時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)培訓(xùn)課件

時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)1問題★什么是時(shí)間分辨熒光免疫分析（TrFIA）？★TrFIA的標(biāo)記物及特點(diǎn)。★為什么叫“時(shí)間分辨”?★TrFIA的檢測原理★各種免疫方法學(xué)的比較★

TrFIA的臨床應(yīng)用2時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)問題★什么是時(shí)間分辨熒光免疫分析（TrFIA）？2時(shí)間分辨熒光免疫（TrFIA）

（Time-ResoledFluoroimmunoassay）3時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫（TrFIA）

（Time-Resol3定義TrFIA分析法是用三價(jià)稀土離子及其螯合劑作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、同位素或酶，標(biāo)記蛋白質(zhì)、多胎、激素、抗體、核酸探針或生物活性細(xì)胞，當(dāng)反應(yīng)體系發(fā)生后，用TRF儀器測定最后產(chǎn)物中熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度或相對(duì)熒光強(qiáng)度比值，來判斷反應(yīng)體系被分析物的濃度，達(dá)到定量分析之目的。4時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)定義TrFIA分析法是用三價(jià)稀土離子及其螯合劑作為示蹤物4發(fā)展歷程1979年，芬蘭SOINI和HEMMIA

提出“時(shí)間分辨熒光免疫分析”理論1983年SOINI和KOJOLA

提出以鑭系元素標(biāo)記為示蹤螯合物和時(shí)間分辨熒光測量相結(jié)合，建立一種新的非放射性微量分析技術(shù)現(xiàn)已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床超微量生化檢驗(yàn)中一項(xiàng)最有發(fā)展前景的分析手段。5時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)發(fā)展歷程1979年，芬蘭SOINI和HEMMIA5時(shí)間分辨熒5廠家芬蘭的WALLAC和加拿大一家公司，但加拿大使用激光，主要在科研WALLAC和新波公司使用疝燈，主要用于臨床

6時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)廠家芬蘭的WALLAC和加拿大一家公司，但加拿大使用6標(biāo)記物為具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘南⊥两饘?--鑭系元素鑭系元素共有15種，屬三價(jià)元素，應(yīng)用在時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)中有四種：銪(Eu)、釤Sm)、鏑(Dy)、鋱(Te)Eu3+的應(yīng)用最為廣泛，

Sm3+可作為第二種選擇以進(jìn)行雙標(biāo)記或多標(biāo)記技術(shù)不同的三價(jià)稀土離子具有不同發(fā)射光譜和各自不同的熒光壽命等特點(diǎn)，這樣就適合進(jìn)行雙標(biāo)記和多標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)可同時(shí)檢測一個(gè)樣品中，兩種或兩種以上的抗原或抗體，即一個(gè)試劑盒相當(dāng)與兩個(gè)試劑盒或多個(gè)試劑盒，這就是我們所說的多標(biāo)記技術(shù)。

7時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)標(biāo)記物為具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘南⊥两饘?--鑭系元素鑭系元素共有7鑭系元素?zé)晒馓攸c(diǎn)：熒光壽命極長鑭系元素螯合物（60~900us)<銪：714us>普通熒光免疫中熒光團(tuán)：1~100ns樣本中蛋白質(zhì)熒光：1~10ns，易猝滅。Stokes位移大銪：發(fā)射光613nm、激發(fā)光340nm，熒光素的Stokes位移近280nm熒光特異性強(qiáng)。（發(fā)射光譜帶很窄：615±5nm）解離-增強(qiáng)技術(shù)可使其熒光性提高100萬倍8時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)鑭系元素?zé)晒馓攸c(diǎn)：8時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)8時(shí)間分辨生物制品（如蛋白質(zhì)）本身產(chǎn)生的熒光波長位于400-600nm，所以用普通熒光素來檢測生物樣品時(shí)，自然本底的熒光干擾太大。樣品中蛋白質(zhì)類的本底熒光衰變時(shí)間約為1-10nsTrFIA技術(shù)中，由于鑭系稀土離子螯合物所產(chǎn)生的熒光不僅強(qiáng)度高，而且半壽期也長，介于10-1000us之間，比普通熒光標(biāo)記物高5-6個(gè)數(shù)量級(jí)（1000ns=1us)。含有銪或釤的螯合物的熒光衰變時(shí)間分別為730000ns和50000ns。因此利用延緩測量時(shí)間，待測樣品中短壽命的自然熒光完全衰變后，再檢測稀土離子螯合物的熒光信號(hào)（見圖1）。消除了來自樣品、試劑及其他非特異熒光，從而達(dá)到降低自然本底熒光和消除樣品熒光的干擾，大大提高了檢測靈敏讀。這既是我們長提到的時(shí)間分辨。9時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)時(shí)間分辨9時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)9通過時(shí)間延遲，將特異性熒光與非特異性熒光分辨開來，使本底達(dá)到0利用鑭系元素?zé)晒馕锢硖匦?，熒光激發(fā)后在固定時(shí)間段檢測特異性熒光。而在此時(shí)間之前，非特異性熒光已完全衰減為0圖110時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)通過時(shí)間延遲，將特異性熒光與非特異性熒光利用鑭系元素?zé)晒馕锢?0Stokes位移Stokes位移：是指激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的光譜波峰的波長差。例如TRF中銪的激發(fā)光波長340nm,發(fā)射光波長613nm，兩者之間的波長差即Stokes位移為273nm（見圖2），所以激發(fā)光和發(fā)射光很容易用干涉濾光片分開。而普通熒光物質(zhì)的激發(fā)光與發(fā)射光之間的波長差即Stokes位移為28nm，那就很難排除激發(fā)光對(duì)發(fā)射光的干擾，影響檢測結(jié)果。11時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)Stokes位移Stokes位移：是指激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間11利用鑭系元素光譜特點(diǎn)，將發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分辨開來，零本底的又一保障發(fā)射光譜與激發(fā)光譜間存在的巨大Stokes位移?？梢酝ㄟ^干涉濾光片將發(fā)射光譜與激發(fā)光譜完全分離。圖212時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)利用鑭系元素光譜特點(diǎn)，將發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分辨開來，零本底的12稀土離子激發(fā)光、發(fā)射光和Stokes位移

稀土離子螯合物激發(fā)光波長（nm）發(fā)射光波長（nm）Stokes位移（nm）Eu-螯合物

340613273Sm-螯合物

340600260Tb-螯合物

295490/543195/248Dy-螯合物

29557327813時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)稀土離子激發(fā)光、發(fā)射光和Stokes位移稀土離子螯合物激13解離增強(qiáng)技術(shù)解離增強(qiáng)技術(shù)是TRF技術(shù)中所特有的指當(dāng)免疫反應(yīng)完成后部分標(biāo)記物結(jié)合到固相載體上，未結(jié)合的標(biāo)記物被洗掉。再加入低PH值（PH2~3）的增強(qiáng)液，把Eu或Sm從免疫復(fù)合物中解離下來，與增強(qiáng)液中的螯合物質(zhì)（β-二酮體）結(jié)合形成新的螯合物，使標(biāo)記物產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)近百萬倍14時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)解離增強(qiáng)技術(shù)14時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)14時(shí)間分辨熒光免疫的原理用三價(jià)稀土離子及其螯合物作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、同位素、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標(biāo)記抗原、抗體、核酸探針等物質(zhì)；當(dāng)免疫過程結(jié)束后，根據(jù)稀土離子螯合物的熒光光譜的物理特點(diǎn)（Ⅰ特異性強(qiáng)、ⅡStokes位移大、Ⅲ壽命長），并采用解離-增強(qiáng)技術(shù)（ⅣDELFIA）放大有效熒光；最后用時(shí)間分辨熒光分析儀，測定免疫反應(yīng)最后產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。根據(jù)已知濃度所確定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，來判斷未知樣品的濃度值，以達(dá)到定量分析的目的。15時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫的原理用三價(jià)稀土離子及其螯合物作為示蹤物，代15時(shí)間分辨熒光免疫原理圖

（Time-resolvedFluorescenceImmunoassay）16時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫原理圖

（Time-resolvedFlu16乙肝“兩對(duì)半”TRFIA定量檢測原理示意圖17時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)乙肝“兩對(duì)半”TRFIA定量檢測原理示意圖17時(shí)間分辨熒光17乙肝表面抗原免疫反應(yīng)圖

（時(shí)間分辨熒光法）18時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)乙肝表面抗原免疫反應(yīng)圖18乙肝表面抗體免疫反應(yīng)圖

（時(shí)間分辨熒光法）19時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)乙肝表面抗體免疫反應(yīng)圖19乙肝ｅ抗原免疫反應(yīng)圖

（時(shí)間分辨熒光法）20時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)乙肝ｅ抗原免疫反應(yīng)圖

（時(shí)間分辨熒光法）20時(shí)間分辨熒光免20乙肝ｅ抗體免疫反應(yīng)圖

（時(shí)間分辨熒光法）21時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)乙肝ｅ抗體免疫反應(yīng)圖

（時(shí)間分辨熒光法）21時(shí)間分辨熒光免疫21乙肝核心抗體免疫反應(yīng)圖

（時(shí)間分辨熒光法）22時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)乙肝核心抗體免疫反應(yīng)圖22時(shí)間分辨熒光免疫的試劑種類甲狀腺功能檢測TSH，UltraTSH，T3，T4，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4，TBG，TG性激素類檢測FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG腫瘤標(biāo)記檢測AFP，CEA，PSA，hTG，β-2Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total），PSAEQM，CA-50，CA-125，CA-199遺傳科檢查產(chǎn)前篩查： hAFP/HCG，PAPPA新生兒篩查： Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OHProg，PKU傳染病檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb血液科檢測貧血檢查： Ferritin，VitB12，F(xiàn)olicacid科研工具單標(biāo)記檢測，雙標(biāo)記檢測，三標(biāo)記檢測，四標(biāo)記檢測23時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫的試劑種類甲狀腺功能檢測23時(shí)間分辨熒光免疫23時(shí)間分辨熒光免疫分析與其它

免疫學(xué)方法的比較24時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫分析與其它

免疫學(xué)方法的比較24時(shí)間分辨熒光24標(biāo)記免疫學(xué)發(fā)展歷程酶聯(lián)免疫 （精度：10-9mol/L）放射免疫 （精度：10-12mol/L）化學(xué)發(fā)光（精度：10-15mol/L）電化學(xué)發(fā)光 （精度：10-17mol/L）時(shí)間分辨熒光（精度：10-18mol/L）生物芯片（未知）

酶免疫技術(shù)熒光抗體技術(shù)三大標(biāo)記技術(shù)放射免疫分析25時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)標(biāo)記免疫學(xué)發(fā)展歷程酶聯(lián)免疫 （精度：10-9mol/L25

待測物質(zhì)濃度與檢測手段

臨床化學(xué)分析pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析TherapeuticDrugs(藥物濃度)ThyroidHormone(甲狀腺激素)FertilityHormone(孕激素)CancerMarkers(腫瘤標(biāo)記物)InfectiousDisease(傳染病)Vitamins(維生素)SerumProteins(血清蛋白)10-1210-910-610-310-026時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)待測物質(zhì)濃度與檢測手段臨床化學(xué)分析pg/mLng/mLm26時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)培訓(xùn)課件27放射性免疫分析法（RIA）

---標(biāo)記物：125I應(yīng)用放免自60年代問世以來對(duì)臨床診斷起了革命性的貢獻(xiàn)，是一項(xiàng)較為成熟的診斷技術(shù)。夾心法、競爭法的標(biāo)記原理為以后的檢測技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。缺點(diǎn)放射性（125I），對(duì)環(huán)境的污染及對(duì)身體的危害，已經(jīng)為重視環(huán)保的國家逐步取消。（如整個(gè)歐洲僅尚存幾個(gè)放免試驗(yàn)室）125I的半衰期短而導(dǎo)致其試劑有效期短。標(biāo)記物125I的穩(wěn)定性差，導(dǎo)致試劑盒批間、批內(nèi)的變異較大；標(biāo)準(zhǔn)曲線有效期短，必須每次定標(biāo)，造成浪費(fèi)。操作繁瑣，出報(bào)告時(shí)間長。無法保存?zhèn)溆谩?8時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)放射性免疫分析法（RIA）

---標(biāo)記物：125I應(yīng)用缺點(diǎn)28酶免疫分析法（ELISA）

---標(biāo)記物：HRP(辣根過氧化物酶）應(yīng)用酶免的最大優(yōu)勢在于避免了對(duì)環(huán)境和人體危害。試劑有效期較長。衍生技術(shù)：熒光酶免疫分析增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)磁酶免分析曾經(jīng)一度被認(rèn)為是取代放免的檢測手段。缺點(diǎn)靈敏度、重復(fù)性不及放免，易造成漏檢和假陽性。因酶的純度和反應(yīng)過程容易受環(huán)境因素影響，導(dǎo)致穩(wěn)定性不好。29時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)酶免疫分析法（ELISA）

29化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）

---標(biāo)記物：化學(xué)發(fā)光物質(zhì)（魯米諾）應(yīng)用單個(gè)樣本檢測速度快，適合做急診。靈敏度較高。自動(dòng)化程度高。儀器種類：拜耳—ACS180系列雅培—AXSYM貝克曼—ACCESS德普—IMMULITE缺點(diǎn)樣品不能重復(fù)檢測；出現(xiàn)故障則整批試劑及血樣報(bào)廢。本底較高，易受環(huán)境物質(zhì)干擾。儀器故障率較高。標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性較差，需多次定標(biāo)。檢測精度不高，在超微量分析及早期診斷方面能力不足。非開放性試劑；試劑價(jià)格高。30時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）

---標(biāo)記物：化學(xué)發(fā)光物30電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECL）

---標(biāo)記物：三聯(lián)吡啶釕應(yīng)用80年代末期問世的新型化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。基本原理：根據(jù)三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]和三丙胺在電場觸發(fā)下產(chǎn)生發(fā)光的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。本底較小、靈敏度較高、線性范圍較寬。缺點(diǎn)儀器檢測速度慢（羅氏公司）ECL1010——60測試/小時(shí)ECL2010——90測試/小時(shí)非開放性試劑系統(tǒng)、不能做科研。試劑價(jià)格過高。31時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECL）

---標(biāo)記物：三聯(lián)吡啶釕應(yīng)用31TRFIA在乙肝“兩對(duì)半”定量檢測應(yīng)用32時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)TRFIA在乙肝“兩對(duì)半”定量檢測應(yīng)用32時(shí)間分辨熒光免疫技32一、提高了檢測的靈敏度

時(shí)間分辨熒光法（TRFIA）檢測HBsAg靈敏度可達(dá)到0.2ng/ml，而酶免法（ELISA）檢測HBsAg靈敏度是2ng/ml。

縮短了急性乙肝檢測的“窗口期”二、動(dòng)態(tài)觀察療效和病情檢測

疾病的發(fā)生、發(fā)展、療效、預(yù)后是個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過程，TRFIA定量檢測乙肝“兩對(duì)半”各項(xiàng)標(biāo)志物的濃度變化可對(duì)乙肝的病程、治療、預(yù)后起到動(dòng)態(tài)檢測的作用，指導(dǎo)醫(yī)生治療。33時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)一、提高了檢測的靈敏度二、動(dòng)態(tài)觀察療效和病情檢測33時(shí)間分辨33（1）定量分析HBsAg和HBsAb濃度的變化，可以預(yù)見急性乙肝是否處于恢復(fù)期

如HBsAg濃度降低，HBsAb逐漸升高，說明病情正向恢復(fù)期發(fā)展反之。反之，HBsAg濃度處于高水平或上升，而HBsAb處于低水平，則容易發(fā)展為慢性乙肝或攜帶者。（2）定量分析HBeAg和HBeAb的濃度變化，可以反映病情變化和治療效果。

1、HBeAg向HBeAb轉(zhuǎn)換時(shí)期，即表現(xiàn)為HBeAg濃度下降和HBeAb濃度升高。

2、高濃度的HBeAg提示病毒處于高復(fù)制狀態(tài)，有較強(qiáng)傳染性。

3、高濃度的HBeAb一方面提示病情的好轉(zhuǎn)，但在有些時(shí)候（如肝功能指標(biāo)很差）可能與肝壞死、肝硬化、肝癌有關(guān)。34時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)（1）定量分析HBsAg和HBsAb濃度的變化，可以預(yù)見急性34（3）HBcAb濃度的高低可以反映病毒感染的狀態(tài)

1、乙肝急性感染常為高滴度的HBcAb，恢復(fù)期濃度下降，慢性乙肝HBcAb呈持續(xù)高濃度。

2、低濃度的HBcAb一般為恢復(fù)期或既往感染。（4）有利于對(duì)慢性肝炎活動(dòng)性和非活動(dòng)性的判斷

非活動(dòng)性慢性乙肝各項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)穩(wěn)定活動(dòng)性慢性乙肝往往呈進(jìn)行性變化35時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)（3）HBcAb濃度的高低可以反映病毒感染的狀態(tài)（4）有利于35三、乙肝疫苗接種

HBsAb是一種真正意義的保護(hù)性抗體，其定量的檢測可以對(duì)其具有的免疫力做出正確的評(píng)價(jià)，對(duì)乙肝的預(yù)防起到監(jiān)督作用。定量ELISA（定性）意義0~10mIU/ml陰性（-）機(jī)體對(duì)乙肝病毒無免疫力，易感染乙肝病毒10~100mIU/ml陽性（+）`機(jī)體對(duì)乙肝病毒的免疫力很弱，甚至不能預(yù)防HBV感染，仍有感染HBV的危險(xiǎn)>100mIU/ml陽性（+）機(jī)體對(duì)乙肝病毒有較強(qiáng)的免疫力，使機(jī)體有抵抗HBV入侵的作用，較大程度上減少感染HBV的風(fēng)險(xiǎn)36時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)三、乙肝疫苗接種定量ELISA（定性）意義0~36

由此可見定量測定對(duì)乙肝疫苗免疫力的評(píng)估和高危人群預(yù)防免疫具有重要意義，特別是在少年兒童預(yù)防乙肝方面37時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)由此可見定量測定對(duì)乙肝疫苗免疫力的評(píng)估和高危37四、HBV血清學(xué)標(biāo)志物與HBV-DNA的關(guān)系血清學(xué)標(biāo)志物

反映機(jī)體對(duì)病毒的免疫狀態(tài)，病程，判斷病情，不能完全反映病毒在體內(nèi)的復(fù)制狀況HBV-DNA

1、真實(shí)反映病毒在體內(nèi)復(fù)制水平，觀察藥物療效

2、部分“小三陽”及低水平病毒復(fù)制時(shí)出現(xiàn)陰性

3、不能反映機(jī)體的免疫狀態(tài)和病情38時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)四、HBV血清學(xué)標(biāo)志物與HBV-DNA的關(guān)系38時(shí)間分辨熒光38血清HBV-DNA熒光定量PCR測定可以直接反映病毒的數(shù)量，病毒的復(fù)制情況，具有很多臨床應(yīng)用價(jià)值，但不能完全反映病毒復(fù)制靜息期肝細(xì)胞內(nèi)HBV病毒的狀態(tài)HBV-DNA陰性并不完全代表體內(nèi)HBV已被清除，結(jié)合“兩對(duì)半”各項(xiàng)指標(biāo)更能客觀反映體內(nèi)HBV病毒狀態(tài)，正確的判斷預(yù)后和治療39時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)血清HBV-DNA熒光定量PCR測定可以直接反映病毒的數(shù)量，39時(shí)間分辨法檢測“乙肝兩對(duì)半”的意義原子標(biāo)記、靈敏度高，有效區(qū)分弱陽性與陰性，減少灰區(qū)兩步法采用，最大限度避免HOKE現(xiàn)象出現(xiàn)。（即強(qiáng)陽性的標(biāo)本檢測為陰性）定量檢測可以動(dòng)態(tài)觀察治療效果乙肝疫苗接種的量化評(píng)價(jià)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，價(jià)格適中40時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)時(shí)間分辨法檢測“乙肝兩對(duì)半”的意義原子標(biāo)記、靈敏度高，有效區(qū)40NCU/ml單位來源NationalCenterforClinicalLaboratory(NCCL)國家衛(wèi)生部臨檢中心NC

＋UNIT

＝NCU/ml41時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)NCU/ml單位來源NationalCenterfor41半自動(dòng)ANYTEST200042時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)半自動(dòng)ANYTEST200042時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)42謝謝！43時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)謝謝！43時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)43謝謝！放映結(jié)束感謝各位批評(píng)指導(dǎo)！讓我們共同進(jìn)步44時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)謝謝！放映結(jié)束感謝各位批評(píng)指導(dǎo)！讓我們共同進(jìn)步44時(shí)間分44時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)45問題★什么是時(shí)間分辨熒光免疫分析（TrFIA）？★TrFIA的標(biāo)記物及特點(diǎn)?！餅槭裁唇小皶r(shí)間分辨”?★TrFIA的檢測原理★各種免疫方法學(xué)的比較★

TrFIA的臨床應(yīng)用46時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)問題★什么是時(shí)間分辨熒光免疫分析（TrFIA）？46時(shí)間分辨熒光免疫（TrFIA）

（Time-ResoledFluoroimmunoassay）47時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫（TrFIA）

（Time-Resol47定義TrFIA分析法是用三價(jià)稀土離子及其螯合劑作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、同位素或酶，標(biāo)記蛋白質(zhì)、多胎、激素、抗體、核酸探針或生物活性細(xì)胞，當(dāng)反應(yīng)體系發(fā)生后，用TRF儀器測定最后產(chǎn)物中熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度或相對(duì)熒光強(qiáng)度比值，來判斷反應(yīng)體系被分析物的濃度，達(dá)到定量分析之目的。48時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)定義TrFIA分析法是用三價(jià)稀土離子及其螯合劑作為示蹤物48發(fā)展歷程1979年，芬蘭SOINI和HEMMIA

提出“時(shí)間分辨熒光免疫分析”理論1983年SOINI和KOJOLA

提出以鑭系元素標(biāo)記為示蹤螯合物和時(shí)間分辨熒光測量相結(jié)合，建立一種新的非放射性微量分析技術(shù)現(xiàn)已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床超微量生化檢驗(yàn)中一項(xiàng)最有發(fā)展前景的分析手段。49時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)發(fā)展歷程1979年，芬蘭SOINI和HEMMIA5時(shí)間分辨熒49廠家芬蘭的WALLAC和加拿大一家公司，但加拿大使用激光，主要在科研WALLAC和新波公司使用疝燈，主要用于臨床

50時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)廠家芬蘭的WALLAC和加拿大一家公司，但加拿大使用50標(biāo)記物為具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘南⊥两饘?--鑭系元素鑭系元素共有15種，屬三價(jià)元素，應(yīng)用在時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)中有四種：銪(Eu)、釤Sm)、鏑(Dy)、鋱(Te)Eu3+的應(yīng)用最為廣泛，

Sm3+可作為第二種選擇以進(jìn)行雙標(biāo)記或多標(biāo)記技術(shù)不同的三價(jià)稀土離子具有不同發(fā)射光譜和各自不同的熒光壽命等特點(diǎn)，這樣就適合進(jìn)行雙標(biāo)記和多標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)可同時(shí)檢測一個(gè)樣品中，兩種或兩種以上的抗原或抗體，即一個(gè)試劑盒相當(dāng)與兩個(gè)試劑盒或多個(gè)試劑盒，這就是我們所說的多標(biāo)記技術(shù)。

51時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)標(biāo)記物為具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘南⊥两饘?--鑭系元素鑭系元素共有51鑭系元素?zé)晒馓攸c(diǎn)：熒光壽命極長鑭系元素螯合物（60~900us)<銪：714us>普通熒光免疫中熒光團(tuán)：1~100ns樣本中蛋白質(zhì)熒光：1~10ns，易猝滅。Stokes位移大銪：發(fā)射光613nm、激發(fā)光340nm，熒光素的Stokes位移近280nm熒光特異性強(qiáng)。（發(fā)射光譜帶很窄：615±5nm）解離-增強(qiáng)技術(shù)可使其熒光性提高100萬倍52時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)鑭系元素?zé)晒馓攸c(diǎn)：8時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)52時(shí)間分辨生物制品（如蛋白質(zhì)）本身產(chǎn)生的熒光波長位于400-600nm，所以用普通熒光素來檢測生物樣品時(shí)，自然本底的熒光干擾太大。樣品中蛋白質(zhì)類的本底熒光衰變時(shí)間約為1-10nsTrFIA技術(shù)中，由于鑭系稀土離子螯合物所產(chǎn)生的熒光不僅強(qiáng)度高，而且半壽期也長，介于10-1000us之間，比普通熒光標(biāo)記物高5-6個(gè)數(shù)量級(jí)（1000ns=1us)。含有銪或釤的螯合物的熒光衰變時(shí)間分別為730000ns和50000ns。因此利用延緩測量時(shí)間，待測樣品中短壽命的自然熒光完全衰變后，再檢測稀土離子螯合物的熒光信號(hào)（見圖1）。消除了來自樣品、試劑及其他非特異熒光，從而達(dá)到降低自然本底熒光和消除樣品熒光的干擾，大大提高了檢測靈敏讀。這既是我們長提到的時(shí)間分辨。53時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)時(shí)間分辨9時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)53通過時(shí)間延遲，將特異性熒光與非特異性熒光分辨開來，使本底達(dá)到0利用鑭系元素?zé)晒馕锢硖匦?，熒光激發(fā)后在固定時(shí)間段檢測特異性熒光。而在此時(shí)間之前，非特異性熒光已完全衰減為0圖154時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)通過時(shí)間延遲，將特異性熒光與非特異性熒光利用鑭系元素?zé)晒馕锢?4Stokes位移Stokes位移：是指激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的光譜波峰的波長差。例如TRF中銪的激發(fā)光波長340nm,發(fā)射光波長613nm，兩者之間的波長差即Stokes位移為273nm（見圖2），所以激發(fā)光和發(fā)射光很容易用干涉濾光片分開。而普通熒光物質(zhì)的激發(fā)光與發(fā)射光之間的波長差即Stokes位移為28nm，那就很難排除激發(fā)光對(duì)發(fā)射光的干擾，影響檢測結(jié)果。55時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)Stokes位移Stokes位移：是指激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間55利用鑭系元素光譜特點(diǎn)，將發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分辨開來，零本底的又一保障發(fā)射光譜與激發(fā)光譜間存在的巨大Stokes位移?？梢酝ㄟ^干涉濾光片將發(fā)射光譜與激發(fā)光譜完全分離。圖256時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)利用鑭系元素光譜特點(diǎn)，將發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分辨開來，零本底的56稀土離子激發(fā)光、發(fā)射光和Stokes位移

稀土離子螯合物激發(fā)光波長（nm）發(fā)射光波長（nm）Stokes位移（nm）Eu-螯合物

340613273Sm-螯合物

340600260Tb-螯合物

295490/543195/248Dy-螯合物

29557327857時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)稀土離子激發(fā)光、發(fā)射光和Stokes位移稀土離子螯合物激57解離增強(qiáng)技術(shù)解離增強(qiáng)技術(shù)是TRF技術(shù)中所特有的指當(dāng)免疫反應(yīng)完成后部分標(biāo)記物結(jié)合到固相載體上，未結(jié)合的標(biāo)記物被洗掉。再加入低PH值（PH2~3）的增強(qiáng)液，把Eu或Sm從免疫復(fù)合物中解離下來，與增強(qiáng)液中的螯合物質(zhì)（β-二酮體）結(jié)合形成新的螯合物，使標(biāo)記物產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)近百萬倍58時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)解離增強(qiáng)技術(shù)14時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)58時(shí)間分辨熒光免疫的原理用三價(jià)稀土離子及其螯合物作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、同位素、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標(biāo)記抗原、抗體、核酸探針等物質(zhì)；當(dāng)免疫過程結(jié)束后，根據(jù)稀土離子螯合物的熒光光譜的物理特點(diǎn)（Ⅰ特異性強(qiáng)、ⅡStokes位移大、Ⅲ壽命長），并采用解離-增強(qiáng)技術(shù)（ⅣDELFIA）放大有效熒光；最后用時(shí)間分辨熒光分析儀，測定免疫反應(yīng)最后產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。根據(jù)已知濃度所確定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，來判斷未知樣品的濃度值，以達(dá)到定量分析的目的。59時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫的原理用三價(jià)稀土離子及其螯合物作為示蹤物，代59時(shí)間分辨熒光免疫原理圖

（Time-resolvedFluorescenceImmunoassay）60時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫原理圖

（Time-resolvedFlu60乙肝“兩對(duì)半”TRFIA定量檢測原理示意圖61時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)乙肝“兩對(duì)半”TRFIA定量檢測原理示意圖17時(shí)間分辨熒光61乙肝表面抗原免疫反應(yīng)圖

（時(shí)間分辨熒光法）62時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)乙肝表面抗原免疫反應(yīng)圖62乙肝表面抗體免疫反應(yīng)圖

（時(shí)間分辨熒光法）63時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)乙肝表面抗體免疫反應(yīng)圖63乙肝ｅ抗原免疫反應(yīng)圖

（時(shí)間分辨熒光法）64時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)乙肝ｅ抗原免疫反應(yīng)圖

（時(shí)間分辨熒光法）20時(shí)間分辨熒光免64乙肝ｅ抗體免疫反應(yīng)圖

（時(shí)間分辨熒光法）65時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)乙肝ｅ抗體免疫反應(yīng)圖

（時(shí)間分辨熒光法）21時(shí)間分辨熒光免疫65乙肝核心抗體免疫反應(yīng)圖

（時(shí)間分辨熒光法）66時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)乙肝核心抗體免疫反應(yīng)圖66時(shí)間分辨熒光免疫的試劑種類甲狀腺功能檢測TSH，UltraTSH，T3，T4，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4，TBG，TG性激素類檢測FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG腫瘤標(biāo)記檢測AFP，CEA，PSA，hTG，β-2Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total），PSAEQM，CA-50，CA-125，CA-199遺傳科檢查產(chǎn)前篩查： hAFP/HCG，PAPPA新生兒篩查： Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OHProg，PKU傳染病檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb血液科檢測貧血檢查： Ferritin，VitB12，F(xiàn)olicacid科研工具單標(biāo)記檢測，雙標(biāo)記檢測，三標(biāo)記檢測，四標(biāo)記檢測67時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫的試劑種類甲狀腺功能檢測23時(shí)間分辨熒光免疫67時(shí)間分辨熒光免疫分析與其它

免疫學(xué)方法的比較68時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫分析與其它

免疫學(xué)方法的比較24時(shí)間分辨熒光68標(biāo)記免疫學(xué)發(fā)展歷程酶聯(lián)免疫 （精度：10-9mol/L）放射免疫 （精度：10-12mol/L）化學(xué)發(fā)光（精度：10-15mol/L）電化學(xué)發(fā)光 （精度：10-17mol/L）時(shí)間分辨熒光（精度：10-18mol/L）生物芯片（未知）

酶免疫技術(shù)熒光抗體技術(shù)三大標(biāo)記技術(shù)放射免疫分析69時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)標(biāo)記免疫學(xué)發(fā)展歷程酶聯(lián)免疫 （精度：10-9mol/L69

待測物質(zhì)濃度與檢測手段

臨床化學(xué)分析pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析TherapeuticDrugs(藥物濃度)ThyroidHormone(甲狀腺激素)FertilityHormone(孕激素)CancerMarkers(腫瘤標(biāo)記物)InfectiousDisease(傳染病)Vitamins(維生素)SerumProteins(血清蛋白)10-1210-910-610-310-070時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)待測物質(zhì)濃度與檢測手段臨床化學(xué)分析pg/mLng/mLm70時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)培訓(xùn)課件71放射性免疫分析法（RIA）

---標(biāo)記物：125I應(yīng)用放免自60年代問世以來對(duì)臨床診斷起了革命性的貢獻(xiàn)，是一項(xiàng)較為成熟的診斷技術(shù)。夾心法、競爭法的標(biāo)記原理為以后的檢測技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。缺點(diǎn)放射性（125I），對(duì)環(huán)境的污染及對(duì)身體的危害，已經(jīng)為重視環(huán)保的國家逐步取消。（如整個(gè)歐洲僅尚存幾個(gè)放免試驗(yàn)室）125I的半衰期短而導(dǎo)致其試劑有效期短。標(biāo)記物125I的穩(wěn)定性差，導(dǎo)致試劑盒批間、批內(nèi)的變異較大；標(biāo)準(zhǔn)曲線有效期短，必須每次定標(biāo)，造成浪費(fèi)。操作繁瑣，出報(bào)告時(shí)間長。無法保存?zhèn)溆谩?2時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)放射性免疫分析法（RIA）

---標(biāo)記物：125I應(yīng)用缺點(diǎn)72酶免疫分析法（ELISA）

---標(biāo)記物：HRP(辣根過氧化物酶）應(yīng)用酶免的最大優(yōu)勢在于避免了對(duì)環(huán)境和人體危害。試劑有效期較長。衍生技術(shù)：熒光酶免疫分析增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)磁酶免分析曾經(jīng)一度被認(rèn)為是取代放免的檢測手段。缺點(diǎn)靈敏度、重復(fù)性不及放免，易造成漏檢和假陽性。因酶的純度和反應(yīng)過程容易受環(huán)境因素影響，導(dǎo)致穩(wěn)定性不好。73時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)酶免疫分析法（ELISA）

73化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）

---標(biāo)記物：化學(xué)發(fā)光物質(zhì)（魯米諾）應(yīng)用單個(gè)樣本檢測速度快，適合做急診。靈敏度較高。自動(dòng)化程度高。儀器種類：拜耳—ACS180系列雅培—AXSYM貝克曼—ACCESS德普—IMMULITE缺點(diǎn)樣品不能重復(fù)檢測；出現(xiàn)故障則整批試劑及血樣報(bào)廢。本底較高，易受環(huán)境物質(zhì)干擾。儀器故障率較高。標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性較差，需多次定標(biāo)。檢測精度不高，在超微量分析及早期診斷方面能力不足。非開放性試劑；試劑價(jià)格高。74時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）

---標(biāo)記物：化學(xué)發(fā)光物74電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECL）

---標(biāo)記物：三聯(lián)吡啶釕應(yīng)用80年代末期問世的新型化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。基本原理：根據(jù)三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]和三丙胺在電場觸發(fā)下產(chǎn)生發(fā)光的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。本底較小、靈敏度較高、線性范圍較寬。缺點(diǎn)儀器檢測速度慢（羅氏公司）ECL1010——60測試/小時(shí)ECL2010——90測試/小時(shí)非開放性試劑系統(tǒng)、不能做科研。試劑價(jià)格過高。75時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECL）

---標(biāo)記物：三聯(lián)吡啶釕應(yīng)用75TRFIA在乙肝“兩對(duì)半”定量檢測應(yīng)用76時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)TRFIA在乙肝“兩對(duì)半”定量檢測應(yīng)用32時(shí)間分辨熒光免疫技76一、提高了檢測的靈敏度

時(shí)間分辨熒光法（TRFIA）檢測HBsAg靈敏度可達(dá)到0.2ng/ml，而酶免法（ELISA）檢測HBsAg靈敏度是2ng/ml。

縮短了急性乙肝檢測的“窗口期”二、動(dòng)態(tài)觀察療效和病情檢測

疾病的發(fā)生、發(fā)展、療效、預(yù)后是個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過程，TRFIA定量檢測乙肝“兩對(duì)半”各項(xiàng)標(biāo)志物的濃度變化可對(duì)乙肝的病程、治療、預(yù)后起到動(dòng)態(tài)檢測的作用，指導(dǎo)醫(yī)生治療。77時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)一、提高了檢測的靈敏度二、動(dòng)態(tài)觀察療效和病情檢測33時(shí)間分辨77（1）定量分析HBsAg和HBsAb濃度的變化，可以預(yù)見急性乙肝是否處于恢復(fù)期

如HBsAg濃度降低，HBsAb逐漸升高，說明病情正向恢復(fù)期發(fā)展反之。反之，HBsAg濃度處于高水平或上升，而HBsAb處于低水平，則容易發(fā)展為慢性乙肝或攜帶者。（2）定量分析HBeAg和HBeAb的濃度變化，可以反映病情變化和治療效果。

1、HBeAg向HBeAb轉(zhuǎn)換時(shí)期，即表現(xiàn)為HBeAg濃度下降和HBeAb濃度升高。

2、高濃度的HBeAg提示病毒處于高復(fù)制狀態(tài)，有較強(qiáng)傳染性。

3、高濃度的HBeAb一方面提示病情的好轉(zhuǎn)，但在有些時(shí)候（如肝功能