第六章基因克隆操作過程課件

第六章基因克隆操作過程第六章基因克隆操作過程1基因克隆操作過程概述2023/1/42基因克隆操作過程VectorTargetgeneRestrictionendonucleaseVectorTargetgene酶切VectorDNAligase連接轉(zhuǎn)化擴(kuò)增篩選基因克隆操作過程概述2022/12/292基因克隆操作過程V2023/1/4基因克隆操作過程3目的基因的體外重組——酶切和連接（切、接）重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)、增）目的基因轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）2022/12/29基因克隆操作過程3目的基因的體外重組——2023/1/4基因克隆操作過程4本章主要內(nèi)容目的基因的體外重組——切與接重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增——轉(zhuǎn)與增目的基因轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定——檢教學(xué)目的及要求理解基因工程各操作步驟的原理。掌握基因工程克隆目的基因的基本操作。重點(diǎn)：目的基因轉(zhuǎn)化子的篩選方法。應(yīng)用：能夠根據(jù)一定的研究目的，確定基因克隆的策略，并設(shè)計(jì)其技術(shù)路線。2022/12/29基因克隆操作過程4本章主要內(nèi)容教學(xué)目的及一、目的基因的體外重組——切與接2023/1/45基因克隆操作過程InvitroRecombinationofTargetGene——DigestionandLigation一、目的基因的體外重組——切與接2022/12/295基因克1.Digestionbyrestrictionendonuclease（切）2023/1/46基因克隆操作過程目的獲得線性化目的基因片段、線性化載體作用對象目的基因片段、載體工具：限制性核酸內(nèi)切酶TargetgeneVector1.DigestionbyrestrictioneEcoRIPvuII

2023/1/47基因克隆操作過程PstIEcoRIPvuII2022/12/297基因克隆操作2023/1/48基因克隆操作過程各種限制酶酶切反應(yīng)所使用的buffer（Takara）雙酶聯(lián)合酶切所使用的buffer（Takara）2022/12/298基因克隆操作過程各種限制酶酶切反應(yīng)所使單酶切實(shí)例2023/1/49基因克隆操作過程單酶切實(shí)例2022/12/299基因克隆操作過程雙酶聯(lián)合酶切實(shí)例2023/1/410基因克隆操作過程雙酶聯(lián)合酶切實(shí)例2022/12/2910基因克隆操作過程2.LigationbyDNAligase（接）2023/1/411基因克隆操作過程目的獲得含有目的基因的重組分子作用對象線性目的基因片段、線性化載體工具：

DNA連接酶Vector2.LigationbyDNAligase（接）205'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGEcoRI退火T4-DNAligase獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物需要鑒定目的基因的連接方向（1）單酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接2023/1/412基因克隆操作過程5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5同尾酶：能切割產(chǎn)生相同末端的限制性內(nèi)切酶。同尾酶是不同的酶，它們只是切割DNA產(chǎn)生的末端相同，同尾酶之間的識別序列可以相同也可以不同?；蚬こ讨凶R別序列不同的同尾酶的應(yīng)用性最大。

（2）同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接Takara網(wǎng)站提供的同尾酶信息2023/1/413基因克隆操作過程同尾酶：能切割產(chǎn)生相同末端的限制性內(nèi)切酶。（2）同尾酶生產(chǎn)的5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCAT5'

TGATCAACTAGT5'

GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGTTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGTBclIBamHI退火T4-DNAligase獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物需要鑒定目的基因的連接方向目的產(chǎn)物中對應(yīng)位置的序列不再是原來的酶切位點(diǎn)2023/1/414基因克隆操作過程5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG55'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAGGACGTC5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

3'

切平5'

CG5'

GC補(bǔ)平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGGCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGCCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC（3）不同粘性末端的連接PstIBamHIT4-DNApolymeraseKlenowT4-DNAligase獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物需要鑒定目的基因的連接方向；2023/1/415基因克隆操作過程目的產(chǎn)物中對應(yīng)位置的序列不再是原來的酶切位點(diǎn)5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5（4）雙酶聯(lián)合酶切產(chǎn)生的不同粘性末端的連接CTGCAGNNNNNNNNNGGATCCGACGTCNNNNNNNNNCCTAGGCTGCAGATCCGGPstIBamHIPstIBamHIGGATCCCTGCAGCCTAGGGACGTCGATCCCTGCAGG退火CTGCAGGGATCCGACGTCCCTAGGT4-DNAligaseCTGCAGGGATCCGACGTCCCTAGG連接產(chǎn)物中目的基因的方向是確定的2023/1/416基因克隆操作過程（4）雙酶聯(lián)合酶切產(chǎn)生的不同粘性末端的連接CTGCAGNNN5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCG5'

5'5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAGKlenow補(bǔ)平Klenow補(bǔ)平TdTdGTPTdTdCTP退火T4-DNAligase（5）人工粘性末端的連接：5’突出末端EcoRIBamHIBamHIBamHI2023/1/417基因克隆操作過程獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物5'GCCTAGGATCCG5'5'GCTTAA5'CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGGCATGCCCCCC3'CC3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGTdTdCTPTdTdGTP退火KlenowT4-DNAligase（6）人工粘性末端的連接：3’突出末端獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物SphIPstIPstIPstI2023/1/418基因克隆操作過程CTGCA3'GG3'ACGTC5'GCATG5'

G3'C5'C3'GGTTTTTTTTTT3'CC3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAACC3'

GGC3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGGTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGTTdTdTTPTdTdATP退火T4-DNAligase加熱S1nuclease（5）平末端的連接2023/1/419基因克隆操作過程5'G3'C5'C3'GGTTTTTTTTTT5'

5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseGATCC5'

G5'GCCTAG5'5'

5'GGATCCCTAG5'

GATCCCTAGG5'5'BamHIKlenow補(bǔ)平（6）粘性末端的更換GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinkerGGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5'

5'EcoRI2023/1/420基因克隆操作過程5'5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseDNAligase介導(dǎo)的體外連接實(shí)例2023/1/421基因克隆操作過程DNAligase介導(dǎo)的體外連接實(shí)例2022/12/2923.重組率重組率：指在基因重組實(shí)驗(yàn)中，獲得的有目的基因的重組分子數(shù)的數(shù)目，占載體分子總數(shù)的百分比。在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下，重組率一般為25-75%重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標(biāo)，較高的重組率可以大大簡化DNA重組的后續(xù)操作。提高重組率的方法提高外源DNA片段與載體的分子比：5:1-10:1載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)：防止載體自連堿性磷酸單酯酶CIP、BAP2023/1/422基因克隆操作過程3.重組率重組率：指在基因重組實(shí)驗(yàn)中，獲得的有目的基因的重組CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGGCATGCCCCCC3'CC3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGTdTdCTPTdTdGTP退火KlenowT4-DNAligase提高重組率的方法加裝同聚尾末端2023/1/423基因克隆操作過程CTGCA3'GG3'ACGTC5'GCATG二、重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增——轉(zhuǎn)與增2023/1/424基因克隆操作過程二、重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增2022/12/2924基因克1.轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)（1）Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化原理：Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立。其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài)。處于感受態(tài)的細(xì)菌，容易接受外源DNA。2023/1/425基因克隆操作過程1.轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)（1）Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化原2023/1/4基因克隆操作過程《分子克隆第三版》OD600=0.4左右262022/12/29基因克隆操作過程《分子克隆第三版》OD6基因克隆操作過程2023/1/4《分子克隆第三版》27基因克隆操作過程2022/12/29《分子克隆第三版》27Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程中應(yīng)注意的事項(xiàng)轉(zhuǎn)化所用DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%；熱擊過程中不要搖晃離心管；檢測轉(zhuǎn)化子的Amp抗性時(shí)，轉(zhuǎn)化子鋪平板時(shí)密度應(yīng)低一些（104菌落/板）；轉(zhuǎn)化子于37℃培養(yǎng)不要超過20小時(shí)。因?yàn)殇伆暹^密或培養(yǎng)時(shí)間過久會導(dǎo)致平板上出現(xiàn)衛(wèi)星菌落。轉(zhuǎn)化過程中37℃溫育菌體使細(xì)菌復(fù)蘇時(shí)的轉(zhuǎn)速不可過高，為得到較高的轉(zhuǎn)化效率，應(yīng)使轉(zhuǎn)速小于225rpm。當(dāng)用于涂板的轉(zhuǎn)化液過多時(shí)，應(yīng)離心濃縮（4100rpm，5min），并用適量SOC液體培養(yǎng)基重懸菌體沉淀后涂板。剛進(jìn)行完轉(zhuǎn)化的菌體比較脆弱，涂板時(shí)應(yīng)輕輕涂布。2023/1/428基因克隆操作過程Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程中應(yīng)注意的事項(xiàng)2022/12/2928基提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)重要因素：細(xì)胞生長狀態(tài)和密度

不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于４℃的培養(yǎng)菌，最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。DH5α菌株的OD600

為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5×107個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA量過多或體積過大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會降低。1ng的cccDNA可使50μl的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。2023/1/429基因克隆操作過程提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)重要因素：2022/12/2929基因克試劑的質(zhì)量

所用的試劑，如CaCl2

等均需是最高純度的，并用超純水配制（過濾除菌，非高壓滅菌），最好分裝保存于干燥的冷暗處（冰箱4℃）。防止雜菌和雜DNA的污染

整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行,所用器皿如離心管、槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染,否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入,為以后的篩選和鑒定帶來不必要的麻煩。

2023/1/430基因克隆操作過程試劑的質(zhì)量2022/12/2930基因克隆操作過程（2）細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化適用對象：革蘭氏陽性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等），其接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常去除細(xì)胞壁后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這與酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞等類似。細(xì)菌原生質(zhì)體的制備：不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同。以鏈霉菌為例，細(xì)菌需生長在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對溶菌酶的敏感性。在制備過程中，菌體應(yīng)始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無水、無去污劑。細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：由PEG和Ca2+介導(dǎo)細(xì)菌原生質(zhì)體的再生：原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長出細(xì)胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素。2023/1/431基因克隆操作過程（2）細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化2022/12/2931基因克隆操作（3）λ噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)：將大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.5。吸附：加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液，30℃保溫10分鐘。轉(zhuǎn)染裂解：加入20倍體積的新鮮培養(yǎng)基，30℃繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，直至培養(yǎng)液中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選。2023/1/432基因克隆操作過程（3）λ噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染2022/12/2932基因克隆操（4）電穿孔轉(zhuǎn)化原理：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強(qiáng)大電場的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)粒或DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。特點(diǎn)：電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻?xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大。2023/1/433基因克隆操作過程（4）電穿孔轉(zhuǎn)化2022/12/2933基因克隆操作過程（5）酵母的轉(zhuǎn)化一般有以下兩種方法：利用酵母的原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化利用Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化（6）植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及其他基因轉(zhuǎn)移方法葉盤法電擊法

基因槍法

（7）哺乳動物細(xì)胞基因?qū)敕姿徕}沉淀法脂質(zhì)體載體法顯微注射法DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)

2023/1/434基因克隆操作過程（5）酵母的轉(zhuǎn)化一般有以下兩種方法：2022/12/29342.轉(zhuǎn)化率（1）轉(zhuǎn)化率的定義轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，能夠接納DNA的受體細(xì)胞數(shù)目，即克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞無法生長）。2023/1/435基因克隆操作過程2.轉(zhuǎn)化率（1）轉(zhuǎn)化率的定義轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，例如，pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108

，意味著每微克pUC18中只有108個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有3.4×1011個(gè)分子，也就是說，每3400個(gè)pUC18分子中才有一個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞。另一方面，在實(shí)際操作過程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需2mL感受態(tài)細(xì)胞，大約含有2×1010

個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，也就是說，每200個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞能接納pUC18DNA。。2023/1/436基因克隆操作過程例如，pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，意味著另一方面（2）轉(zhuǎn)化率的用途利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì)DNA重組實(shí)驗(yàn)規(guī)模。例如，某一DNA重組實(shí)驗(yàn)的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107/μg載體，經(jīng)切、接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低100倍，欲獲得104個(gè)重組克隆，需投入多少載體DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？（1）若重組率為100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個(gè)重組克隆需要：104/（107/μgX10-2）=0.1μg載體DNA（2）考慮到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為20%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為：0.1/20%=0.5μg載體DNA（3）載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算出（5μg），甚至還可以估算需要涂布多少塊平板進(jìn)行篩選。2023/1/437基因克隆操作過程（2）轉(zhuǎn)化率的用途利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì)DNA（3）轉(zhuǎn)化率的影響因素載體的空間構(gòu)象：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級。插入片段的大?。簩|(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低。受體細(xì)胞：受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高。供體、受體的比例：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化0.1ml感受態(tài)細(xì)胞50ngDNA原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化109

個(gè)原生質(zhì)體50ngDNA轉(zhuǎn)化方法：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化：106-107/μgDNA

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：105-106/μgDNAλ-DNA轉(zhuǎn)染：107-108/μgDNA

電穿孔轉(zhuǎn)化：106-109/μgDNA2023/1/438基因克隆操作過程（3）轉(zhuǎn)化率的影響因素載體的空間構(gòu)象：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率3.轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增（1）擴(kuò)增操作轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時(shí)間培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后，37℃培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)；原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過程；λ噬菌體轉(zhuǎn)染后，30℃培養(yǎng)10min等，均屬擴(kuò)增操作。（2）擴(kuò)增操作的目的增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞；擴(kuò)增和表達(dá)載體分子上的標(biāo)記基因；表達(dá)外源基因，以便于篩選和鑒定。2023/1/439基因克隆操作過程3.轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增（1）擴(kuò)增操作（2）擴(kuò)增操作的目的2022三、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定——檢由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。2023/1/440基因克隆操作過程三、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定——檢由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想1.載體遺傳標(biāo)記檢測（1）抗藥性篩選法將外源DNA片段插在BamHI位點(diǎn)非轉(zhuǎn)化子呈Ampr、Tcr轉(zhuǎn)化子呈Ampr、Tcs2023/1/441基因克隆操作過程1.載體遺傳標(biāo)記檢測（1）抗藥性篩選法將外源DNA片段插在BAp抗藥性篩選法的基本操作先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Amp的平板；再將Amp平板上的菌落影印至含有Amp和Tc的平板上；在Amp平板上生長、但在Amp和Tc平板上不長的菌落即為轉(zhuǎn)化子。

挑選影印

Ap+Tc2023/1/442基因克隆操作過程Ap抗藥性篩選法的基本操作 挑選影印2022/12/2942（2）營養(yǎng)缺陷型篩選法營養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理：載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組分的合成基因，而受體細(xì)胞本身不能合成這一營養(yǎng)組分，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營養(yǎng)組分的培養(yǎng)基上，長出的便是轉(zhuǎn)化子。

常見的營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記用于大腸桿菌的營養(yǎng)標(biāo)記基因，常選用色氨酸生物合成基因trp；用于高等哺乳動物細(xì)胞的營養(yǎng)標(biāo)記基因，常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相應(yīng)的受體細(xì)胞則選擇tk-缺陷型。 2023/1/443基因克隆操作過程（2）營養(yǎng)缺陷型篩選法營養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理：載體分子上（3）顯色篩選法顯色篩選法的基本原理：載體分子上攜帶某種酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和挑選。大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ′基因（編碼β半乳糖苷酶，藍(lán)色反應(yīng)）鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（編碼酪氨酸酶，黑色反應(yīng)）

2023/1/444基因克隆操作過程（3）顯色篩選法顯色篩選法的基本原理：載體分子上攜帶某種酶基顯色篩選法的基本操作將外源基因克隆在pUC18的lacZ′標(biāo)記基因內(nèi)部，使之滅活，此時(shí)轉(zhuǎn)化子為Ampr、lacZ-，呈淡黃色或白色菌落。而非轉(zhuǎn)化子則為Ampr、lacZ+，呈藍(lán)色菌落——藍(lán)白斑篩選。IPTG：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷；X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷,是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的顯色底物2023/1/445基因克隆操作過程顯色篩選法的基本操作將外源基因克隆在pUC18的lacZ′標(biāo)2.克隆DNA序列檢測（1）限制性酶切圖譜法所謂的限制性酶切圖譜法就是對載體上插入的外源DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對比，從而有效地鑒定轉(zhuǎn)化子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)，工作量極大，實(shí)驗(yàn)成本也高。2023/1/446基因克隆操作過程2.克隆DNA序列檢測（1）限制性酶切圖譜法所謂的限制性酶切用BamHI酶切待鑒定菌落的質(zhì)粒DNA，電泳觀察酶解產(chǎn)物片段。轉(zhuǎn)化子：2.7kb+4.0kb非轉(zhuǎn)化子：2.7kb如果外源DNA片段也是2.7kb，最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線性化，然后通過其長度來鑒定其是否為轉(zhuǎn)化子。2023/1/447基因克隆操作過程用BamHI酶切待鑒定菌落的質(zhì)粒DNA，電泳觀察酶解產(chǎn)物片段用EcoRI酶切待鑒定菌落的質(zhì)粒DNA

轉(zhuǎn)化子：3.0kb+3.7kb

或1.0kb+5.7kb用PstI酶切帶鑒定菌落的質(zhì)粒DNA

轉(zhuǎn)化子：3.2kb+3.5kb

或0.8kb+5.9kb2023/1/448基因克隆操作過程用EcoRI酶切待鑒定菌落的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化子：3.0（2）菌落/噬菌斑原位雜交法原理：根據(jù)克隆的目的基因或DNA片段的同源序列設(shè)計(jì)探針，以此篩選含有目的基因的目的重組子。其中，DNA同源序列之間的特異性互補(bǔ)雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù)。2023/1/449基因克隆操作過程菌落原位雜交法的基本操作用硝酸纖維素薄膜影印克隆平板；用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜；用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜；80℃烘干固定影印薄膜；薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫；用SSC-SDS液洗滌雜交薄膜；用X光膠片覆蓋薄膜感光。（2）菌落/噬菌斑原位雜交法原理：根據(jù)克隆的目的基因或DNA（3）DNA序列分析法DNA序列測定是精確鑒定目的基因的重要手段。通過序列比對軟件分析確定轉(zhuǎn)化子：DNAMAN、Blast、ClustalW。2023/1/450基因克隆操作過程（3）DNA序列分析法DNA序列測定是精確鑒定目的基因的重要3.外源基因產(chǎn)物檢測（1）蛋白質(zhì)生物功能測定法a)淀粉酶目的基因的鑒定淀粉酶能將淀粉水解為多糖或單糖。將難溶于水的淀粉加入固體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基呈混濁狀。將待鑒定的重組克隆涂布在此培養(yǎng)基上，含目的基因的轉(zhuǎn)化子可表達(dá)淀粉酶并分泌到胞外，均勻擴(kuò)散，降解淀粉為可溶性的多糖或單糖。因此，轉(zhuǎn)化子菌落周圍會形成透明圈。如果透明圈不明顯，還可往培養(yǎng)板上噴灑碘液，使淀粉所在區(qū)域呈藍(lán)色本底，易于辨認(rèn)。b)蛋白酶、脂肪酶目的基因的鑒定：方法與上類似蛋白酶：水解酪蛋白脂肪酶：水解甘油酯2023/1/451基因克隆操作過程3.外源基因產(chǎn)物檢測（1）蛋白質(zhì)生物功能測定法a)淀粉酶目的c)抗生素抗性基因的鑒定抗生素抗性基因表達(dá)的蛋白質(zhì)能使受體細(xì)胞產(chǎn)生對該抗生素的抗性。據(jù)此，只需往培養(yǎng)板中加入適量抗生素，理論上長出的菌落即是含有目的基因的轉(zhuǎn)化子。

氨芐青霉素：Amp或Ap

卡那霉素：Kan

壯觀霉素：Sp

四環(huán)素：Tc在實(shí)際操作過程中，由于抗生素有時(shí)會誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生抗性，因此必須從抗性重組克隆中抽出重組質(zhì)粒，二次轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。如果此時(shí)轉(zhuǎn)化平板上出現(xiàn)大量的抗性菌落，即可認(rèn)為此前的轉(zhuǎn)化子是陽性轉(zhuǎn)化子。2023/1/452基因克隆操作過程c)抗生素抗性基因的鑒定抗生素抗性基因表達(dá)的蛋白質(zhì)能使受體細(xì)（2）蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法免疫沉淀鑒定在瓊脂培養(yǎng)基中加入目標(biāo)蛋白的特異性抗體；然后涂布轉(zhuǎn)化液；經(jīng)培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)化子菌落便會分泌出目標(biāo)蛋白，并與特異性抗體發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)，在菌落周圍形成白色的圓斑。此法簡便快速，但靈敏度低，抗體消耗量大。2023/1/453基因克隆操作過程（2）蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法免疫沉淀鑒定2022/12/295第六章基因克隆操作過程第六章基因克隆操作過程54基因克隆操作過程概述2023/1/455基因克隆操作過程VectorTargetgeneRestrictionendonucleaseVectorTargetgene酶切VectorDNAligase連接轉(zhuǎn)化擴(kuò)增篩選基因克隆操作過程概述2022/12/292基因克隆操作過程V2023/1/4基因克隆操作過程56目的基因的體外重組——酶切和連接（切、接）重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)、增）目的基因轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）2022/12/29基因克隆操作過程3目的基因的體外重組——2023/1/4基因克隆操作過程57本章主要內(nèi)容目的基因的體外重組——切與接重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增——轉(zhuǎn)與增目的基因轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定——檢教學(xué)目的及要求理解基因工程各操作步驟的原理。掌握基因工程克隆目的基因的基本操作。重點(diǎn)：目的基因轉(zhuǎn)化子的篩選方法。應(yīng)用：能夠根據(jù)一定的研究目的，確定基因克隆的策略，并設(shè)計(jì)其技術(shù)路線。2022/12/29基因克隆操作過程4本章主要內(nèi)容教學(xué)目的及一、目的基因的體外重組——切與接2023/1/458基因克隆操作過程InvitroRecombinationofTargetGene——DigestionandLigation一、目的基因的體外重組——切與接2022/12/295基因克1.Digestionbyrestrictionendonuclease（切）2023/1/459基因克隆操作過程目的獲得線性化目的基因片段、線性化載體作用對象目的基因片段、載體工具：限制性核酸內(nèi)切酶TargetgeneVector1.DigestionbyrestrictioneEcoRIPvuII

2023/1/460基因克隆操作過程PstIEcoRIPvuII2022/12/297基因克隆操作2023/1/461基因克隆操作過程各種限制酶酶切反應(yīng)所使用的buffer（Takara）雙酶聯(lián)合酶切所使用的buffer（Takara）2022/12/298基因克隆操作過程各種限制酶酶切反應(yīng)所使單酶切實(shí)例2023/1/462基因克隆操作過程單酶切實(shí)例2022/12/299基因克隆操作過程雙酶聯(lián)合酶切實(shí)例2023/1/463基因克隆操作過程雙酶聯(lián)合酶切實(shí)例2022/12/2910基因克隆操作過程2.LigationbyDNAligase（接）2023/1/464基因克隆操作過程目的獲得含有目的基因的重組分子作用對象線性目的基因片段、線性化載體工具：

DNA連接酶Vector2.LigationbyDNAligase（接）205'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGEcoRI退火T4-DNAligase獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物需要鑒定目的基因的連接方向（1）單酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接2023/1/465基因克隆操作過程5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5同尾酶：能切割產(chǎn)生相同末端的限制性內(nèi)切酶。同尾酶是不同的酶，它們只是切割DNA產(chǎn)生的末端相同，同尾酶之間的識別序列可以相同也可以不同?；蚬こ讨凶R別序列不同的同尾酶的應(yīng)用性最大。

（2）同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接Takara網(wǎng)站提供的同尾酶信息2023/1/466基因克隆操作過程同尾酶：能切割產(chǎn)生相同末端的限制性內(nèi)切酶。（2）同尾酶生產(chǎn)的5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCAT5'

TGATCAACTAGT5'

GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGTTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGTBclIBamHI退火T4-DNAligase獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物需要鑒定目的基因的連接方向目的產(chǎn)物中對應(yīng)位置的序列不再是原來的酶切位點(diǎn)2023/1/467基因克隆操作過程5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG55'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAGGACGTC5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

3'

切平5'

CG5'

GC補(bǔ)平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGGCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGCCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC（3）不同粘性末端的連接PstIBamHIT4-DNApolymeraseKlenowT4-DNAligase獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物需要鑒定目的基因的連接方向；2023/1/468基因克隆操作過程目的產(chǎn)物中對應(yīng)位置的序列不再是原來的酶切位點(diǎn)5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5（4）雙酶聯(lián)合酶切產(chǎn)生的不同粘性末端的連接CTGCAGNNNNNNNNNGGATCCGACGTCNNNNNNNNNCCTAGGCTGCAGATCCGGPstIBamHIPstIBamHIGGATCCCTGCAGCCTAGGGACGTCGATCCCTGCAGG退火CTGCAGGGATCCGACGTCCCTAGGT4-DNAligaseCTGCAGGGATCCGACGTCCCTAGG連接產(chǎn)物中目的基因的方向是確定的2023/1/469基因克隆操作過程（4）雙酶聯(lián)合酶切產(chǎn)生的不同粘性末端的連接CTGCAGNNN5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCG5'

5'5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAGKlenow補(bǔ)平Klenow補(bǔ)平TdTdGTPTdTdCTP退火T4-DNAligase（5）人工粘性末端的連接：5’突出末端EcoRIBamHIBamHIBamHI2023/1/470基因克隆操作過程獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物5'GCCTAGGATCCG5'5'GCTTAA5'CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGGCATGCCCCCC3'CC3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGTdTdCTPTdTdGTP退火KlenowT4-DNAligase（6）人工粘性末端的連接：3’突出末端獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物SphIPstIPstIPstI2023/1/471基因克隆操作過程CTGCA3'GG3'ACGTC5'GCATG5'

G3'C5'C3'GGTTTTTTTTTT3'CC3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAACC3'

GGC3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGGTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGTTdTdTTPTdTdATP退火T4-DNAligase加熱S1nuclease（5）平末端的連接2023/1/472基因克隆操作過程5'G3'C5'C3'GGTTTTTTTTTT5'

5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseGATCC5'

G5'GCCTAG5'5'

5'GGATCCCTAG5'

GATCCCTAGG5'5'BamHIKlenow補(bǔ)平（6）粘性末端的更換GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinkerGGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5'

5'EcoRI2023/1/473基因克隆操作過程5'5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseDNAligase介導(dǎo)的體外連接實(shí)例2023/1/474基因克隆操作過程DNAligase介導(dǎo)的體外連接實(shí)例2022/12/2923.重組率重組率：指在基因重組實(shí)驗(yàn)中，獲得的有目的基因的重組分子數(shù)的數(shù)目，占載體分子總數(shù)的百分比。在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下，重組率一般為25-75%重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標(biāo)，較高的重組率可以大大簡化DNA重組的后續(xù)操作。提高重組率的方法提高外源DNA片段與載體的分子比：5:1-10:1載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)：防止載體自連堿性磷酸單酯酶CIP、BAP2023/1/475基因克隆操作過程3.重組率重組率：指在基因重組實(shí)驗(yàn)中，獲得的有目的基因的重組CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGGCATGCCCCCC3'CC3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGTdTdCTPTdTdGTP退火KlenowT4-DNAligase提高重組率的方法加裝同聚尾末端2023/1/476基因克隆操作過程CTGCA3'GG3'ACGTC5'GCATG二、重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增——轉(zhuǎn)與增2023/1/477基因克隆操作過程二、重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增2022/12/2924基因克1.轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)（1）Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化原理：Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立。其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài)。處于感受態(tài)的細(xì)菌，容易接受外源DNA。2023/1/478基因克隆操作過程1.轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)（1）Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化原2023/1/4基因克隆操作過程《分子克隆第三版》OD600=0.4左右792022/12/29基因克隆操作過程《分子克隆第三版》OD6基因克隆操作過程2023/1/4《分子克隆第三版》80基因克隆操作過程2022/12/29《分子克隆第三版》27Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程中應(yīng)注意的事項(xiàng)轉(zhuǎn)化所用DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%；熱擊過程中不要搖晃離心管；檢測轉(zhuǎn)化子的Amp抗性時(shí)，轉(zhuǎn)化子鋪平板時(shí)密度應(yīng)低一些（104菌落/板）；轉(zhuǎn)化子于37℃培養(yǎng)不要超過20小時(shí)。因?yàn)殇伆暹^密或培養(yǎng)時(shí)間過久會導(dǎo)致平板上出現(xiàn)衛(wèi)星菌落。轉(zhuǎn)化過程中37℃溫育菌體使細(xì)菌復(fù)蘇時(shí)的轉(zhuǎn)速不可過高，為得到較高的轉(zhuǎn)化效率，應(yīng)使轉(zhuǎn)速小于225rpm。當(dāng)用于涂板的轉(zhuǎn)化液過多時(shí)，應(yīng)離心濃縮（4100rpm，5min），并用適量SOC液體培養(yǎng)基重懸菌體沉淀后涂板。剛進(jìn)行完轉(zhuǎn)化的菌體比較脆弱，涂板時(shí)應(yīng)輕輕涂布。2023/1/481基因克隆操作過程Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程中應(yīng)注意的事項(xiàng)2022/12/2928基提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)重要因素：細(xì)胞生長狀態(tài)和密度

不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于４℃的培養(yǎng)菌，最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。DH5α菌株的OD600

為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5×107個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA量過多或體積過大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會降低。1ng的cccDNA可使50μl的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。2023/1/482基因克隆操作過程提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)重要因素：2022/12/2929基因克試劑的質(zhì)量

所用的試劑，如CaCl2

等均需是最高純度的，并用超純水配制（過濾除菌，非高壓滅菌），最好分裝保存于干燥的冷暗處（冰箱4℃）。防止雜菌和雜DNA的污染

整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行,所用器皿如離心管、槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染,否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入,為以后的篩選和鑒定帶來不必要的麻煩。

2023/1/483基因克隆操作過程試劑的質(zhì)量2022/12/2930基因克隆操作過程（2）細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化適用對象：革蘭氏陽性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等），其接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常去除細(xì)胞壁后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這與酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞等類似。細(xì)菌原生質(zhì)體的制備：不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同。以鏈霉菌為例，細(xì)菌需生長在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對溶菌酶的敏感性。在制備過程中，菌體應(yīng)始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無水、無去污劑。細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：由PEG和Ca2+介導(dǎo)細(xì)菌原生質(zhì)體的再生：原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長出細(xì)胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素。2023/1/484基因克隆操作過程（2）細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化2022/12/2931基因克隆操作（3）λ噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)：將大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.5。吸附：加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液，30℃保溫10分鐘。轉(zhuǎn)染裂解：加入20倍體積的新鮮培養(yǎng)基，30℃繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，直至培養(yǎng)液中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選。2023/1/485基因克隆操作過程（3）λ噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染2022/12/2932基因克隆操（4）電穿孔轉(zhuǎn)化原理：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強(qiáng)大電場的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。特點(diǎn)：電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻?xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大。2023/1/486基因克隆操作過程（4）電穿孔轉(zhuǎn)化2022/12/2933基因克隆操作過程（5）酵母的轉(zhuǎn)化一般有以下兩種方法：利用酵母的原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化利用Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化（6）植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及其他基因轉(zhuǎn)移方法葉盤法電擊法

基因槍法

（7）哺乳動物細(xì)胞基因?qū)敕姿徕}沉淀法脂質(zhì)體載體法顯微注射法DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)

2023/1/487基因克隆操作過程（5）酵母的轉(zhuǎn)化一般有以下兩種方法：2022/12/29342.轉(zhuǎn)化率（1）轉(zhuǎn)化率的定義轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，能夠接納DNA的受體細(xì)胞數(shù)目，即克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞無法生長）。2023/1/488基因克隆操作過程2.轉(zhuǎn)化率（1）轉(zhuǎn)化率的定義轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，例如，pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108

，意味著每微克pUC18中只有108個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有3.4×1011個(gè)分子，也就是說，每3400個(gè)pUC18分子中才有一個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞。另一方面，在實(shí)際操作過程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需2mL感受態(tài)細(xì)胞，大約含有2×1010

個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，也就是說，每200個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞能接納pUC18DNA。。2023/1/489基因克隆操作過程例如，pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，意味著另一方面（2）轉(zhuǎn)化率的用途利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì)DNA重組實(shí)驗(yàn)規(guī)模。例如，某一DNA重組實(shí)驗(yàn)的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107/μg載體，經(jīng)切、接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低100倍，欲獲得104個(gè)重組克隆，需投入多少載體DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？（1）若重組率為100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個(gè)重組克隆需要：104/（107/μgX10-2）=0.1μg載體DNA（2）考慮到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為20%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為：0.1/20%=0.5μg載體DNA（3）載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算出（5μg），甚至還可以估算需要涂布多少塊平板進(jìn)行篩選。2023/1/490基因克隆操作過程（2）轉(zhuǎn)化率的用途利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì)DNA（3）轉(zhuǎn)化率的影響因素載體的空間構(gòu)象：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級。插入片段的大小：對質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低。受體細(xì)胞：受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高。供體、受體的比例：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化0.1ml感受態(tài)細(xì)胞50ngDNA原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化109

個(gè)原生質(zhì)體50ngDNA轉(zhuǎn)化方法：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化：106-107/μgDNA

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：105-106/μgDNAλ-DNA轉(zhuǎn)染：107-108/μgDNA

電穿孔轉(zhuǎn)化：106-109/μgDNA2023/1/491基因克隆操作過程（3）轉(zhuǎn)化率的影響因素載體的空間構(gòu)象：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率3.轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增（1）擴(kuò)增操作轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時(shí)間培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后，37℃培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)；原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過程；λ噬菌體轉(zhuǎn)染后，30℃培養(yǎng)10min等，均屬擴(kuò)增操作。（2）擴(kuò)增操作的目的增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞；擴(kuò)增和表達(dá)載體分子上的標(biāo)記基因；表達(dá)外源基因，以便于篩選和鑒定。2023/1/492基因克隆操作過程3.轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增（1）擴(kuò)增操作（2）擴(kuò)增操作的目的2022三、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定——檢由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。2023/1/493基因克隆操作過程三、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定——檢由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想1.載體遺傳標(biāo)記檢測（1）抗藥性篩選法將外源DNA片段插在BamHI位點(diǎn)非轉(zhuǎn)化子呈Ampr、Tcr轉(zhuǎn)化子呈Ampr、Tcs2023/1/494基因克隆操作過程1.載體遺傳標(biāo)記檢測（1）抗藥性篩選法將外源DNA片段插在BAp抗藥性篩選法的基本操作先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Amp的平板；再將Amp