45December23,202214、他他鄉(xiāng)鄉(xiāng)生生白白發(fā)發(fā)，，舊舊國國見見青青山山。。。。23十十二二