生物顯微技術(shù)實(shí)驗(yàn)講義

PAGEPAGE16北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院基礎(chǔ)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物顯微技術(shù)實(shí)驗(yàn)講義實(shí)驗(yàn)一、常用顯微鏡的使用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握各種顯微鏡的成象原理、熟悉各種顯微鏡的操作規(guī)范及注意事項(xiàng)；2了解各類顯微鏡的常見故障及排除方法；3了解各類顯微鏡的組裝、維護(hù)及維修常識(shí)。二、實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)單位。構(gòu)成生物有機(jī)體的細(xì)胞是多種多樣的。要對細(xì)胞進(jìn)行研究，首先要從其形態(tài)結(jié)構(gòu)入手。眾所周知，細(xì)胞很小，絕大多數(shù)細(xì)胞人們通過肉眼無法辨認(rèn)。所以，要借助顯微鏡的成象及放大原理，在顯微鏡下，特別是在電鏡下才能觀察到細(xì)胞的基本的形態(tài)結(jié)構(gòu)。（一）普通光學(xué)顯微鏡的原理通過顯微鏡的物鏡和目鏡的兩次放大后，在人的眼睛的視網(wǎng)膜上形成一個(gè)正立的虛象，通過調(diào)焦裝置使這個(gè)虛象落在眼睛明視距離25cm處，使所看到的物體最清晰，也就是說虛象是在眼球晶狀體的兩倍焦距之外，在眼球后的視網(wǎng)膜上形成一個(gè)倒立的的縮小像。1照明原理臨界照明和柯勒照明。2顯微鏡的分辨率也稱分辨力，它是指能把兩個(gè)物點(diǎn)辨清的最小距離。能把兩點(diǎn)分辨開的最小距離叫做分別距離。分辨距離越小，則分辨率越高；分辨距離越大，則分辨率越低。所以分辨率是以分辨距離來表示的，并與分辨距離成反比。顯微鏡的分辨率和物鏡的鏡口率，照明光線的波長直接有關(guān)，其計(jì)算公式為：D=0.61λ/N.A.N.A.=n×sina/2式中D為分辨率，為光波波長，N.A.為物鏡的數(shù)值孔徑（鏡口率），n為物鏡與標(biāo)本間介質(zhì)的折射率，sina/2為透鏡視錐半頂角的正弦。由上式可見，要增加分辨率，需從縮短波長和增大鏡口率著手。由于鏡口率受介質(zhì)折射率和視錐半頂角的限制，它的數(shù)值是有一定限度的，所以，只有縮短光的波長，才是最有效的方法。3顯微鏡的放大率放大倍數(shù)=目鏡和物鏡的放大倍數(shù)的乘積。公式為：M=K1×K2=?/f1×250/f2M,總當(dāng)大倍數(shù)，K1，物鏡放大倍數(shù)；K2，目鏡放大倍數(shù)；?，光學(xué)鏡筒長（mm）；f1,物鏡焦距（mm）;f2，目鏡焦距(mm)；250為明視距離(mm)。由公式看出，物鏡的放大率是對一定的鏡筒長度而定的，鏡筒長度的變化，不僅放大率隨之變化，而且成像也受到影響。因此使用顯微鏡時(shí)，不能任意改變鏡筒長度，所謂標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)鏡筒長度是指物鏡的后焦點(diǎn)與目鏡的前焦點(diǎn)之間的距離。國際上將顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)鏡筒長定為160mm，此數(shù)字標(biāo)刻在物鏡的外殼上。4焦點(diǎn)深度顯微鏡調(diào)焦到看清楚標(biāo)本的某一點(diǎn)時(shí)，不僅是這一物點(diǎn)，而且其上下來兩側(cè)也能看清楚，能看清楚的這兩側(cè)的厚度叫做焦點(diǎn)深度。T=Kn/(M×N.A.)K,常數(shù)，約等于0.24；n，被檢標(biāo)本周圍介質(zhì)的折射率；M，顯微鏡的總放大倍數(shù)；N.A.為物鏡的數(shù)值孔徑。由公式看出，顯微鏡的焦點(diǎn)深度跟其總放大倍數(shù)及物鏡鏡口率成反比。因此，高放大率和高鏡口率的顯微鏡的焦深就淺，不能看到標(biāo)本的全厚度，必須調(diào)節(jié)螺旋仔細(xì)從上到下進(jìn)行觀察。另外，被檢物體周圍介質(zhì)的折射率的加大可增大焦點(diǎn)深度。5鏡像亮度和視場亮度鏡像亮度：在顯微鏡下所觀察到的圖象的明暗程度。其與鏡口率平方成正比，與總放大倍數(shù)成反比。即鏡口率越大，鏡像的亮度越大；總放大倍數(shù)越高，鏡像亮度越小視場亮度：顯微鏡下整個(gè)視場的明暗程度。其不僅與目鏡、物鏡有關(guān)，而且還直接受聚光鏡、光欄和光源等因素的影響。在不更換物鏡和目鏡的情況下，視場亮度大，鏡像亮度就大。使用時(shí)，對鏡像亮度的要求，一般是使眼睛既不感到暗淡，又不感到耀眼為宜（二）熒光顯微鏡的成像原理熒光顯微鏡是一種特殊的顯微鏡，其原理是利用較短波長的光使樣品受到激發(fā)，產(chǎn)生較長波長的熒光，可用來觀察分辨樣品中產(chǎn)生熒光的成分和位置。一般用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)，發(fā)出一定波長的光（籃紫光420nm或紫外光365nm）作為激發(fā)光，激發(fā)標(biāo)本細(xì)胞中熒光物質(zhì)使其發(fā)出一定波長的熒光，產(chǎn)生的熒光圖象，再通過物鏡和目鏡的放大，然后到底觀察者的眼睛或光點(diǎn)接收系統(tǒng)。用一定波長的光照射某些物質(zhì)，一定量的光能被物質(zhì)的分之或原子吸收后，激發(fā)出一種高能電子，進(jìn)入激發(fā)狀態(tài)。隨后因該激發(fā)分子與其他分子的碰撞引起能量衰減回到基態(tài)。物質(zhì)從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)可以電磁波形式放出其所吸收的光能，如果放出的光在激發(fā)的瞬間或激發(fā)后很短時(shí)間內(nèi)放出，稱為熒光。如將激發(fā)光切斷仍持續(xù)發(fā)光，切光波更長，則稱為磷光。熒光顯微鏡的主要特點(diǎn)是其光源能供給大量特定波長范圍的激發(fā)光，使受檢標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)獲得必要強(qiáng)度的激發(fā)光，為了只讓某一特定波長的激發(fā)光照射在樣品上，必須在激發(fā)光源與顯微鏡之間的光路中安裝濾光片，讓激發(fā)光源的特定波長的光通過，作為激發(fā)光。為了得到專一的熒光，還需在物鏡和目鏡之間光路中安裝一吸收濾光片，將樣品吸收后剩余的激發(fā)光吸收掉，并能選擇地讓某一特定的熒光通過，而阻止非專一性的可見光。三實(shí)驗(yàn)儀器、材料：日產(chǎn)BX41型系統(tǒng)顯微鏡、日產(chǎn)BX61型電動(dòng)反射熒光顯微鏡、CX31型生物顯微鏡。普通植物組織永久制片。四實(shí)驗(yàn)過程：（一）BX41型系統(tǒng)顯微鏡的使用方法1將主開關(guān)撥到“1”（開），調(diào)節(jié)光強(qiáng)：鏡基右后方旋鈕，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)提高電壓，使照明更亮。旋鈕周圍數(shù)字指示電壓。2選擇光路：目鏡筒右側(cè)推拉桿，A推進(jìn)：100%，用于雙筒目鏡和暗樣品材料觀察；B中間位置：20%和80%，用于雙筒目鏡，亮樣品觀察；C拉出：100%，用于電視觀察和顯微攝影。3把樣品放到載物臺(tái)上：樣品夾、標(biāo)本推動(dòng)器（X/Y軸旋轉(zhuǎn)）。4將10倍目鏡旋轉(zhuǎn)進(jìn)入光路：物鏡轉(zhuǎn)換器。5樣品聚焦：粗、細(xì)調(diào)節(jié)螺旋。6調(diào)節(jié)曲光度（曲光度調(diào)節(jié)環(huán)）、聚光鏡高度調(diào)節(jié)（調(diào)節(jié)環(huán)）7聚光鏡對中調(diào)節(jié)：（1）將聚光鏡升高到最高位置；（2）用10倍物鏡聚焦樣品；（3）移動(dòng)視場光欄到視場中央；（4）轉(zhuǎn)動(dòng)聚光鏡高度調(diào)節(jié)旋鈕聚焦視場光欄圖象；（5）調(diào)節(jié)兩個(gè)句光鏡對中旋鈕把視場光欄的圖象移動(dòng)到視場中央。（6）逐步打開視場光欄，使視場光欄圖象在中央并和視場內(nèi)接。（7）在實(shí)際應(yīng)用中，使視場光欄適當(dāng)增大，視場光欄圖象剛好與視場外切。8調(diào)節(jié)孔徑光欄和視場光欄：孔徑光欄調(diào)節(jié)環(huán)（與物鏡的數(shù)值孔徑匹配70-80%）；視場光欄調(diào)節(jié)環(huán)：限制進(jìn)入物鏡的光束直徑，從而排除外來的光線，增強(qiáng)圖象反差。應(yīng)將視場光欄直徑調(diào)節(jié)到物鏡放大倍數(shù)范圍內(nèi)，使視場光欄剛好與視場外切。9將所需物鏡轉(zhuǎn)進(jìn)光路，對樣品聚焦：物鏡轉(zhuǎn)換器。10觀察過程中綠色片的使用及光強(qiáng)調(diào)節(jié)：（二）BX61/62型電動(dòng)系統(tǒng)顯微鏡的使用透射光明視場觀察：1將主開關(guān)撥到“1”（控制盒前），打開燈開關(guān)（左下角）。2選擇透射光（透射光/反射光切換開關(guān)），調(diào)節(jié)光強(qiáng)（右下角光強(qiáng)調(diào)節(jié)鈕），選擇LBD濾色片（右后長按鈕）。3選擇光路（目鏡右后側(cè)拉桿）。4將樣品放到載物臺(tái)上。5將10倍物鏡旋轉(zhuǎn)進(jìn)光路6聚焦樣品：（1）載物臺(tái)升降鈕（固定于濾色片選擇按鈕上方的兩個(gè)旋鈕）；（2）屈光度調(diào)節(jié)；（3）聚光鏡高度調(diào)節(jié)；（4）聚光鏡對中調(diào)節(jié)（需以六角改錐進(jìn)行）。7調(diào)節(jié)孔徑光欄和視場光欄：（同上）8將所需物鏡轉(zhuǎn)進(jìn)光路聚焦樣品：物鏡轉(zhuǎn)換鈕、載物臺(tái)升降鈕、粗細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕。10觀察過程中綠色片的使用及光強(qiáng)調(diào)節(jié)：反射熒光觀察：1按觀察方法、安裝與其匹配的熒光組件和物鏡：不要同時(shí)使用明視場和熒光組件（分光鏡），以免對人眼造成傷害。如果同時(shí)使用，要選擇帶內(nèi)置ND濾光片的明視場組件；選擇不同波長的激發(fā)濾光片（如果熒光亮度弱，選擇超寬帶激發(fā)；如果樣品熒光很強(qiáng)，選擇窄帶激發(fā)）。2將主開關(guān)撥到“1”（控制盒前），等弧光到穩(wěn)定狀態(tài)（5到10分鐘）。注意：為了延長高壓汞燈的壽命，一旦啟動(dòng)，不能在少于15分鐘內(nèi)關(guān)閉；關(guān)閉后若再次啟動(dòng)，必須等高壓汞燈內(nèi)的水銀蒸氣冷卻下來液化后才能開啟，至少要10分鐘；在燈亮?xí)r打開室內(nèi)照明燈，電源將被切斷，此時(shí)要關(guān)閉汞燈電源，等10分鐘后再重新打開電源。3選擇反射光（透射光/反射光切換開關(guān)），調(diào)節(jié)光強(qiáng)（右下角光強(qiáng)調(diào)節(jié)鈕）。4對中高壓汞燈：（1）按下手動(dòng)控制器，使光閘進(jìn)入光路；（2）使用B或IB激發(fā)光，如沒有這種分光鏡可以使用紫外激發(fā)光，但要通過紫外遮光板觀察；（3）使10倍物鏡進(jìn)入光路，將對中板（U-CST）放到載物臺(tái)上，調(diào)節(jié)對中板白色表面上的十字線中心，使其與視場中心對中；（4）使空位置進(jìn)入光路（取下物鏡防塵帽）；（5）拉出孔徑光欄旋鈕使其最小，同時(shí)推進(jìn)視場光欄拉桿，使其最大；（6）按下RSHT鈕，移去光閘；（7）調(diào)節(jié)聚光鏡調(diào)節(jié)旋鈕和燈絲象對中旋鈕（右后方）使燈絲的象投到U-CST板上；（8）轉(zhuǎn)動(dòng)光源燈絲象調(diào)節(jié)旋鈕，將左或右半邊的燈絲象調(diào)到中央。（9）使用六角改錐調(diào)節(jié)燈室后面的鏡象調(diào)焦鈕（背后）將燈絲象和鏡象聚焦；（10）使用燈絲象調(diào)中旋鈕使燈絲象和鏡象重疊。5將標(biāo)本固定在載物臺(tái)上6根據(jù)標(biāo)本特性和研究目的選擇與之匹配的熒光組件（分光鏡）（控制盒鍵盤，MU+或MU-）。7旋轉(zhuǎn)物鏡，聚焦樣品：物鏡鈕、光閘鈕、載物臺(tái)升降鈕。8根據(jù)需要選擇濾光片：插入時(shí)要聽到兩次卡塔聲后方使濾光片在光路中，插入時(shí)使濾光片架的帶刻字的一面朝向觀察者。9調(diào)節(jié)聚光鏡亮度：調(diào)到最大。10對中孔徑光欄和視場光欄：（同上）。11轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡，聚焦觀察。（三）CX31型生物顯微鏡的使用同一般顯微鏡的使用操作。五作業(yè)：1簡述BX41型系統(tǒng)顯微鏡的操作步驟。2簡述熒光顯微鏡的原理及使用是注意事項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)二、生物組織石蠟切片技術(shù)第一部分取材和材料的殺死一實(shí)驗(yàn)原理用于制片的動(dòng)、植物材料應(yīng)該選擇新鮮的，用陳腐的材料制片，往往不能反映材料的真實(shí)情況。固定是將新鮮材料投入某類化學(xué)藥液中，借助化學(xué)藥品的作用使細(xì)胞組織的形態(tài)保存下來不使其改變形態(tài)和變質(zhì)的過程。二實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^教學(xué)要求學(xué)生掌握永久制片過程中的取材、切割、殺死（固定）等操作的原理、技術(shù)和注意事項(xiàng)；掌握固定液的配制和應(yīng)用。三實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑雙面刀片、鑷子；植物的莖、根、樹皮等材料；FAA固定液、4%戊二醛固定液、卡諾氏固定液。四實(shí)驗(yàn)過程（一）取材的方法取材應(yīng)根據(jù)需要，用鋒利的刀片從所需部位上切取一小塊放在固定液中固定。動(dòng)物組織的切片，厚度不超過3mm，體積不大于1.5cm×1.5cm×0.5cm。植物組織應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，細(xì)的根、莖和窄的葉片，可以切取3-5mm長一小段；粗的根、莖和寬的葉片，也可以取一部分進(jìn)行固定。材料的選擇和切取部位也很重要，例如，制作植物細(xì)胞有絲分裂的切片，一般多選擇根尖。因?yàn)檫@個(gè)部位的細(xì)胞分裂得快，制作動(dòng)物染色體的切片，可用動(dòng)物的睪丸等。（二）不同材料的取材(以植物材料為例)根：不能用力將根拔出，以免皮層與中柱分離和皮層留在地下，一定要先把泥土翻開挖出根，洗凈泥土，用濕紙包好拿回來。莖：帶葉的莖可插在花瓶內(nèi)養(yǎng)幾天，也可切成很長的幾段用濕紙包起，注意不要折斷或壓碎。葉：用刀片切下葉柄，不能摘下或壓擠葉柄。如不能立刻固定，可將葉片夾在潮濕的紙袋內(nèi)，帶回來的葉子如有枯萎現(xiàn)象，須先使之溫潤，恢復(fù)原狀后再固定?；ê凸麑?shí)：將整個(gè)花、花序及果摘下，包在濕紙內(nèi)，然后貯藏在密閉的容器內(nèi)，放陰涼處。苔蘚植物：連底土一起采，然后放在潮濕的容器內(nèi)，使它變膨脹，并使底土達(dá)到飽和狀態(tài)，把它放在解剖鏡下將所需的部分解剖出來固定。藻類：將藻類帶水一起采集，放在陰涼處。肉質(zhì)菌類：大的肉質(zhì)菌類包在蠟紙內(nèi)，小的菌類包在潮濕的紙內(nèi)，再包上蠟紙。病理材料：不能損傷寄生的組織，并且，取材時(shí)應(yīng)包括周圍的健康組織，有時(shí)還應(yīng)采集正常的組織，以便作比較觀察。（三）選材的注意事項(xiàng)：1、取材部位健全、有代表性；2、采集時(shí)盡可能不損傷所需要的部分；3、材料應(yīng)立即殺死和固定；4、已壓制的干標(biāo)本可放在水中浸軟后再做切片，但只能用于觀察維管束排列等較大的構(gòu)造。5、采標(biāo)本前應(yīng)配好相應(yīng)的固定液，取材后立即投入；6、一般用新的單面刀片切取材料，刀利、動(dòng)作快，輕夾輕放（四）材料的分割：切取材料一般用新的單面刀片，切割時(shí)切勿拉鋸式來回切取，須輕夾輕放。盡可能將材料切小切薄些，利于固定液的透入（固定液穿過外表具角質(zhì)和木栓質(zhì)部分慢而穿過切割表面快）。植物材料的切取應(yīng)先確定切取哪種切面，在切割時(shí)保持它原有的位置關(guān)系。一般有兩種切面：橫切面：與器官的長軸垂直的切面?？v切面：與器官的長軸平行的切面。又分為徑向切面（通過半徑的縱切面）和弦切面（不通過半徑的縱切面）兩種。葉片分割：葉窄，不超過5mm，沿中脈橫切，每片長約3—5mm；寬葉類，可分割為許多小片（沿主脈和各級(jí)側(cè)脈），選擇其中含有主脈和側(cè)脈的固定。草本植物根、莖、葉柄或其它園筒形器官分割：如果直徑小于2mm，且表面高度角質(zhì)化的，切成長約2mm的小段，如果表面非角質(zhì)化，則可切成10mm長的小段；直徑為5mm長；直徑為1cm時(shí)，厚度切成2—5mm；直徑較大的莖，切成5mm厚，且可分割一半或1/4，或?yàn)樾ㄐ?。木質(zhì)小枝的直徑在5mm以內(nèi)時(shí)：可切成15mm長。較粗的枝條，其割取長度宜較短，因其表面已木栓化，能阻止固定液的穿透。將小枝切成段時(shí)不用修枝剪或小刀，最好用銳利的刀片切取。（五）幾種固定液的配制方法：福爾馬林—醋酸—酒精液（FAA）固定柔弱的材料，如苔蘚植物，以50%酒精為好，固定堅(jiān)硬的材料以70%酒精為好。固定木材可略減冰醋酸，略增福爾馬林；易于收宿的材料可稍增冰醋酸的用量；如固定植物胚胎，配方改為：50%酒精89ml冰醋酸6ml福爾馬林5ml卡諾氏固定液的配制：100%酒精3份冰乙酸1份4%戊二醛的磷酸緩沖液固定液：甲3.5820gNa2HPO4?12H2O溶于蒸餾水中定容到50ml;乙1.5605gNaH2PO4?2H2O溶于蒸餾水中定容到50ml;甲36ml+乙14ml+25%戊二醛24ml+26ml蒸餾水即成。（六）固定操作：統(tǒng)一用青霉素小瓶固定和脫水操作。五作業(yè)1試述取材、切割和殺死材料的操作過程及注意事項(xiàng)。2簡述材料固定的原理。第二部分材料的脫水和透明一實(shí)驗(yàn)原理材料經(jīng)過固定液作用后，內(nèi)部滲入很多固定液，一定要把滲入里面的固定液洗去，否則留在材料中的固定液有的會(huì)妨礙染色，有的會(huì)發(fā)生沉淀或結(jié)晶，影響觀察，有的繼續(xù)作用，使材料變壞等。所以材料中的固定液必須徹底洗凈。材料經(jīng)過洗滌后含有大量水分，必須用脫水劑脫盡里面的水分，以利于材料的透明和制片的保存，因?yàn)樗诶锩婺苁共牧戏纸猓彝该鲃┡c水是不相混合的，只有在完全無水的情況下，透明劑才能完全透入。材料在脫水以后，所用的大多數(shù)脫水劑（酒精、丙酮等）不能和石蠟相混合，而透明劑既可與脫水劑混合又能和石蠟相混合，因而可通過透明劑的作用把脫水劑替換出來，使石蠟?zāi)茼樌剡M(jìn)入材料中。二實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^教學(xué)要求學(xué)生掌握材料的脫水和透明的原理；掌握常用脫水劑的種類及應(yīng)用；掌握組織自動(dòng)脫水處理三實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑脫水用小瓶（青霉素小瓶）或試劑瓶；已固定的材料；乙醇/正丁醇系列脫水劑。四實(shí)驗(yàn)過程（一）脫水前的沖洗：1、沖洗的作用：除掉固定液，利于切片的染色和觀察。一般原則是水溶液的固定劑用水沖洗，酒精溶液的用同濃度的酒精溶液沖洗。2、脫水的作用除盡水分才能使包埋劑和封固劑滲透到組織中。3、脫水劑應(yīng)具備的兩個(gè)條特性：（1）能與水混溶（2）與其它有機(jī)溶劑混溶（二）常用的脫水劑：可分兩類：非石蠟溶劑的脫水劑：如乙醇和丙酮石蠟溶劑的脫水劑：如正丁醇、叔丁醇、氯化二乙烯、二氧六烷。其中最為常用的是乙醇和正丁醇/乙醇系列（三）脫水劑的配制：乙醇系列：30%，50%，60%，70%，80%，90%，100%。優(yōu)點(diǎn)：脫水速度快；缺點(diǎn)：不易操作，材料易收縮及變軟或變脆。乙醇/正丁醇系列：乙醇：正丁醇：水Ⅰ40ml10ml50mlⅡ50ml20ml30mklⅢ50ml35ml15mlⅣ40ml55ml5mlⅥ25ml75mlⅦ100ml優(yōu)點(diǎn)：很少引起組織塊的收縮和變脆。（四）脫水時(shí)應(yīng)注意下列幾點(diǎn)：1在低濃度酒精或正丁醇/乙醇系列中，每級(jí)停留不能太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。2在高濃度或純酒精中，每級(jí)停留的時(shí)間也不宜太長，否則可使組織收縮變脆，影響切片。3脫水應(yīng)徹底干凈，否則與二甲笨混合后，將呈乳白色混濁，甚至影響滲蠟。4如需過夜，應(yīng)停留在70%酒精中。5在每級(jí)中停留的時(shí)間依材料的大小，性質(zhì)以及固定液的性質(zhì)而定，但并不十分嚴(yán)格。（五）透明的作用：（1）使材料透明干凈；（2）使包埋劑和封固劑易于進(jìn)入組織；如果脫水劑是石蠟溶劑的脫水劑，則可省略此步。（3）切片的透明目的是利于光線透過，便于顯微鏡的觀察。（六）脫水與透明操作：每一梯度的脫水劑中停留2h,進(jìn)入透明劑后，每一梯度停留時(shí)間可適當(dāng)延長。常用透明劑：正丁醇（butylalcohol）；二甲苯（xylen或xylol）；甲苯（toluene）；苯（benzene）；氯仿（chloroform）；丁香油（cloveoil）；香柏油（cedaroil）。本實(shí)驗(yàn)用正丁醇作為透明劑。注意：1脫水和透明用藥品系有毒物品，同學(xué)們操作時(shí)要注意安全，避免大量吸入或用手直接接觸。2回收所有實(shí)驗(yàn)藥品，嚴(yán)禁直接倒如水槽，以免污染環(huán)境。五作業(yè)1試述脫水和透明過程的操作規(guī)范。2為什么在材料脫水過程中脫水劑要有一定的濃度梯度？脫水開始時(shí)的濃度取決于什么？3材料脫水前的洗滌的目的是什么？選用洗滌液的依據(jù)是什么？第三部分材料的滲蠟和包埋一實(shí)驗(yàn)原理滲蠟是將材料中的透明劑逐步清除，以致完全由石蠟充分滲透。包埋就是把被石蠟浸透的材料連同熔化的石蠟一起倒入一定形狀的容器（如紙張盒）內(nèi)，并立即投入冷水中，使它立即凝固車工內(nèi)含材料的蠟塊，以備切片。二實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆詹牧系拿撍屯该鞯脑砑皾B蠟和包埋的操作規(guī)范；了解石蠟的種類及適用的材料類型。三實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑數(shù)字控制恒溫箱、大小燒杯若干、小木塊，酒精燈；脫水和透明后的的材料；石蠟。四實(shí)驗(yàn)過程（一）滲蠟的概念及方法：讓包埋劑透入整個(gè)組織的過程。方法：人工滲蠟準(zhǔn)備四個(gè)較小的鋁盒（醫(yī)用煮針頭的盒子），用紙板隔成許多小格，分別倒入已融化的石蠟，鋁盒上標(biāo)明“透明劑/石蠟”，“石蠟I”，“石蠟II”和“石蠟III”字樣。自動(dòng)脫水處理機(jī)滲蠟（二）滲蠟操作：系列石蠟：過渡：（1/2石蠟/1/2正丁醇，12h）石蠟Ⅰ（6h）、石蠟Ⅱ（12h）和石蠟Ⅲ（24h）先在“透明劑/石蠟”盒中每格加入一定量透明劑，以淹沒材料為宜，小心將透明后的材料連同標(biāo)簽一起放入每格中，蓋上蓋子，在一定溫度的溫箱中放置過夜（12小時(shí)以上），然后依次入石蠟I、II和III，每步時(shí)間視材料大小和透明劑類型而定，一般可在蠟II過度（在蠟II以后打開蓋子）。由于一些固定劑固定的材料在浸蠟過程中仍在收縮，所以，浸蠟應(yīng)做到時(shí)間短而浸透充分。（三）包埋的操作：包埋用紙盒的準(zhǔn)備。（四）包埋注意事項(xiàng)：（1）弄清要切取的表面，使其朝下，并呈垂直狀態(tài)。（2）防止氣泡產(chǎn)生和材料與周圍蠟塊分離，這就要求掌握好包埋的溫度及操作熟練而迅速。（3）一般在包埋時(shí)，把盛有材料的“石蠟III”取出放在臺(tái)面上，其正上方置一100W鎢絲燈炮，距盆面約10cm，同時(shí)旁邊點(diǎn)燃一酒精燈，用一燒熱的鑷子趕走倒入紙盒的石蠟中的氣泡。（五）蠟塊的修整切割：切塊固定修塊五作業(yè)1簡述材料包埋的操作過程及注意事項(xiàng)。2滲蠟不充分的材料對切片會(huì)有什么影響？3包埋好的蠟塊怎樣進(jìn)行修塊？為什么？第四部分切片、貼片和烤片一實(shí)驗(yàn)原理切片是把包埋好的材料用切片機(jī)切成所需要的厚度的切片帶。貼片是用粘貼劑把切片平鋪在載玻片上，以便于染色。二實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆帐炃衅牟僮饕?guī)范及注意事項(xiàng)；三實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑石蠟切片機(jī)、毛筆、恒溫水浴鍋、粘貼劑、恒溫箱；包埋后的材料；載玻片。四實(shí)驗(yàn)過程（一）切片的準(zhǔn)備工作蠟塊的進(jìn)一步修整切割（二）切片的一般步驟1、蠟塊的固著與修整2、磨刀（自動(dòng)磨刀）3、裝刀以5-8o為宜4、切片旋轉(zhuǎn)切片和滑走切片5、檢查切片：是否切得正，細(xì)胞變形情況，組織拉碎情況等。（三）載玻片的處理：載玻片和蓋玻片的清洗新的載玻片和蓋玻片在酸酒精（95%的酒精中加幾滴濃鹽酸）中浸泡2天。舊的載玻片和蓋玻片先入鉻酸洗液1-2天，取出用洗滌精洗凈，再用流水洗凈，放于95%酒精中。鉻酸洗液配方：75%g重鉻酸鉀+100ml濃硫酸配制：75g重鉻酸鉀加少量dH2O溶化，再加1000ml濃硫酸，邊加邊攪拌，并注意冷卻。（四）郝伯特（Haupt）粘貼劑配制：這是很好的一種粘貼劑，不僅可以粘貼蠟節(jié)，同時(shí)又可作粘附單細(xì)胞藻類或花粉用途，配方：溶液甲：動(dòng)物膠（明膠）lg蒸餾水100ml甘油15g碳酸（結(jié)晶）2g溶液乙：甲醛4ml蒸餾水100ml（五）粘片操作：切片在烤片臺(tái)上（也可用恒溫水溶鍋）放置，40-45℃溫度下幾分鐘，吸去多于的溶液，用解剖針將蠟帶排列好，再將溫度調(diào)至60℃，烤片2—1石蠟切片過程中，切片不能連成帶狀和蠟帶彎曲的原因是什么？2貼片過程應(yīng)注意什么？為什么？第五部分脫蠟、染色、封固一實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞和組織之間的不同結(jié)構(gòu)之所以能被染成各種不同顏色，是由于染料對它們所起的物理或化學(xué)的綜合作用。物理作用：滲透作用：染料滲透到多孔的組織中，與組織沒有牢固的結(jié)合。吸收作用：組織吸收染料中的色素粒子，與之牢固結(jié)合，組織著色與染液的顏色相同，不一定與干燥染料的顏色相同，如品紅在干燥狀態(tài)時(shí)為綠色，而其溶液呈紅色。組織在染色后也呈現(xiàn)紅色，即使組織干燥后，其紅顏色仍不變。吸附作用：染液中分散的色素粒子進(jìn)入被染物質(zhì)的粒子間隙內(nèi)，由于分子的引力作用，色素粒子被吸附而染色。也由于各種蛋白質(zhì)或膠體有不同的吸附面，因此可以吸附不同的離子。也就是說對離子的吸附有選擇性，即有容易被某些物質(zhì)吸附，有的則不容易被吸附?；瘜W(xué)作用：生物細(xì)胞內(nèi)含有酸性和堿性物質(zhì)，分別可與染料中的陽離子和陰離子呼吸結(jié)合，這種反應(yīng)使組織細(xì)胞染上顏色。例如，細(xì)胞核含酸性物質(zhì)，易與堿性染料蘇木精結(jié)合，細(xì)胞質(zhì)為伊紅所染。但是嗜堿性和嗜酸性是相對的，若標(biāo)本在堿性染料液內(nèi)留置過久，細(xì)胞質(zhì)也可著上堿性染料的顏色。單獨(dú)用一種學(xué)說解釋所有的染色現(xiàn)象都是有困難的。染色的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，目前了解得不很清楚。目前比較明確地認(rèn)為，染色主要是由于物理作用與化學(xué)作用綜合發(fā)生作用的結(jié)果。封藏的原理：封藏是使已透明的材料，保存在適合折光率的封藏劑中，（如封藏劑加拿大樹膠的折光率為1.52，它與玻璃的折光率1.51很接近），使材料能在顯微鏡下清晰的顯示出來并能長期保存。二實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^教學(xué)要求學(xué)生掌握材料的染色和封藏的原理；掌握染色和封藏的操作規(guī)范；了解常用染色劑的種類及其應(yīng)用。三實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑染色缸；鑷子；烘干后的切片；1%的番紅50%酒精溶液、5%固綠95%酒精溶液。四實(shí)驗(yàn)過程（一）番紅-固綠對染法：二甲苯Ⅰ(5min)二甲苯Ⅱ(5min)1/2二甲苯/1/2無水乙醇(3min)無水乙醇(2min)95%乙醇(2min)85%乙醇(2min)70%乙醇(2min)50%乙醇(2min)30%乙醇(2min)蒸餾水(2min)番紅水溶液(2h以上)30%乙醇(2min)50%乙醇(2min)70%乙醇(2min)85%乙醇(2min)95%乙醇(2min)含0.5%固綠的95%乙醇(<2min)95%乙醇(2min)