第章基因工程和基因組學(xué)

第九章基因工程和基因組學(xué)1971年，Smith等人從細(xì)菌中分離出的一種限制性酶，酶切病毒DNA分子，標(biāo)志著DNA重組時代的開始。1972年，Berg等用限制性酶分別酶切猿猴病毒和噬菌體DNA，將兩種DNA分子用連接酶連接起來

得到新的DNA分子。1973年，美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Cohen教授及其同事把抗四環(huán)素基因插入大腸桿菌質(zhì)粒DNA后，組成一個重組DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一個重組DNA能在大腸桿菌中復(fù)制,并具有抗四環(huán)素遺傳表型。StanleyN.Cohen1974年,Cohen教授和加州大學(xué)的Boyer教授，將非洲蟾蜍的rRNA結(jié)構(gòu)基因插入大腸桿菌質(zhì)粒DNA，再轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非洲蟾蜍的rRNA結(jié)構(gòu)基因得到表達(dá)。上述實驗說明，經(jīng)DNA重組后的外源基因可在宿主體內(nèi)成功表達(dá)。HerbertW.Boyer1982年，美國食品衛(wèi)生和醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)，用基因工程在細(xì)菌中生產(chǎn)人的胰島素投放市場。1985年，轉(zhuǎn)基因植物獲得成功。1994年，延熟保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄商品生產(chǎn)。1996年，克隆羊誕生。以轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米、油菜為代表的轉(zhuǎn)基因作物種植面積由1996年的2550萬畝發(fā)展到2009年的20億畝，14年間增長了79倍。19961997199819992000200120022006200720082009廣義遺傳工程包括:生化工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程、染色體工程、細(xì)胞器工程、基因工程及酶工程等。狹義遺傳工程是指:基因工程(重組DNA技術(shù))。

一、基因工程概述:第一節(jié)基因工程１.概念：基因工程：在分子水平上，采取工程建設(shè)方式,按照預(yù)先設(shè)計的藍(lán)圖，借助于實驗室技術(shù)將某種生物的基因或基因組轉(zhuǎn)移到另一種生物中去，使后者定向獲得新遺傳性狀的一門技術(shù)?；蚬こ碳夹g(shù)的建立，使所有實驗生物學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的變革?；蚬こ淌遣捎梅肿由飳W(xué)、核酸生物化學(xué)以及微生物遺傳學(xué)的現(xiàn)代方法和手段建立起來的綜合技術(shù)。

切接轉(zhuǎn)增檢2．基因工程操作過程：3．內(nèi)容：①從細(xì)胞和組織中分離DNA；②限制性內(nèi)切酶酶切DNA分子，制備DNA片段；③

將酶切DNA分子與載體DNA連接構(gòu)建能在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制的重組DNA分子；④

把重組DNA分子引入宿主受體細(xì)胞復(fù)制；⑤

重組DNA隨宿主細(xì)胞的分裂而分配到子細(xì)胞建立無性繁殖系(Clone)或發(fā)育成個體；⑥

從宿主細(xì)胞中回收、純化和分析克隆的重組DNA分子；⑦

使外源基因在受體細(xì)胞中正常表達(dá)，翻譯成蛋白質(zhì)并分離、鑒定基因產(chǎn)物。目的基因載體轉(zhuǎn)化與鑒定內(nèi)切酶重組DNA表達(dá)一般般而而言言，，一一個個基基因因是編編碼碼一一條條多多肽肽鏈鏈的的一個個DNA片段段，，包包括括啟啟動動子子、、終終止止子子及及內(nèi)內(nèi)含含子子等等。。在DNA重組組技技術(shù)術(shù)出出現(xiàn)現(xiàn)之之前前，由由于于DNA分子子量量大大而而結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)單單一一，，DNA是細(xì)細(xì)胞胞中中最最難難分分析析的的大大分分子子。。DNA重組組技技術(shù)術(shù)發(fā)發(fā)展展成成功功之后后，DNA已成成為為細(xì)細(xì)胞胞中中最易易操操作作分分析析的的大大分分子子。。二、、基基因因的的分分離離與與鑒鑒定定利用用這這一一技技術(shù)術(shù)，，可可從從一一個個含含有有10萬個個基基因因的的大大基基因因組組中中，，準(zhǔn)確確地地分分離離出出特異異的的單個個目目的的基基因因。㈠從基基因因庫庫中中分分離離基基因因：：1.構(gòu)建建基基因因庫庫（（library）基因因庫庫是一一組組DNA和cDNA序列列克克隆隆的的集集合合體體。。根據(jù)據(jù)克克隆隆核核酸酸序序列列、、來來源源，，基因因庫庫可可分分為為：：核基基因因庫庫、染色色體體庫庫、、cDNA庫、線粒粒體體庫庫等。。①核基基因因庫庫：：核基基因因庫庫(genomiclibrary)：將某生生物物全全部部基因因組組DNA酶切切后后與與載載體體連連接接構(gòu)構(gòu)建建而而成成的的。。理理想的的核核基基因因庫庫應(yīng)應(yīng)能能包包括括全全部部基基因因組組序序列列。。構(gòu)建建文文庫庫可可采采用用不不同同的的載載體體：：質(zhì)粒粒載載體體：：重組組質(zhì)質(zhì)粒粒導(dǎo)導(dǎo)入入感感受受態(tài)態(tài)細(xì)細(xì)胞胞，，收收集集所所有菌菌落落。。噬菌菌體體或或(柯斯斯質(zhì)質(zhì)粒粒)載體體：：重組組DNA包裝裝進(jìn)進(jìn)噬噬菌體體，，感感染染細(xì)細(xì)菌菌，，收收集集噬噬菌菌斑斑。。BAC(細(xì)菌菌人人工工染染色色體體)或YAC(酵母母人人工工染染色色體體)載體體：：重組組人人工工染染色色體體，，導(dǎo)導(dǎo)入入相相應(yīng)應(yīng)宿宿主主細(xì)細(xì)胞胞，，收集集所所有有細(xì)細(xì)胞胞，，即即為為基基因因庫庫。。②染色色體體基基因因庫庫：：將基基因因組組的的一部部分分如如一一條條染染色色體體用來來構(gòu)構(gòu)建基基因因庫庫可選擇擇特異異基基因因以以及及分分析析染染色色體體結(jié)構(gòu)構(gòu)和和組組織織。。果蠅蠅的的多多線線染染色色體體中中，對染染色色體體進(jìn)進(jìn)行行微切切割割，，構(gòu)建建染染色色體體區(qū)區(qū)段段基基因因文文庫庫。。如如對對X染色色體體上上多多線線染色色體體帶帶的的分分析析。。人類類基基因因組組項項目目研研究究中中，，利用用流動動細(xì)細(xì)胞胞分分離離(flowcytometry)技術(shù)術(shù)將將人人類類染染色體體分分開開，，用用于于構(gòu)建建單單個染染色色體體基基因因庫庫，，大大大加速速了了人人類類基基因因組組作作圖圖和分分析析。。流式式細(xì)細(xì)胞胞分分離離原原理理酵母母菌菌：：利用用改改良良的的脈沖沖電電泳泳方方法法(pulsedfieldgelelectro––phoresis,PFGE)，將將酵酵母母菌菌16根染染色色體體據(jù)其其分分子子量量大小小分分開開后，，用用于于構(gòu)構(gòu)建建染染色色體體庫庫，，在在基基因因組組分分析析中中發(fā)揮揮作作用用。。③cDNA庫：：以mRNA為模模板板經(jīng)反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶合合成成互互補補DNA構(gòu)建建基因因庫庫。。真核核生生物物mRNA的3’’端具具有有一一段段多多聚聚A尾端端序序列列,利用用一一段段多多聚聚T為引引物物與與多聚聚A互補補配配對對，，在在反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶的的作作用用下下，，即即可可獲獲得得cDNA第一一鏈鏈。。真核核生生物物mRNA的3’’端具具有有一一段段多多聚聚A尾端端序序列列得到到的的雙雙鏈鏈DNA分子子經(jīng)經(jīng)兩端端補補齊齊后后以帶帶有有限限制制性性酶酶切切點點的的人人工工接接頭頭連連接接酶切切后后與與載載體體(通常常是是噬噬菌菌體體)連接接制備備cDNA庫。。mRNA1.cDNA第一一鏈鏈的的合合成成5‘ppp’5G

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AAAAAAAAAAAAAAOH3’5‘ppp’5G

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AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’’cDNA第一一鏈鏈引物物退火火逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶dNTPs2.cDNA第二二鏈鏈的的合合成成煮沸沸NaOH自身身引引導(dǎo)導(dǎo)法法：：獲獲得得的的雙雙鏈鏈cDNA5’’端端會會有有幾幾對對堿堿基基缺缺失失5‘ppp’5G

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AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAOH3’AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTOH3’’KlenowdNTPsS1TTTTTTTTTTTTTTp5’DNApoldNTPsRNaesH置換換合合成成法法：：獲獲得得的的雙雙鏈鏈cDNA5’’端端也也會會有有幾幾對對堿堿基基缺缺失失5‘ppp’5G

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AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’’S15’AAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’T4-DNAligase5’AAAAAAAAAAAAAAp3’TTTTTTTTTTTTTTOH5’5’AAAAAAAAAAAAAA3’TTTTTTTTTTTTTT5’dCTPTdT引導(dǎo)導(dǎo)合合成成法法：：獲獲得得的的雙雙鏈鏈cDNA能保留完完整的5’端序序列5‘ppp’5G

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AAAAAOH3’TTTTTp5’3‘HO5‘ppp’5G

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AAAAAOH3’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGG3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGGAAAAAOH3’NaOH退火KlenowdNTPscDNA庫與核DNA庫不同：：cDNA庫僅具有有細(xì)胞或或組織內(nèi)內(nèi)表達(dá)基基因的mRNA序列僅包括基基因組的的部分基因因序列。。cDNA庫對于研研究基因因的表達(dá)模式式、分離離某一特特定基因因是十分有用用的。通常是將將cDNA庫與核基基因庫配配合使用用，以便既能得到到基因的的編碼序序列，又又可得到到基因的的調(diào)控序列。。2.篩選基因因庫：根據(jù)待選選基因相相關(guān)信息息確定篩選選方法和和條件從基因庫庫中篩選選、分離離基因；；常用的基基因庫篩篩選方法法有表型型篩選法法、雜交交篩選法法、混合合池PCR篩選法、、差減雜雜交法、、圖位克克隆法、、酵母雙雙雜交法法等；多數(shù)方法法是利用一一段核苷苷酸序列列(DNA、cDNA或寡聚核苷苷酸)或抗體作探針(Probe)，用放射射性同位素或非非放射性性同位素素標(biāo)記探針針篩選基因庫。。密集鋪板板（1-10萬萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組組克隆文庫篩選選流程篩庫過程程：將轉(zhuǎn)化或或轉(zhuǎn)染后后菌落印印影在濾濾膜上用堿裂解解、中和和后洗滌滌烘干再用目的的基因的的放射性性DNA或mRNA作探針進(jìn)進(jìn)行雜交交放射性性自顯影影凡黑點菌落落即為陽陽性克隆隆。影印洗滌雜交感光①.限制性酶酶圖譜：：構(gòu)建陽性克隆隆的限制性性酶圖譜譜根據(jù)同源源性分析析，可了了解陽性性克隆片片段的酶切位點點及相對對位置用于進(jìn)一一步亞克隆或或同已知的的其它序列比較較。(二)陽性克隆隆的分析析與鑒定定：從基因庫庫中篩選選出的陽陽性克隆隆分析、鑒鑒定得到目的的基因。。限制性酶酶圖譜構(gòu)構(gòu)建方法法(15kb)將陽性克克隆DNA分裝3個管中酶切DNA瓊脂糖凝凝膠電泳泳溴化乙錠錠染色紫外燈下下見到DNA帶。從凝膠電電泳結(jié)果果分析：：模式Ⅱ就是這個個15kbDNA片段用上上述兩種酶酶酶切后后的限制性酶酶圖譜。用類似的的方法，，將不同同DNA用限制性性酶消化化，根據(jù)據(jù)其產(chǎn)生的多多型性，，即限制性性酶片段段長度的的多型性性來分析DNA水平的變變異程度度，以RFLP作為分子子標(biāo)記進(jìn)進(jìn)行基因因組圖譜譜分析。。②.核酸分子子雜交：：Southern雜交分析析：由英國的的Southern發(fā)明(1975)，一種將瓊脂糖糖中的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜進(jìn)行DNA分子雜交交分析的方方法。篩選基因因庫得到到陽性克隆隆后將限制性性酶酶切切與Southern雜交結(jié)合合繪制限制制性酶圖圖譜。Northern雜交分析析：用于分析析克隆的的基因在在某一細(xì)細(xì)胞或組組織的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄水平平，檢測mRNA的存在。原理和程程序與Sorthern雜交相同同。Western雜交分析：用于蛋白質(zhì)的分析。③.核酸序列列測定克隆后的的DNA片段進(jìn)行行核酸序序列測定定后確定該DNA片段序列列的正確確性。一般采用用Sanger(1977)發(fā)明的雙脫氧核糖核核酸終止止法測定核酸酸序列。。CGCTCAGCTGGTGATTGTGT55333-5磷酸二酯酯鍵在Sanger雙脫氧法法中，可可用熒光光標(biāo)記來來代替放放射性標(biāo)標(biāo)記：④.核酸序列列分析：：測定的核核酸序列列為何基基因、有有什么功功能，需需用計算機機軟件或或生物學(xué)學(xué)實驗進(jìn)進(jìn)一步分分析。（1）同源性性比較將待測序序列在核核酸和蛋蛋白質(zhì)兩兩個水平平上比較基因間的同同源性，將序列發(fā)發(fā)送到Genbank等DNAData數(shù)據(jù)庫進(jìn)進(jìn)行比較較。對于那些些同已知知序列無無任何同同源性的的新序列，可能能還要進(jìn)進(jìn)行基因因功能性性研究。。一個ORF是一條能能編碼一一條多肽肽鏈的DNA序列，具具有翻譯譯起始信信號和終終止信號號等。（2）分析核核酸序列列的閱讀框架架GmMYBZ2ORF：744bp247aaMYB-DNAbinding1:13-63aaMYB-DNAbinding2:65-114aa具有轉(zhuǎn)錄抑制作用的保守基序：pdLNLD/ELXiG/S

GmMYBZ2空間結(jié)構(gòu)構(gòu)預(yù)測（（CHPmodels-2.0服務(wù)器）GmMYBZ2蛋白的三三維空間間結(jié)構(gòu)預(yù)預(yù)測紅色：a-螺旋；藍(lán)藍(lán)色：b-折疊；白白色：無無規(guī)卷曲曲（三）PCR擴增基因因：聚合酶鏈鏈?zhǔn)椒磻?yīng)應(yīng)(polymerasechainReaction,PCR)可以體外外快速擴擴增DNA。美國Mullis(1986)發(fā)明，是現(xiàn)代生生物學(xué)發(fā)發(fā)展史上上的一個個里程碑。PCR技技術(shù)是以以DNA互補鏈鏈的聚合合反應(yīng)為為基礎(chǔ)，，通過DNA變性性、引物物與模板板DNA一側(cè)的的互補序序列復(fù)性雜雜交，由由DNA聚合酶酶催化引引物延伸伸，最終獲得特特異DNA片段段的體外外擴增方方法。DNA模板變性退火延伸循環(huán)1變性退火延伸循環(huán)2RF1324變性退火延伸循環(huán)31234基本要素素模板：待拷貝的的DNA,可以是雙雙鏈,也可是單單鏈DNA；引物：引導(dǎo)DNA的合成。。在PCR擴增中一一般使用用合成的的寡核苷苷酸作引引物；DNA聚合酶：：DNA復(fù)制的動動力，在在dNTP等底物存存在時在在引物的的引導(dǎo)下下沿著模模板DNA合成互補補的DNA鏈。dNTP：DNA合成的底底物。使用PCR法克克隆目的的基因的的前提條條件是：：已知待擴擴增目的的基因或或DNA片段兩兩側(cè)的序序列，根根據(jù)該序序列化學(xué)學(xué)合成聚聚合反應(yīng)應(yīng)必需的的雙引物物。（四）人人工合成成基因：：根據(jù)已知知的基因因或氨基基酸序列列，將化學(xué)合合成寡核苷酸酸的方法法與酶促合成成DNA的方法結(jié)結(jié)合起來可很快地地人工合合成基因因。如SOE-PCR(splicingbyusingoverlappedextension)技術(shù)可擴增出出完整的的基因序序列?；瘜W(xué)合成成的寡聚聚核苷酸酸(80-100個核苷酸酸)通過SOE將單鏈部部分補齊齊；2.PCR擴增DNA片段；3.DNA變性；4.兩個單鏈鏈部分經(jīng)經(jīng)SOE補齊雙鏈；5.PCR擴增DNA，利用多多級SOE-PCR擴增出完完整的基因。1.限制性內(nèi)內(nèi)切酶(restrictionenzyme)：一類能識別雙鏈DNA分子中一一段特定定的核苷苷酸序列列，并由由此切割割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)構(gòu)的核酸酸內(nèi)切酶酶。三、限制制性內(nèi)切切核酸酶酶2.限制性內(nèi)內(nèi)切酶的的命名：：用屬名的的第一個個字母和和種名的的前兩個個字母，，組成3個字母的的略語表表示寄主主菌的物物種名稱稱;如：大腸腸桿菌(Escherichiacoli)用Eco表示；流流感嗜血血菌(Haemophilusinfluenzae)用Hin表示。用一個寫寫在右下下方的字字母代表表菌株或或類型；；如EcoK，Hind。用羅馬數(shù)數(shù)字表示示不同的的限制和和修飾體體系，如如：HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ等。3.限制性內(nèi)內(nèi)切酶的的類別：：第Ⅰ類酶:每隔一段段DNA序列隨機機切割雙雙鏈DNA分子，，沒有有序列列特異異性,酶切位位點不不定。。第Ⅱ類酶:能識別別一段段特異異的DNA序列，，準(zhǔn)確確地酶酶切雙雙鏈DNA的特異異序列列。第Ⅲ類酶:能識別別位點點分別別是AGACC和CAGCAG,切割位位點則則在下下游24-26bp處。4.第Ⅱ類核酸酸內(nèi)切切酶特特性：：在DNA分子雙雙鏈的的特異異性識識別序序列部部位，，切割割DNA分子產(chǎn)產(chǎn)生鏈鏈的斷斷裂；；靶序列列：具具有雙雙重旋旋轉(zhuǎn)對對稱結(jié)結(jié)構(gòu)的的回文文序列列；ABCC′B′A′ABCC′B′A′ABNB′ABN′B′A′A′回文序序列(palindrome)：從兩個方方向閱閱讀而而序列相相同的的序列。。對靶序序列的的切割割：(1)產(chǎn)生平末端端(bluntend)的切割割如SmaⅠ：兩條鏈鏈上的的斷裂裂位置置處于于一個個對稱稱結(jié)構(gòu)構(gòu)的中中心。。(2)產(chǎn)生粘性末末端(stickyend)的切割割兩條鏈鏈上的的斷裂裂位置置是交交錯的的、但但又是是對稱稱地圍繞一一個對對稱軸軸排列列。如EcoRⅠⅠ：粘性末末端:DNA分子在在限制制性內(nèi)內(nèi)切酶酶的作作用之之下形成的的具有有互補補堿基基的單單鏈延延伸末末端結(jié)結(jié)構(gòu)。。同裂酶酶:來源不不同但可識識別相相同核核苷酸酸靶序序列，，產(chǎn)生生同樣樣的切切割并并形成成同樣樣末端端的限限制酶酶。如如HpaⅡ和MspⅠ均可識識別CCGG。同尾酶:來源不同，，識別的靶序序列也各不不相同，但但都能產(chǎn)生生同樣粘性性末端的限限制酶。BamHⅠⅠGGATCCBclⅠTGATCA載體：將“目的””基因?qū)肴胧荏w細(xì)胞胞的運載工工具。DNA片段與適合合的載體DNA連接構(gòu)成重重組DNA在載體DNA的運載下，，高效率地地進(jìn)入宿主主細(xì)胞，并并在其中進(jìn)行行復(fù)制。DNA載體：質(zhì)粒、噬噬菌體DNA、病毒DNA、細(xì)菌或酵酵母菌人工工染色體等等。四、載體（（vector）：載體的條件件：①具有復(fù)制原原點，能自我復(fù)制；②具有多克隆位點點(multiplecloningsite，MCS)即有多種限限制酶的切點點；③具有選擇標(biāo)記基因，如抗生素基因因；④易從宿主細(xì)胞胞中回收。（一）細(xì)細(xì)菌質(zhì)粒：：質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞胞內(nèi)獨立于于細(xì)菌染色色體而自然然存在的、能自自我復(fù)制、、易分離和和導(dǎo)入的環(huán)環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒具有重組表型檢檢測標(biāo)記，檢測是否否攜帶外源DNA片段。在細(xì)胞內(nèi)的的復(fù)制程度度：嚴(yán)緊型：一個細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒數(shù)量有1-2個；

松馳型：每個細(xì)胞內(nèi)有的20-60個。pUC18質(zhì)粒具有以以下特點：：③多克隆位點點中的酶切切位點多，克隆方便；；④具有a－互補的顯色表型，用于檢測重重組質(zhì)粒的的選擇標(biāo)記。①分子量小，可接受較較大外源片段(10Kb)；②拷貝數(shù)多，每個細(xì)胞中中有500個；a-互補：指來自細(xì)菌菌DNA的b-半乳糖苷酶酶(lacZ)N端的一段氨氨基酸殘基基(a-肽)，在與a-肽缺失的b-半乳糖苷酶酶混合后，，能夠回復(fù)lacZ酶活性的一一種基因內(nèi)內(nèi)互補現(xiàn)象象?；蚪M全長長49kb。噬菌體DNA中間約2/3的序列為中中間基因簇簇，位于兩兩端的為DNA左、右臂。。中間基因簇簇可被外源DNA替代而不影影響浸染細(xì)細(xì)菌的能力力。能接受15-23kb外源DNA片段，可以以作為cDNA或核DNA克隆的載體體。（二）λ噬菌體(溫和型)：優(yōu)點：2.不易引起生生物危害，，有助于“目目的”基因進(jìn)入細(xì)胞胞并增殖；1.攜帶大片段外源DNA分子，可占占用總量的的25%時仍不失活活。（三）柯斯斯質(zhì)粒(cosmid)：部分λ噬菌體DNA+部分細(xì)菌質(zhì)粒DNA序列組建柯斯質(zhì)粒。。帶有噬菌體體cos序列和細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制制原點、抗抗生素抗性標(biāo)記記。這種質(zhì)粒分分子量較小小，但可接接受長達(dá)50kb的外源DNA片段，在克克隆真核生物基因中中十分有用?！咭粋€長片段段DNA可能具有真真核生物基基因的編碼碼序列及其它它調(diào)控序列列。（四）細(xì)菌菌人工染色色體(bacterialartificialchromosome,BAC)BAC載體可以攜帶大于50kb的外源DNA片段。特點：帶有外源DNA的BAC載體在細(xì)胞中是單拷貝的；；載體本身分子量很小小(7.4kb)；選擇標(biāo)記：：氯霉素抗性性基因；多克隆位點點位于lacZ基因內(nèi)。F因子經(jīng)基因因工程改造造成BAC載體，可用用于克隆100kb以上的DNA片段。（五）酵酵母人工染染色體(YAC)：YAC具有自主復(fù)復(fù)制序列、、克隆位點點和可在細(xì)細(xì)菌和酵母母菌中選擇擇的標(biāo)記基基因；還具具有酵母菌菌染色體一一些特點；；可接受100-1000kb的外源DNA片段。YAC已成為人類類基因組計計劃和圖位位克隆基因因的重要工工具；并促進(jìn)了人類人工染染色體(humanartificialchromosome，HAC)的研究。1996年完成了酵酵母菌全基基因組序列列的測定指能在兩種不同的生物中復(fù)復(fù)制的載體體。如能在原核生物（如E.coli）、真核細(xì)胞（如酵母）中復(fù)復(fù)制的載體體。穿梭載體需需同時具有細(xì)菌質(zhì)粒的的復(fù)制原點點、真核生物自主主復(fù)制序列列(Auto-nomouslyreplicatingsequence,ARS)以及兩者的的選擇標(biāo)記記。（六）穿梭梭載體(shuttlevectors):穿梭載體在細(xì)菌中用于克隆隆、擴增基基因，在酵母菌中中用于基因表表達(dá)分析。。酵母菌的YEp(yeastepisomaplasmid)和YRp系列載體均是穿梭載載體。穿梭質(zhì)粒YEp24

pCAMBIA2301載體（七）Ti質(zhì)粒及其衍衍生載體：：適合于植物的載體系統(tǒng)統(tǒng)將重組DNA運載到植物物細(xì)胞并使使目的基因因表達(dá)。Ti質(zhì)粒是一種細(xì)菌菌質(zhì)粒，它它自然存在在于土壤農(nóng)桿菌菌(革蘭氏陰性性菌)(Agrobacteriumtumefaciens)細(xì)胞中可誘導(dǎo)植物物產(chǎn)生瘤細(xì)細(xì)胞(tumor-InducingTi)冠癭瘤(growngalltumors)。Ti質(zhì)粒一部分分DNA叫轉(zhuǎn)移DNA(transferDNA，T-DNA)，當(dāng)農(nóng)桿菌感染植物物時，T-DNA便轉(zhuǎn)移到植物的染染色體上，，誘導(dǎo)冠癭癭瘤，并能合成成冠癭堿(opine),作為農(nóng)桿菌的的碳源和氮氮源。農(nóng)桿菌感染染產(chǎn)生冠纓纓瘤目前，基因工程研研究發(fā)展迅迅速，已取得一一系列重大突破破?；蚬すこ碳夹g(shù)已已廣泛用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)業(yè)、醫(yī)學(xué)、、法學(xué)等領(lǐng)領(lǐng)域，為人人類創(chuàng)造了了巨大的財富富。五、基因工工程的應(yīng)用用具有生長激激素的轉(zhuǎn)基基因鼠㈠基因工程工工業(yè)最早應(yīng)用基基因工程生生產(chǎn)人的蛋蛋白質(zhì)的方方法是在細(xì)菌中表達(dá)達(dá)人的胰島島素(1982)。胰島素是一一種控制糖糖代謝的蛋蛋白質(zhì)激素素。不能產(chǎn)生胰島素素的患者會會有糖尿病病，患者必必須每天注注射胰島素。現(xiàn)已在細(xì)菌菌中生產(chǎn)10多種醫(yī)藥產(chǎn)品，，如表皮生長因子、人人生長激素素因子、干干擾素、乙乙型肝炎工工程疫苗等。胰島素的人人工生產(chǎn)有些真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)需需要糖基化等修修飾加工以后才具有有活性，而而細(xì)菌細(xì)胞胞缺少真核核細(xì)胞的這這些修飾系系統(tǒng)真核生物細(xì)細(xì)胞更適合合于表達(dá)真真核生物蛋蛋白質(zhì)基因因。目前，酵母菌、植植物懸浮細(xì)細(xì)胞、植株株和動物培培養(yǎng)細(xì)胞成功地均應(yīng)應(yīng)用于表達(dá)外源蛋白。?；蚬こ虘?yīng)應(yīng)用大腸桿桿菌生產(chǎn)人人類生長激激素（二）植物物基因工程程植物基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化是指將外源源基因轉(zhuǎn)移移到植物細(xì)細(xì)胞被內(nèi)、、并整合到到植物基因因組中穩(wěn)定定遺傳和表表達(dá)的過程程?；蜣D(zhuǎn)化的的方法和技術(shù)術(shù)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化化法和基因槍轉(zhuǎn)化化法應(yīng)用最多。。1.根癌農(nóng)桿菌菌轉(zhuǎn)化技術(shù)術(shù)：根癌農(nóng)桿菌菌介導(dǎo)的植物物轉(zhuǎn)化是應(yīng)應(yīng)用的最早早最廣泛的植物轉(zhuǎn)化化方法（雙雙子葉植物物、單子葉葉植物）。。過程：將目的基因因與啟動子子（花椰菜菜病毒35S）及終止子子組成嵌合合DNA分子；插入到Ti衍生質(zhì)粒RB與LB內(nèi)構(gòu)成重組質(zhì)粒；再轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌細(xì)胞；將重組農(nóng)桿桿菌去感染植物細(xì)胞（（組織）；使Ti質(zhì)粒的部分分DNA（攜帶目的的基因），，整合到植植物染色體體，實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。。利用從抗草甘磷(glyphosate)E.coli中分離克隆隆的5-烯醇丙酮酸酸莽草酸-3-磷酸合酶（（EPSP合成酶）基基因，已培培育出高抗抗除草劑轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因植物物。基因槍法植植物轉(zhuǎn)化是是通過高壓壓氣體為動動力，高速發(fā)射包裹有重組組DNA的金屬顆粒粒將目的基因因直接導(dǎo)入植植物細(xì)胞，，并整合到到染色體上上的方法。。2.基因槍轉(zhuǎn)化化技術(shù)：轉(zhuǎn)化的載體體多數(shù)是以以pUC系列質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建建的。它們通通常具有細(xì)菌復(fù)制原原點及抗性選擇標(biāo)標(biāo)記，具有可在植植物中表達(dá)達(dá)的啟動子子終止子及及調(diào)控序列列，以及植物抗抗性選擇標(biāo)標(biāo)記(如除草劑、、潮霉素等等抗性)。幾種基因槍槍類型的共同特點：：是用一種動動力系統(tǒng)將包被DNA的金屬微粒粒導(dǎo)入受體體細(xì)胞或組組織進(jìn)行轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化。1.位于高壓氣氣體桶底部部的爆破片；2.載有重組DNA和金屬微粒粒的微彈載體；3.阻攔網(wǎng)；4.包裹有重組組DNA的金屬微粒；5.被轟擊樣品。㈢轉(zhuǎn)基因動物物:與轉(zhuǎn)基因植植物相比，，轉(zhuǎn)基因動動物的發(fā)展展要慢些。。這主要涉及及到一些技技術(shù)難題，，以及倫理理學(xué)、宗教教等問題。。轉(zhuǎn)基因動物物：將外源重組組基因轉(zhuǎn)染染并整合到到動物受體體細(xì)胞基因因組中，從從而形成在在體表達(dá)外外源基因的的動物，稱稱為轉(zhuǎn)基因因動物。轉(zhuǎn)基因動動物是如如何獲得得的呢？？受體細(xì)胞的準(zhǔn)備受精卵：：注射促促性腺激激素，使使動物超超數(shù)排卵卵，從而而收集、、獲得合合適的受受精卵；；胚胎干細(xì)細(xì)胞：從從早期胚胚胎（原原腸胚期期之前））或原始始性腺中中分離獲獲得具有有正常二二倍體染染色體和和發(fā)育全全能性的的細(xì)胞。?；虻臏?zhǔn)備線形DNA或環(huán)形DNA均可，但但線形DNA整合率要要高于環(huán)環(huán)形DNA；環(huán)形DNA在細(xì)胞內(nèi)內(nèi)的半衰衰期較長長，使用用于瞬時時表達(dá)和和基因治治療?；虻霓D(zhuǎn)化利用顯微微注射法法、電擊擊法、脂脂質(zhì)體介介導(dǎo)等方方法將目目的基因因轉(zhuǎn)入受受體細(xì)胞胞中；通過篩選選基因篩篩選陽性性轉(zhuǎn)化子子；陽性轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)將陽性轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入合適適的培養(yǎng)養(yǎng)基中，，培養(yǎng)至至囊胚期期；胚胎移植胚胎移植植：將供供體的受受精卵或或早期胚胚胎，移移植到同同種的生生理狀態(tài)態(tài)相同的的其他受受體體內(nèi)內(nèi)，使之之繼續(xù)發(fā)發(fā)育成為為新個體體的技術(shù)術(shù)，也稱稱作借腹腹懷胎。。轉(zhuǎn)基因個體的鑒定對代孕母母獸產(chǎn)下下的幼獸獸進(jìn)行相相關(guān)分子子鑒定，，首先，，檢測目目的基因因是否整整合到了了受體的的基因組組中；其其次，檢檢測目的的基因是是否表達(dá)達(dá)；最后后進(jìn)行表表達(dá)產(chǎn)物的分離離純化及及生物活活性檢測測。卵細(xì)胞的的獲得費費時費力力；很多人認(rèn)認(rèn)為，從從胚胎中中收集胚胚胎干細(xì)細(xì)胞是不不道德的的，因為為動物的的生命沒沒有得到到珍重，，動物的的胚胎也也是生命命的一種種形式，，無論目目的如何何高尚，，破壞胚胚胎是不不可想象象的；動物的體體細(xì)胞是是否可以以作為轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因的的受體細(xì)細(xì)胞呢？？生物學(xué)家家一度認(rèn)認(rèn)為，由由一個成成熟的動動物細(xì)胞胞“無性繁繁殖”成一個子子體是不不可能的的。1997年，克隆隆羊“多多莉”的的誕生，，徹底打打破了這這種不可可能性，，并立即即引起世世界的震震驚和媒媒體的關(guān)關(guān)注?？寺⊙颉啊岸嗬颉薄钡恼Q生生300個277個29個1只乳汁中含含有α抗胰蛋白白酶轉(zhuǎn)基基因羊各種克隆隆動物相相繼誕生生1997年，夏夏威夷科科學(xué)家從從成年小小老鼠的的細(xì)胞復(fù)復(fù)制出第第一只克克隆小老老鼠，名名叫Cumulina。Cumulina兩歲歲零七個個月死亡亡,這是一個個比較正正常的死死亡年齡齡，比普普通老鼠鼠的平均均壽命長長7個月月。它曾曾經(jīng)生產(chǎn)產(chǎn)了兩次次。1998年日本科科學(xué)家用用子宮和和輸卵管管細(xì)胞成成功克隆隆牛,首兩頭克克隆牛分分別名為為“KAGA一號”和和“NOTO一號”之后，日日本復(fù)制制出了數(shù)數(shù)千克隆隆牛。出出生于一一九九八八年八月月的克隆隆?！癒AGA二號””產(chǎn)下了了小牛。世界上第第一批三三只克隆隆山羊已已由美國國一家生生物公司司于1998年“制造造”出來來。克隆山羊羊Mira和她她的姐妹們都來來自美國國的實驗驗室，它們生產(chǎn)產(chǎn)含有人人類抗凝凝血酶-3的羊羊奶?？箍鼓该?3是是血液天天然含有有的蛋白白質(zhì)，其其功能是是協(xié)助控控制血凝凝。2000年，科科學(xué)家從從兩頭分分別死亡亡將近18小時時和24小時的的雌盤羊羊卵巢內(nèi)內(nèi)取出DNA，，將其注注入盤羊羊的“近近親”―――普通通白羊的的卵細(xì)胞胞內(nèi)，克隆出了了一只摩摩弗倫羊羊（又稱稱歐洲盤盤羊）。。這是世界界上首次次把克隆隆技術(shù)應(yīng)應(yīng)用于一一種瀕臨臨滅絕的的哺乳類類動物身身上。2003年5月29日，一頭頭名叫““愛達(dá)荷荷寶石””的克隆隆騾子在美國愛愛達(dá)荷大大學(xué)（UniversityofIdaho）與公眾眾見面2005年韓國科科學(xué)家培培育出世界首只克隆狗狗“斯納納皮(Snuppy)”2005年10月意大利利著名的的克雷莫莫納繁殖殖技術(shù)研研究中心心成功地克克隆出了了14只小豬仔仔2006年11月美國維維亞金公公司宣布布成功克克隆出純純種賽馬馬“克萊萊頓”我國體細(xì)細(xì)胞克隆隆牛"康康"，在萊陽陽農(nóng)學(xué)院院動物胚胚胎工程程中心西北農(nóng)林林科技大大學(xué)克克隆山羊羊山東曹縣縣五里墩墩中大動動物胚胎胎工程中中心人類生長長激素轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因豬豬同胞鼠對對照轉(zhuǎn)移有人人類生長長激素轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因鼠鼠轉(zhuǎn)基因熒熒光豬㈣遺傳疾病病診斷：：利用重組組DNA技術(shù)進(jìn)行行遺傳疾疾病診斷斷，是直接從從DNA即基因水水平進(jìn)行行診斷準(zhǔn)確度高高，速度度快。進(jìn)行產(chǎn)前診斷斷，分析胎兒兒是否有有遺傳疾疾病。b-球蛋白基因MstⅡ酶切結(jié)果㈤基因治療療：利用基因因工程技技術(shù)，將將特異基基因?qū)肴氩⒄虾系接羞z傳缺缺陷患者者的基因因組中治療遺傳傳疾病，，通常叫做基因治療療(genetherapy)。方法：利用減毒毒的病毒毒DNA作載體(retrovirusDNA)構(gòu)建重組組DNA分子用病毒包包裝物包包裝后形成的減減毒病毒毒感染患患者的細(xì)細(xì)胞將正?；蛘系饺旧w上。。例如，用漠洛尼尼氏鼠白白血病病病毒(MLV)改造而成成的retrovirus載體，已已用于治治療嚴(yán)重重綜合免疫疫缺陷(SCID)。SCID是由于腺腺苷脫氫氫酶基因因(adenosinedeaminase，ADA)突變引起的，，患者無無任何免免疫功能能。2000年法國Fischer用該方法法治愈患患有SCID遺傳病的的兩個嬰嬰兒（8個月和11個月）。。這一工工作被認(rèn)認(rèn)為是20世紀(jì)人類類基因治治療上的的重大突突破。方法：將ADA基因?qū)肴氲組LVretrovirus載體中取代該病毒DNA中的三個結(jié)構(gòu)構(gòu)基因(gag、pol、env)將重組后后的病毒毒去感染染T細(xì)胞，使ADA基因整合合到T細(xì)胞的染色體中中實現(xiàn)基因因治療的的目的。核酸分子子雜交的的原理和和方法+半導(dǎo)體技技術(shù)結(jié)合合發(fā)展形成成的一門門新技術(shù)術(shù)。這一一技術(shù)可可使許多多分子雜交反應(yīng)應(yīng)同時進(jìn)進(jìn)行。DNA芯片的基片：玻璃、硅片或尼尼龍等。。㈥DNA芯片(DNAchips)在面積不大(如2cm２)的基片表面分分成不同小格格有序地點陣排排列于一定位位置的、可尋尋址的核苷酸酸分子；將待分析核苷酸酸分子標(biāo)記(如用熒光)，變性成單鏈與與芯片上序列列相同的核苷苷酸分子雜交交；與芯片上序列列不同的核酸酸分子被洗掉；利用高精度的的激光掃描儀儀記錄分子已雜交交的熒光信號號；計算機軟件分分析。基因多態(tài)性檢檢測（如單核苷酸酸多態(tài)性篩選選singlenucleotidePolymorphisms，SNPs)；基因表達(dá)分析析(不同細(xì)胞和不不同組織的RNA群體比較)；克隆選擇及文文庫篩選（如cDNA文庫）；基因突變檢測測及遺傳病和和腫瘤的診斷斷等。DNA芯片技術(shù)應(yīng)用用領(lǐng)域：用基因芯片預(yù)預(yù)測“未病之之病”通過基因芯片靈敏快速的檢檢測癌基因及及正?；虻牡谋磉_(dá)變化,從而實現(xiàn)中國國古語中“上醫(yī)治未病病”的理想,對疾病作出前前瞻性的診斷斷,這就是“基因因診斷”第二節(jié)基因因組學(xué)基因組學(xué)(genomics)：研究生物基因因組和如何利用基因的一一門學(xué)問。該該學(xué)科提供基因因組信息以及及相關(guān)數(shù)據(jù)系統(tǒng)統(tǒng)利用，試圖圖解決生物、醫(yī)醫(yī)學(xué)、和工業(yè)業(yè)領(lǐng)域的重大問問題。研究對象：以整個基因組組為研究單位位，而不以單單個基因為單位作為研究究對象。研究目標(biāo)：認(rèn)識基因組的結(jié)構(gòu)構(gòu)、功能和進(jìn)進(jìn)化；闡明整個基因組所所包含的遺傳傳信息和相互互關(guān)系；充分利用有效資源，預(yù)預(yù)防和治療人人類疾病。重要組成部分分：基因組計劃(genomeproject)大體上可分為為：⒈構(gòu)建基因組的遺傳圖譜；⒉構(gòu)建基因組的物理圖譜；⒊測定基因組DNA的全部序列；⒋繪制基因組的轉(zhuǎn)錄本圖譜；⒌分析基因組的功能?；蚪M計劃研研究開始于1990年。美國啟動被譽譽為“人體阿波羅計劃””的“人類基因組計劃”，投資30億美元，歷時15年測定人類基因組的30億個核苷酸對對的排列次序構(gòu)建高分辨率的人人類基因組遺傳圖譜譜和物理圖譜譜發(fā)展生物信息學(xué)。。人類基因組計計劃在美國提出人人類基因組計劃后，日本和中國分別于1991年和1992年啟動了“水稻基因組組計劃”。由于以人類為為對象的研究究實際上受到到諸多限制，也受倫理學(xué)的約束，所以以人類基因組組計劃還將對有關(guān)的的模式生物，，如酵母、線線蟲、果蠅、、小鼠、家豬、、擬南芥等進(jìn)進(jìn)行相應(yīng)的研研究，為研究人類基因組組的戰(zhàn)略提供重重要的依據(jù)。2002年4月5日《Science》以14頁的篇幅刊登登和宣布中國國科學(xué)家獨立立繪制完成水水稻基因組草草圖序列(總數(shù)：4.6億)，是繼人類基基因組工作草草圖(2001年春)之后完成測定定的最大基因因組。(2001年12月14日美、英等國國科學(xué)家宣布布繪制出擬南南芥基因組的的完整圖譜)秈稻基因組草草圖材料：秈稻。完成單位：華大基因研究究中心，中科科院遺傳與發(fā)發(fā)育生物學(xué)研究所所等12個單位，2001年7月啟動。水平：水稻基因組中中的總基因數(shù)數(shù)約為46022~55615個（接近人類基因因數(shù)的兩倍），工作框架圖序序列已覆蓋水稻整個基因組92％以上的基因。方法：“鳥槍射擊法法”，利用國國產(chǎn)曙光2000、曙光3000超級計算機(1000億次/秒)對隨機DNA碎片進(jìn)行排序序和組裝，確確定其在基因因組的正確位位置。計劃：功能基因分析析和蛋白質(zhì)研研究。2002年11月21日《Nature》宣布中國科學(xué)學(xué)家獨立繪制制完成粳稻基因組第第四號染色體體精確測序圖圖，使我國對國際際水稻基因組組測序計劃貢貢獻(xiàn)率達(dá)到10%。粳稻基因組草圖材料：粳稻“日本晴晴”。完成單位：中科院國家基基因研究中心心等4家單位。整個國際水稻稻基因組計劃劃始于1998年，日本、美美國、中國、法法國等國家和和地區(qū)參加。。水平：第四號染色體體中的總堿基數(shù)目為為0.35億堿基對，覆蓋了該染色色體全長序列列98％的區(qū)域，只剩剩下7個小空洞，測測序堿基序列列的精確度達(dá)達(dá)到99.99%。完整測定的著絲粒序列在高等生物中中屬于首次。。計劃：對預(yù)測鑒定的的4658個基因作進(jìn)一步步分析、著絲粒功能等研研究。2007年10月初，我國科學(xué)家對對外宣布，他們已經(jīng)成功繪制完成成第一個完整整中國人基因因組圖譜，又稱“炎黃一號””，這也是第一一個亞洲人全全基因序列圖譜。首個中國人基基因組圖譜繪繪制如果將這個基基因組序列寫寫成一本書，，高度將與384米的深深圳地王大廈廈相同。人類基因組序序列圖譜揭示了某個個人的遺傳密碼，他的的祖?zhèn)髅\、以及未來來可能發(fā)生的病變。在不久的將來來，人類將可可能人手一份份“基因身份””，里面記錄了只只屬于你自己己的遺傳信息息。特別是某某些遺傳缺陷陷會被早發(fā)現(xiàn)現(xiàn)早治療，祖祖先的命運因因此而不必在在你身上重演演。目前，在美國國為一個人進(jìn)進(jìn)行所有的基基因檢測費用用高達(dá)2000萬美元，在國內(nèi)的價格格也達(dá)到200萬人民幣。到2020年，在現(xiàn)有科學(xué)發(fā)發(fā)展水平上為為一個人繪制制出基因圖，，可能只需要要1萬；一、基因組圖圖譜的構(gòu)建小基因組物種種常用鳥槍法測序法法解決方法：大基因組測序序存在兩個問問題：片段數(shù)(n)龐大，片段間連接和和裝配非常復(fù)復(fù)雜；基因組中相同同或相似的重重復(fù)序列在連連接和裝配時容易出錯。大規(guī)模序列測測定前，構(gòu)建建基因組圖譜可作為序列測定中制定定測序方案的的依據(jù)，以便便錨定測知的核酸序列在在染色體上的的位置。測序方法：克隆連續(xù)序列列法(clonecontig)：將基因組DNA切割長度為0.1Mb-1Mb的大片段克隆到Y(jié)AC或BAC載體上分別測定單個個克隆的序列列再裝配連接成連續(xù)的DNA分子。定向鳥槍射擊擊法(directedshotgun)：以基因組圖譜中標(biāo)記為為依據(jù)測序裝配和構(gòu)構(gòu)建不同DNA片段的序列。基因組圖譜根根據(jù)構(gòu)建的途途徑，可分為為兩種：遺傳圖譜：根據(jù)遺傳性狀(如已知基因位點點、功能未知的DNA標(biāo)記、可鑒別別的表型性狀狀)的分離比例將其定位在基基因組中，構(gòu)構(gòu)建相應(yīng)的連連鎖圖譜。物理圖譜：描繪DNA上可以識別的的標(biāo)記的位置置和相互之間距離離(以堿基對的數(shù)數(shù)目為衡量單單位)的圖譜。㈠遺傳圖譜的構(gòu)構(gòu)建：1.圖譜標(biāo)記：凡是位于染色色體上易于檢檢測識別、在不同個體之之間存在差異異（多態(tài)性）），而且可以以穩(wěn)定遺傳的位位點，都可以以作為遺傳作作圖的標(biāo)記。。缺點：基因數(shù)目有限限、所構(gòu)建的的遺傳圖譜不不詳細(xì)、標(biāo)記間的的遺傳距離較較大。⑴.基因標(biāo)記：基因控制性狀狀的表現(xiàn)，所所以也就是利利用可以鑒別別的形態(tài)、生生化等表型性性狀作標(biāo)記，，⑵.DNA標(biāo)記：每種生物DNA具有穩(wěn)定性，，∴DNA本身可作為構(gòu)構(gòu)建遺傳圖譜譜的標(biāo)記；主要有以下3種類型：①限制性內(nèi)切酶酶多型性②簡單序列長度度多型性③單核苷酸多型型性2、遺傳圖譜的的構(gòu)建：⑴遺傳作圖的遺遺傳學(xué)原理：：遺傳圖譜的繪繪制主要依據(jù)據(jù)是經(jīng)典的孟孟德爾遺傳學(xué)學(xué)的連鎖和交交換規(guī)律。通過重組率確確定遺傳標(biāo)記記在染色體上上的相對位置置，從而繪制制遺傳圖譜。。⑵不同模式生物物的連鎖分析析：有性雜交實驗驗的連鎖分析析及系譜分析轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)及及結(jié)合等(二)物理圖譜的構(gòu)構(gòu)建：1.構(gòu)建物理圖譜譜的原因：⑴遺傳圖譜的分分辯率有限：：⑵遺傳圖譜的精精確性不高：：2.物理圖譜的構(gòu)構(gòu)建：⑴限制性酶圖譜譜：利用限制性內(nèi)內(nèi)切酶繪制圖圖譜，對于DNA分子長度<50Kb的片段，一般般沒有什么困困難。(46=4094bp)而對對于于>50Kb的DNA分子子，，可選選用用稀稀有有切切點點內(nèi)內(nèi)切切酶酶酶切切DNA。(48=65536bp)⑵熒光光原原位位雜雜交交:是另另一一物物理理圖圖譜譜構(gòu)構(gòu)建建方方法法通過過熒熒光光標(biāo)標(biāo)記記的的探探針與與DNA分子子雜雜交交，，使使染染色色體體上上的的雜交交信信號號（位位置就就是是探探針針DNA在染染色色體體上上的的圖圖譜譜位位點點））在在顯顯微微鏡下下可可直直接接觀觀察察。。⑶序列列標(biāo)標(biāo)簽簽位位點點：：利用用某某一一已知知序序列列為為標(biāo)標(biāo)簽簽的的位位點點(sequencetaggedsites，STS)作探探針針，，與與基基因因組組DNA雜交交，，繪繪制制物物理理圖譜譜。。3人類類基基因因組組物物理理圖圖譜譜:人類類基基因因組組序序列列開開始始測測定定時時，，已已有有45萬個個EST，其其中中有有一一些些重重復(fù)復(fù)序序列列，，經(jīng)經(jīng)計計算算機機分分析析篩篩選選后后得得到到49625個，，各各代代表表一一個個基基因因。。再再從從中中篩篩選選出出3萬個個EST、二二個個輻射射雜雜交交系系庫庫（分分別別有有83和93個細(xì)細(xì)胞胞株株））、、一一個個有有32000個克克隆隆的的YAC文庫庫用用于于構(gòu)構(gòu)建建圖圖譜譜。結(jié)果果構(gòu)構(gòu)建建的的物物理理圖圖譜譜的的密密度度為為每個個標(biāo)標(biāo)記記183kb，EST分布布結(jié)結(jié)果果表表明明基基因因在在染染色色體體上上的的排排列列是是不不均均勻勻的的。。將上上述述遺傳傳圖圖譜譜及其其它它物理理圖圖譜譜整合合構(gòu)成成更更加加完完整整的的人人類類其其因因組組圖圖譜譜，，作為為基基因因組組序序列列測測定定的的框框架架和和分分析析的的依依據(jù)據(jù)。。二、、基基因因組組圖圖譜譜的的應(yīng)應(yīng)用用基因因組組圖圖譜譜中中除除了了構(gòu)構(gòu)建建遺遺傳傳圖圖譜譜和和物物理理圖圖譜譜外外，，還可可進(jìn)進(jìn)一一步步根據(jù)據(jù)標(biāo)標(biāo)記記類類型型細(xì)分分為為不不同同的的稱稱謂謂。。如RFLP圖譜譜、、RAPD圖譜譜、、AFLP圖譜譜等等，，目目前前已已在擬擬南南芥芥、、番番茄茄、、水水稻稻等等30多種種植植物物中中構(gòu)構(gòu)建建了了基基因圖圖譜譜?；蛞驁D圖譜譜的的構(gòu)構(gòu)建建除除了了進(jìn)進(jìn)行行測測序序之之外外，，還還有有許許多多的用用途途。。1.基因因定定位位：：借助助基基因因組組圖圖譜譜，，可可使使基基因因定定位位的的精精度度、、深深度度、、廣廣度度等等方方面面有有極極大大的的提提高高。。已已陸陸續(xù)續(xù)在在各各種種農(nóng)農(nóng)作作物物上上定定位位了了許許多多重重要要農(nóng)藝藝性性狀狀和經(jīng)濟濟性性狀狀的基基因因，，在在復(fù)復(fù)雜雜數(shù)量量性性狀狀位位點點(quantitativetraitloci，QTL)定位位分分析析方方面面，，也也取取得得了了很很大大進(jìn)進(jìn)展展。。2.基因因組組比比較較分分析析：：已經(jīng)經(jīng)在在禾本本科科玉米米、、水水稻稻、、高高梁梁、、大大麥麥、、小小麥麥和和黑黑麥麥，，茄科科的的蕃蕃茄茄、、胡胡椒椒、、馬馬鈴鈴薯薯，，十字字花花科科擬南南芥芥、、甘甘藍(lán)藍(lán)、、花花椰菜菜、、油油菜菜等等做做了了遺遺傳傳圖圖譜譜比比較較分分析析，，從從分分子子水水平平了了解解物物種間間同同源源性性，，研研究究基因因組組的的進(jìn)進(jìn)化化和染色色體體的的演演變變。3.標(biāo)記輔助選擇(marker-assistedselectionMAS)：

飽和基因組圖譜可用來確定與任何一個目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記根據(jù)圖譜間接選擇目的基因，可降低連鎖累贅，加速目的基因的轉(zhuǎn)移與利用，提高回交育種的效率。4.基因因的的克克隆隆與與分分離離：：根據(jù)據(jù)飽飽和和的的基基因因組組圖圖譜譜，，可可以以找找到到一個個與與目目的的基基因因緊密密連連鎖鎖的的分分子子標(biāo)標(biāo)記記，作作為為染色色體體步步行行(chromosomewalking)起始始點點進(jìn)行行基基因因的的克克隆隆和和分分離離，，此此法法亦亦稱稱圖圖位克克隆隆法法(map-basedcloning)，為為基基因因產(chǎn)產(chǎn)物物未未知知的的基基因克克隆隆提提供供了了捷捷徑徑。。是在在完完成成基基因因組組圖圖譜譜構(gòu)構(gòu)建建以以及及全全部部序序列列測測定定的的基基礎(chǔ)礎(chǔ)上上進(jìn)一一步步研研究究全全基基因因組組的的基因因功功能能、基基因因之之間間相互互關(guān)關(guān)系系和調(diào)控控機機制制為主主要要內(nèi)內(nèi)容容的的學(xué)學(xué)科科。。三、、后后基基因因組組學(xué)學(xué)(post-genomics)自從從1996年酵酵母母菌菌基基因因組組全全序序列列測測定定以來來，，全全世世界界已已有1000多個實實驗室室、5000多名科科學(xué)家家從事事酵母母菌后后基因因組學(xué)的的研究究，共共發(fā)表表論文文7000多篇，，鑒定定1060個新基基因的功能能，但但仍然然還有有約1600個閱讀讀框架架的功功能不不清楚楚。后基因組學(xué)主要技術(shù)：

DNA微列陣技術(shù)；蛋白質(zhì)組學(xué)；酵母菌雙雜交系統(tǒng)；生物信息學(xué)等技術(shù)。1DNA微列陣陣(DNAmicroarrays)：是利用用DNA芯片技技術(shù)同時進(jìn)進(jìn)行大大量分分子雜雜交，，分析析比較較不同同組織織或器器官的的基因因表達(dá)達(dá)水平平，篩篩選突突變基基因，，從核酸水水平分析基基因表表達(dá)模模式。。2蛋白質(zhì)質(zhì)組學(xué)學(xué)(proteomics)：是從蛋白白質(zhì)水水平來來研究究基因因組的的基因因表達(dá)達(dá)分析基基因組組的蛋蛋白質(zhì)質(zhì)類型型、數(shù)數(shù)量、、空間間結(jié)構(gòu)變異異以及及相互互作用用的機機制。。蛋白質(zhì)質(zhì)組學(xué)學(xué)比基基因組組學(xué)更更為復(fù)復(fù)雜.真核生生物的的基因因表達(dá)達(dá)受轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因因子控控制，，轉(zhuǎn)錄錄因子子需與與啟動動子區(qū)區(qū)域的的DNA結(jié)合并激活活RNA聚合酶酶轉(zhuǎn)錄錄。轉(zhuǎn)錄因因子具具有DNA結(jié)合及激活轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄兩功能能，分別別由不不同區(qū)區(qū)域完完成，，而且且將這這兩部部分分割成成兩個個片段段后仍由由互作作能裝配配成一一個完完全有有功能能的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因因子。?；谶@這一特特點，，設(shè)計計出酵酵母雙雙雜交交系統(tǒng)統(tǒng)。是利用用酵母母菌同同一個個細(xì)胞胞中共共同表表達(dá)不不同蛋蛋白質(zhì)質(zhì)，以以鑒定蛋蛋白質(zhì)質(zhì)之間間互作作的一種種分析析方法法。3酵母菌菌雙雜雜交系系統(tǒng)(twohybrid-systems)：4生物信信息學(xué)學(xué)(bioinformatics)：是一種種用計算機機貯存原原始資資料，，分析析生物物信息息，將將DNA芯片以以及蛋蛋白質(zhì)質(zhì)雙向向電泳泳結(jié)果果轉(zhuǎn)變變成為為可讀讀的遺遺傳學(xué)學(xué)信息息的學(xué)學(xué)科。。生物信信息學(xué)學(xué)是現(xiàn)代生生物技技術(shù)與與計算算機科科學(xué)的的結(jié)合合，收集集、加加工和和分析析生物物資料料和信信息。。生物信信息學(xué)學(xué)是在未未來生生命科科學(xué)中中