6熒光分光光法解析課件

第6章.熒光分光光度法6.1概述6.2方法原理6.3熒光分析法6.4熒光分光光度法在生物工程分析中的應(yīng)用第6章.熒光分光光度法6.1概述16.1概述6.1概述2熒光蛋白質(zhì)在2008年10月8日，諾貝爾獎委員會將化學(xué)獎授予日本化學(xué)家下村修（OsamuShimomura）、美國科學(xué)家馬丁?沙爾菲（MartinChalfie）和美籍華裔科學(xué)家錢永健（RogerY.Tsien）三人，以表彰他們“發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了綠色熒光蛋白質(zhì)（GreenFluorescentProtein,GFP）”技術(shù)。熒光蛋白質(zhì)在2008年10月8日，諾貝爾獎委員會將化學(xué)獎授予3用綠色熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞用綠色熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞4用這種能自己發(fā)光的熒光分子來作為生物體(細(xì)胞、細(xì)胞器)的標(biāo)記。將這種熒光分子通過化學(xué)方法掛在其他不可見的分子上，原來不可見的部分就變得可見了。用這種能自己發(fā)光的熒光分子來作為生物體(細(xì)胞、細(xì)胞器)的標(biāo)記5熒光染料能發(fā)出熒光的染料。在吸收可見光和紫外光后，能把紫外光轉(zhuǎn)變?yōu)椴ㄩL較長的可見光波而反射出來，呈閃亮的鮮艷色彩。用于增白洗衣粉中的增白劑，指示信號用的各種熒光路標(biāo)漆，熒光標(biāo)志服等。熒光染料能發(fā)出熒光的染料。在吸收可見光和紫外光后，能把紫外6熒光增白劑它的特性是能激發(fā)入射光線產(chǎn)生熒光，使所染物質(zhì)獲得類似熒石的閃閃發(fā)光的效應(yīng)，使肉眼看到的物質(zhì)很白，達到增白的效果。其作用是把制品吸收的不可見的紫外線輻射轉(zhuǎn)變成紫藍(lán)色的熒光輻射，與原有的黃光輻射互為補色成為白光，提高產(chǎn)品在日光下的白度。熒光增白劑它的特性是能激發(fā)入射光線產(chǎn)生熒光，使所染物質(zhì)獲得76.2方法原理6.2.1熒光（磷光）產(chǎn)生機理6.2.2.1分子能級與躍遷分子能級比原子能級復(fù)雜；在每個電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級；基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…

。6.2方法原理6.2.1熒光（磷光）產(chǎn)生機理8熒光F磷光P壽命10-7-10-9S壽命10-4-10S熒光F磷光P壽命10-7-10-9S壽命10-4-109單重態(tài)

所有電子自旋都配對的分子的電子狀態(tài)。大多數(shù)有機物分子的基態(tài)是單重態(tài)。當(dāng)基態(tài)一對電子中的一個被激發(fā)到較高能級，其自旋方向不會立刻改變，分子仍處于單重態(tài)。6.2.2.2電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)單重態(tài)6.2.2.2電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)10三重態(tài)：有兩個電子的自旋不配對而平行的狀態(tài)。6熒光分光光法解析課件11S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)移振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)移l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)移振動弛豫10-14-10-12S10-13-10-11S10-2-10-4S10-4-10S10-9-10-7SS2S1S0T1吸發(fā)發(fā)系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)移振動弛豫能l2l1l126.2.2.3激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量。傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間竄躍振動弛豫無輻射躍遷

激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強度相對大。熒光：時間較短,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)。磷光：自旋禁阻，時間較長，第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)。6.2.2.3激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑電子處于激13分子去活化過程及熒光的發(fā)生振動弛豫：在溶液中，處于激發(fā)態(tài)的溶質(zhì)分子與溶劑分子間發(fā)生碰撞，把一部分能量以熱的形式迅速傳遞給溶劑分子（環(huán)境），在10-11～10-13

秒時間回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級，這一過程稱為振動弛豫。分子去活化過程及熒光的發(fā)生142.

內(nèi)轉(zhuǎn)移：當(dāng)激發(fā)態(tài)S2的較低振動能級與S1的較高振動能級的能量相當(dāng)或重疊時，分子有可能從S2的振動能級以無輻射方式過渡到S1的能量相等的振動能級上，這一無輻射過程稱為“內(nèi)轉(zhuǎn)換”。（“內(nèi)轉(zhuǎn)換”過程同樣也發(fā)生在三線激發(fā)態(tài)的電子能級間）2.內(nèi)轉(zhuǎn)移：當(dāng)激發(fā)態(tài)S2的較低振動能級與S1的較高振動能級153.熒光發(fā)射：當(dāng)激發(fā)態(tài)的分子通過振動馳豫—內(nèi)轉(zhuǎn)移—振動馳豫到達第一單線激發(fā)態(tài)的最低振動能級時，第一單線激發(fā)態(tài)最低振動能級的電子可通過發(fā)射輻射（光子）躍回到基態(tài)的不同振動能級，此過程稱為

“熒光發(fā)射”。如果熒光幾率較高，則發(fā)射過程較快，需10-9～10-7秒。（它代表熒光的壽命）4.磷光發(fā)射：第一電子三線激發(fā)態(tài)最低振動能級(亞穩(wěn)態(tài))的分子以發(fā)射輻射（光子）的形式回到基態(tài)的不同振動能級，此過程稱為“磷光發(fā)射”。熒光和磷光的根本區(qū)別:

熒光是由單重躍遷-單重引起的，磷光則由三重躍遷-單重產(chǎn)生的。3.熒光發(fā)射：當(dāng)激發(fā)態(tài)的分子通過振動馳豫—內(nèi)轉(zhuǎn)移—振動馳豫到166.2.2.4分子熒光的類型分子因吸收光能而被激發(fā)，所產(chǎn)生的次級光發(fā)射現(xiàn)象稱為光致發(fā)光；分子被激發(fā)的能量是由化學(xué)反應(yīng)釋放的能量所提供，其發(fā)光現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。由生物體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)所引起的發(fā)光現(xiàn)象，被稱為生物發(fā)光。6.2.2.4分子熒光的類型分子因吸收光能而被激發(fā)，所產(chǎn)生17熒光棒熒光棒18熒光棒內(nèi)主要由過氧化物、酯類化合物和熒光染料三種化學(xué)成分構(gòu)成。熒光棒發(fā)光原理是過氧化物和酯類化合物發(fā)生反應(yīng)后，能量傳遞至熒光染料，再由染料發(fā)出熒光。熒光棒內(nèi)主要由過氧化物、酯類化合物和熒光染料三種化學(xué)成分構(gòu)成19螢火蟲、水母、深海魚類發(fā)光機制是兩種物質(zhì)——熒光素和熒光素酶——合作產(chǎn)生的結(jié)果螢火蟲、水母、深海魚類發(fā)光機制是兩種物質(zhì)——熒光素和熒光素酶206.2.3激發(fā)光譜與熒光光譜

1.激發(fā)光譜：將激發(fā)熒光的光源用單色器分光，連續(xù)改變激發(fā)光波長，固定熒光發(fā)射波長，測定不同波長激發(fā)光下物質(zhì)溶液發(fā)射的熒光強度(I)，作I—λ光譜圖稱激發(fā)光譜。2.熒光光譜：選擇λex作激發(fā)光源，用另一單色器將物質(zhì)發(fā)射的熒光分光，記錄不同發(fā)射波長時的I，作I-λ光譜圖稱為熒光光譜。6.2.3激發(fā)光譜與熒光光譜

1.激發(fā)光譜：將激發(fā)熒光的216熒光分光光法解析課件22圖6－8蒽在乙醇溶液中的鏡像光譜圖6－8蒽在乙醇溶液中的鏡像光譜233.熒光光譜的特點：①斯托克斯位移（Stokesshift)。與激發(fā)光譜相比，熒光光譜的波長總是出現(xiàn)在更長的波長處；②熒光光譜與激發(fā)波長無關(guān)。無論用λ=250和350nm作激發(fā)光源，所得熒光光譜形狀和峰的位置都是相同；③吸收光譜與發(fā)射光譜大致成鏡像對稱。3.熒光光譜的特點：246.2.4熒光量子產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)1.產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件：

i）分子具有與輻射頻率相應(yīng)的熒光結(jié)構(gòu)（內(nèi)因）；

ii）吸收特征頻率的光后，應(yīng)可產(chǎn)生具一定量子效率的熒光。即量子效率F足夠大：6.2.4熒光量子產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)1.產(chǎn)生并可觀察到熒光的252.分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系1）躍遷類型：通常，具有—*及n—*躍遷結(jié)構(gòu)的分子才會產(chǎn)生熒光。而且具—*躍遷的熒光效率比n—*躍遷的要大得多。2）共軛效應(yīng)：共軛度越大，熒光越強。2.分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系1）躍遷類型：26共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系27分子結(jié)構(gòu)與熒光3）剛性結(jié)構(gòu)和共平面性：分子剛性（Rigidity）越強，分子振動少，與其它分子碰撞失活的機率下降，熒光量子效率提高。如熒光素（大）與酚酞（=0）分子結(jié)構(gòu)與熒光3）剛性結(jié)構(gòu)和共平面性：28（3）剛性平面結(jié)構(gòu)酚酞(無熒光)8－羥基喹啉(弱熒光)紅色熒光CO-OOCOO-COCOO--ONO-NOMgNO熒光素（3）剛性平面結(jié)構(gòu)酚酞(無熒光)8－羥基喹啉(弱熒光)紅色29聯(lián)二苯φ=0.2芴φ=1.03,4-苯并芘(強熒光物質(zhì))CH2聯(lián)二苯φ=0.2芴φ=1.03,4-苯并芘(強30剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系8—羥基喹啉8—羥基喹啉鎂剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系8—羥基喹啉8—羥基喹31剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系7-二甲胺萘–1-磺酸鹽F

=0.758-二甲胺萘–1-磺酸鹽F

=0.03空間位阻與熒光的關(guān)系剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系7-二甲胺萘–1-32分子結(jié)構(gòu)與熒光4）取代效應(yīng)：

給電子取代基增強熒光（p-共軛），如-OH、-OR、-NH2、-CN、-NR2等；吸電子基降低熒光，如-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-X等；

分子結(jié)構(gòu)與熒光4）取代效應(yīng)：33與體系作用小的取代基影響不明顯：－SO3R,－NH3＋,－SH,－F,－R。COOHNO2I無熒光NH2OH比熒光強50倍COOHNO2I無熒光NH2OH比熒光強50倍34

取代基之間若發(fā)生氫鍵，增強分子平面性和剛性會加強熒光:有熒光COOHOH無熒光OHCOOH水楊酸有熒光OHOHCO重原子降低熒光但增強磷光，如苯環(huán)被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐漸減弱到消失，該現(xiàn)象也稱重原子效應(yīng)。取代基之間若發(fā)生氫鍵，增強分子平面性和剛性會加強熒光35影響熒光的外界因素（一）溶劑效應(yīng)：

溶劑極性可增加或降低熒光強度（改變—*及n—*

躍遷的能量）；與溶劑作用從而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)來增加或降低熒光強度。影響熒光的外界因素（一）溶劑效應(yīng)：36影響熒光的外界因素（二）溫度：溫度增加，熒光強度下降（因為內(nèi)、外轉(zhuǎn)換增加、粘度或“剛性”降低）。因此體系降低溫度可增加熒光分析靈敏度。如熒光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，熒光效率增加3%，冷至-80℃時，熒光效率為100%。影響熒光的外界因素（二）溫度：如熒光素的乙醇溶液在0℃以下每37影響熒光的外界因素（三）pH值：具酸或堿性基團的有機物質(zhì)，在不同pH值時，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強度將發(fā)生改變；對無機熒光物質(zhì)，因pH值會影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強度發(fā)生改變。影響熒光的外界因素（三）pH值：38pH<2pH>13pH7~12苯胺苯胺在pH7-12溶液中會發(fā)生藍(lán)色熒光，在pH小于2或大于13的溶液中都不發(fā)生熒光。pH<2pH>13pH7~12苯胺苯胺在pH7-12溶39影響熒光的外界因素（四）內(nèi)濾光和自吸：體系內(nèi)存在可以吸收熒光的物質(zhì)，或熒光物質(zhì)的熒光短波長與激發(fā)光長波長有重疊，均可使熒光強度下降，稱為內(nèi)濾光；當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時，可吸收自身的熒光發(fā)射稱為熒光自吸。影響熒光的外界因素（四）內(nèi)濾光和自吸：40影響熒光的外界因素（五）熒光猝滅：碰撞猝滅；靜態(tài)猝滅；轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅；電子轉(zhuǎn)移猝滅；自猝滅。影響熒光的外界因素（五）熒光猝滅：41例：猝滅劑（quencher）的影響熒光猝滅：是指熒光物質(zhì)分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子相互作用，引起熒光強度降低、消失或熒光強度與濃度不呈現(xiàn)線性關(guān)系的現(xiàn)象。引起熒光猝滅的物質(zhì)，稱為猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等吸電子極性物質(zhì)。熒光猝滅法:

有些猝滅劑的加入，其熒光強度的減少與熒光猝滅劑的濃度呈線性關(guān)系，可用于測定猝滅劑的含量，這種方法稱為熒光猝滅法。例：猝滅劑（quencher）的影響熒光猝滅：是指熒光物質(zhì)分42溶液的熒光一．熒光分析的定量基礎(chǔ)熒光強度與溶液濃度的關(guān)系

F=FI0CbF—熒光效率—熒光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)

I0—激發(fā)光強度

b—液層厚度

F=KC（該式只有當(dāng)Cb≤0.05時才成立）6.3熒光分析法溶液的熒光一．熒光分析的定量基礎(chǔ)熒光強度與溶液濃度的關(guān)系6.432.熒光分光光度計2.熒光分光光度計44單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器。光源：高壓汞燈、氙燈檢測器：光電倍增管2.熒光分光光度計單色器單色器光源。檢測器液槽放大和指示儀表熒光分光光度計的結(jié)構(gòu)示意圖I0I單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的45激發(fā)光源要求發(fā)射強度大,波長范圍寬,而且在整個波長范圍內(nèi)強度一致.常用高壓汞燈和氙弧燈.濾光片和分光器干涉濾光片;分光器多采用光柵樣品室樣品室由樣品池及樣品轉(zhuǎn)換器組成.其中樣品池用石英或低熒光的玻璃材料.激發(fā)光源46發(fā)射單色器用于選擇投射到檢測器的熒光波長。檢測器熒光或磷光的強度較弱，要求檢測器靈敏度高。精密的熒光光度計采用光電倍增管為檢測器，將轉(zhuǎn)入的光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，并將其放大，由記錄器記錄熒光強度。發(fā)射單色器476.3.2熒光分析方法特點及應(yīng)用(一)熒光分析方法及特點1．標(biāo)準(zhǔn)曲線法用已知的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過和試樣同樣的處理后，配成一系列標(biāo)液。測定標(biāo)液的熒光強度，用熒光強度對標(biāo)液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)試液的熒光強度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出試樣中熒光物質(zhì)的含量。6.3.2熒光分析方法特點及應(yīng)用(一)熒光分析方法及特點482．熒光分析法的靈敏度比吸光法高得多，更適合于低濃度物質(zhì)的分子。這兩種方法在靈敏度方面的差別主要是由于同濃度相關(guān)的參數(shù)的測量方式不同。2．熒光分析法的靈敏度49

而熒光強度F（或磷光強度P）直接同熒光（磷光）物質(zhì)的濃度成正比。同濃度相關(guān)的參數(shù)是在很小噪聲背景上的熒光（磷光）發(fā)射訊號本身，可用增強入射光強度I0或增大熒光訊號的放大倍數(shù)來提高靈敏度。而在光度法中,若檢測器放大倍數(shù)↑，I0及I同時↑,A值不變。故熒光法靈敏度常比相應(yīng)光度法高2～4個數(shù)量級。而熒光強度F（或磷光強度P）直接同熒光（磷光）50

在光度法中,ε表示方法的靈敏度。ε↑，其測定靈敏度↑。在熒光法中，靈敏度與該物質(zhì)激發(fā)時的ε及發(fā)射時的量子效率φ有關(guān)。熒光法絕對靈敏度理論定義為φε的乘積（ε單位μg·cm-2）,φε↑，熒光強度↑，測定靈敏度↑。熒光法絕對靈敏度實際定義為φε/H（H發(fā)射光譜半峰寬度μm-1）

。在光度法中,ε表示方法的靈敏度。ε↑，其測定51

一般情況下，多采用相對靈敏度來表示。相對靈敏度是以喹啉硫酸氫鹽的0.05mol/L硫酸溶液為標(biāo)準(zhǔn)，并定為1，然后與相同濃度熒光物質(zhì)的熒光強度比較，可求該物質(zhì)的相對靈敏度。

一般情況下，多采用相對靈敏度來表示。相對靈敏度52幾種物質(zhì)的熒光絕對靈敏度熒光物質(zhì)最大吸收波長/nm最大熒光波長/nm熒光光譜半寬度（H）μm-1熒光靈敏度（最大吸收波長）喹啉硫酸氫鹽(0.05mol·L-1H2SO4)2504610.470.066羅丹明B（酒精）5445710.170.88熒光素（0.1mol·L-1NaOH4905150.201.0四溴熒光素（0.1mol·L-1NaOH5185400.180.19硫堇(0.05mol·L-1H2SO4)5986210.180.031

幾種物質(zhì)的熒光絕對靈敏度熒光物質(zhì)最大吸收波長最大熒光波長熒53

3.

熒光分析法的選擇性很多分子在紫外可見區(qū)有吸收，但其中只有一部分能再發(fā)射熒光或磷光，故熒光法固有干擾很少，選擇性較好。

3.

熒光分析法的選擇性541.無機化合物很多金屬（除鈾鹽等）和非金屬可同有機化合物形成熒光配合物，測量發(fā)射的熒光可定量分析。熒光法可測元素：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Pb、Rh、Ru、S、Se、Sb、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn和Zr等。還有一些無機離子如氟和氰離子等能使其它物質(zhì)的熒光由于熄滅效應(yīng)而減弱。據(jù)此可測氟和氰等離子的濃度。(二)熒光分析法的應(yīng)用1.無機化合物(二)熒光分析法的應(yīng)用55無機離子的熒光測定法離子試劑波長，nm靈敏度干擾激發(fā)熒光μg/mLAl3+茜素紫醬R4705000.007Be,Co,Cr,Cu,Th,Zr,F-,NO2-,Ni,PO43-F-鋁-茜素紫醬R(熒光熄滅)4705000.001Be,Co,Cr,Cu,Fe,Ni,Th,Zr,PO43-B4O72-安息香3704500.04Be,SbCd2+2-(鄰羥基苯)苯并惡唑365藍(lán)2NH3Li+8-羥基喹啉3705800.2MgSn4+黃酮醇4004700.1Fe,PO43-,ZrZn2+安息香—綠10B,Be,Sb,無機離子的熒光測定法離子試劑波長，nm靈敏度干擾激發(fā)熒光μ562.很多有機化合物可同無機陽離子形成熒光配合物，一般都具有苯環(huán)以及二個以上能同金屬離子螯合的配位基團。下面是四種最常用的熒光試劑的結(jié)構(gòu)：

2.很多有機化合物可同無機陽離子形成熒光配合物，一般都具57

這些熒光試劑都具有π電子系統(tǒng)。激發(fā)和發(fā)射過程同π-π*躍遷有關(guān)。這種躍遷常產(chǎn)生寬的無精細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光峰。6熒光分光光法解析課件583.3.生物分子:利用激發(fā)光譜和發(fā)射光譜用熒光法研究氨基酸和蛋白質(zhì)。雖然游離氨基酸中能產(chǎn)生熒光的只有幾個帶苯環(huán)的氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯基丙氨酸，然而，某些蛋白質(zhì)含有熒光輔酶(Fluorescentcoenzyme)，熒光輔酶生色劑可用于許多蛋白質(zhì)的熒光分析中。維生素B1(硫胺素)含量的測定維生素B2(核黃素)含量的測定維生素B11(葉酸)含量的測定3.3.生物分子:利用激發(fā)光譜和發(fā)射光譜用熒光法研究氨基酸和59煙熏、烘烤、油炸等造成了3，4—苯并芘含量的增加煙熏、烘烤、油炸等造成了3，4—苯并芘含量的增加60舉例—痕量3,4-苯并芘的測定:

苯并芘方法一：萃取（環(huán)己酮或石油醚）→濃縮→層析→以H2SO4溶解苯并芘→熒光分析熒光測定：

ex=520nm

em=545nm舉例—痕量3,4-苯并芘的測定:苯并芘方法一：熒光測定61方法二：試樣先用有機溶劑提取，或經(jīng)皂化后提取，再將提取液液—液分配或色譜柱凈化，然后在乙酰化濾紙上分離苯并(a)芘。分離出的苯并芘斑點，在波長365nm的紫外光燈下觀察，與標(biāo)準(zhǔn)斑點進行目測比色概略定量。因苯并芘在紫外光燈下照射呈藍(lán)紫色熒光斑點。方法二：試樣先用有機溶劑提取，或經(jīng)皂化后提取，再將提取液液—62舉例二

1,3-環(huán)己二酮-甲醛作為熒光衍生試劑

熒光分光光度法測定氨芐西林鈉熒光測定：

ex=336nm

em=420nm舉例二1,3-環(huán)己二酮-甲醛作為熒光衍生試劑

熒光分光光度63FloroskanAscent系列熒光分析儀應(yīng)用領(lǐng)域：

細(xì)胞內(nèi)Ca2+檢測（IntracellularCa2+

）

細(xì)胞增殖(Cellproliferation)

細(xì)胞毒性(Cytotoxicity)

多藥物耐藥性(Multi-drugresisent)

細(xì)胞粘附(Celladhesion)

DNA定量（DNAquantitation）

報告基因分析（Reportergeneassay）

雜交分析（Hybridizationassay）

免疫分析（Immunoassays）

酶活性分析（Enzymeactivity）

細(xì)菌定量（Bacterialquantitation）

細(xì)胞溶解作用（Phagocytosis）

FloroskanAscent系列熒光分析儀應(yīng)用領(lǐng)域：

64熒光和化學(xué)發(fā)光檢測儀

熒光和化學(xué)發(fā)光檢測儀65可獲得三維光譜圖的儀器

可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時變化時的熒(磷)光光譜圖可獲得三維光譜圖的儀器可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時變化66本章作業(yè)思考題1.名詞解釋：熒光與磷光；激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的定義及區(qū)別。2.熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)通常具備哪些特點？3.熒光分光光度計在結(jié)構(gòu)上與紫外分光光度計有何異同?本章作業(yè)思考題1.名詞解釋：熒光與磷光；激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的67第6章.熒光分光光度法6.1概述6.2方法原理6.3熒光分析法6.4熒光分光光度法在生物工程分析中的應(yīng)用第6章.熒光分光光度法6.1概述686.1概述6.1概述69熒光蛋白質(zhì)在2008年10月8日，諾貝爾獎委員會將化學(xué)獎授予日本化學(xué)家下村修（OsamuShimomura）、美國科學(xué)家馬丁?沙爾菲（MartinChalfie）和美籍華裔科學(xué)家錢永健（RogerY.Tsien）三人，以表彰他們“發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了綠色熒光蛋白質(zhì)（GreenFluorescentProtein,GFP）”技術(shù)。熒光蛋白質(zhì)在2008年10月8日，諾貝爾獎委員會將化學(xué)獎授予70用綠色熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞用綠色熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞71用這種能自己發(fā)光的熒光分子來作為生物體(細(xì)胞、細(xì)胞器)的標(biāo)記。將這種熒光分子通過化學(xué)方法掛在其他不可見的分子上，原來不可見的部分就變得可見了。用這種能自己發(fā)光的熒光分子來作為生物體(細(xì)胞、細(xì)胞器)的標(biāo)記72熒光染料能發(fā)出熒光的染料。在吸收可見光和紫外光后，能把紫外光轉(zhuǎn)變?yōu)椴ㄩL較長的可見光波而反射出來，呈閃亮的鮮艷色彩。用于增白洗衣粉中的增白劑，指示信號用的各種熒光路標(biāo)漆，熒光標(biāo)志服等。熒光染料能發(fā)出熒光的染料。在吸收可見光和紫外光后，能把紫外73熒光增白劑它的特性是能激發(fā)入射光線產(chǎn)生熒光，使所染物質(zhì)獲得類似熒石的閃閃發(fā)光的效應(yīng)，使肉眼看到的物質(zhì)很白，達到增白的效果。其作用是把制品吸收的不可見的紫外線輻射轉(zhuǎn)變成紫藍(lán)色的熒光輻射，與原有的黃光輻射互為補色成為白光，提高產(chǎn)品在日光下的白度。熒光增白劑它的特性是能激發(fā)入射光線產(chǎn)生熒光，使所染物質(zhì)獲得746.2方法原理6.2.1熒光（磷光）產(chǎn)生機理6.2.2.1分子能級與躍遷分子能級比原子能級復(fù)雜；在每個電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級；基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…

。6.2方法原理6.2.1熒光（磷光）產(chǎn)生機理75熒光F磷光P壽命10-7-10-9S壽命10-4-10S熒光F磷光P壽命10-7-10-9S壽命10-4-1076單重態(tài)

所有電子自旋都配對的分子的電子狀態(tài)。大多數(shù)有機物分子的基態(tài)是單重態(tài)。當(dāng)基態(tài)一對電子中的一個被激發(fā)到較高能級，其自旋方向不會立刻改變，分子仍處于單重態(tài)。6.2.2.2電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)單重態(tài)6.2.2.2電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)77三重態(tài)：有兩個電子的自旋不配對而平行的狀態(tài)。6熒光分光光法解析課件78S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)移振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)移l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)移振動弛豫10-14-10-12S10-13-10-11S10-2-10-4S10-4-10S10-9-10-7SS2S1S0T1吸發(fā)發(fā)系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)移振動弛豫能l2l1l796.2.2.3激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量。傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間竄躍振動弛豫無輻射躍遷

激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強度相對大。熒光：時間較短,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)。磷光：自旋禁阻，時間較長，第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)。6.2.2.3激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑電子處于激80分子去活化過程及熒光的發(fā)生振動弛豫：在溶液中，處于激發(fā)態(tài)的溶質(zhì)分子與溶劑分子間發(fā)生碰撞，把一部分能量以熱的形式迅速傳遞給溶劑分子（環(huán)境），在10-11～10-13

秒時間回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級，這一過程稱為振動弛豫。分子去活化過程及熒光的發(fā)生812.

內(nèi)轉(zhuǎn)移：當(dāng)激發(fā)態(tài)S2的較低振動能級與S1的較高振動能級的能量相當(dāng)或重疊時，分子有可能從S2的振動能級以無輻射方式過渡到S1的能量相等的振動能級上，這一無輻射過程稱為“內(nèi)轉(zhuǎn)換”。（“內(nèi)轉(zhuǎn)換”過程同樣也發(fā)生在三線激發(fā)態(tài)的電子能級間）2.內(nèi)轉(zhuǎn)移：當(dāng)激發(fā)態(tài)S2的較低振動能級與S1的較高振動能級823.熒光發(fā)射：當(dāng)激發(fā)態(tài)的分子通過振動馳豫—內(nèi)轉(zhuǎn)移—振動馳豫到達第一單線激發(fā)態(tài)的最低振動能級時，第一單線激發(fā)態(tài)最低振動能級的電子可通過發(fā)射輻射（光子）躍回到基態(tài)的不同振動能級，此過程稱為

“熒光發(fā)射”。如果熒光幾率較高，則發(fā)射過程較快，需10-9～10-7秒。（它代表熒光的壽命）4.磷光發(fā)射：第一電子三線激發(fā)態(tài)最低振動能級(亞穩(wěn)態(tài))的分子以發(fā)射輻射（光子）的形式回到基態(tài)的不同振動能級，此過程稱為“磷光發(fā)射”。熒光和磷光的根本區(qū)別:

熒光是由單重躍遷-單重引起的，磷光則由三重躍遷-單重產(chǎn)生的。3.熒光發(fā)射：當(dāng)激發(fā)態(tài)的分子通過振動馳豫—內(nèi)轉(zhuǎn)移—振動馳豫到836.2.2.4分子熒光的類型分子因吸收光能而被激發(fā)，所產(chǎn)生的次級光發(fā)射現(xiàn)象稱為光致發(fā)光；分子被激發(fā)的能量是由化學(xué)反應(yīng)釋放的能量所提供，其發(fā)光現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。由生物體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)所引起的發(fā)光現(xiàn)象，被稱為生物發(fā)光。6.2.2.4分子熒光的類型分子因吸收光能而被激發(fā)，所產(chǎn)生84熒光棒熒光棒85熒光棒內(nèi)主要由過氧化物、酯類化合物和熒光染料三種化學(xué)成分構(gòu)成。熒光棒發(fā)光原理是過氧化物和酯類化合物發(fā)生反應(yīng)后，能量傳遞至熒光染料，再由染料發(fā)出熒光。熒光棒內(nèi)主要由過氧化物、酯類化合物和熒光染料三種化學(xué)成分構(gòu)成86螢火蟲、水母、深海魚類發(fā)光機制是兩種物質(zhì)——熒光素和熒光素酶——合作產(chǎn)生的結(jié)果螢火蟲、水母、深海魚類發(fā)光機制是兩種物質(zhì)——熒光素和熒光素酶876.2.3激發(fā)光譜與熒光光譜

1.激發(fā)光譜：將激發(fā)熒光的光源用單色器分光，連續(xù)改變激發(fā)光波長，固定熒光發(fā)射波長，測定不同波長激發(fā)光下物質(zhì)溶液發(fā)射的熒光強度(I)，作I—λ光譜圖稱激發(fā)光譜。2.熒光光譜：選擇λex作激發(fā)光源，用另一單色器將物質(zhì)發(fā)射的熒光分光，記錄不同發(fā)射波長時的I，作I-λ光譜圖稱為熒光光譜。6.2.3激發(fā)光譜與熒光光譜

1.激發(fā)光譜：將激發(fā)熒光的886熒光分光光法解析課件89圖6－8蒽在乙醇溶液中的鏡像光譜圖6－8蒽在乙醇溶液中的鏡像光譜903.熒光光譜的特點：①斯托克斯位移（Stokesshift)。與激發(fā)光譜相比，熒光光譜的波長總是出現(xiàn)在更長的波長處；②熒光光譜與激發(fā)波長無關(guān)。無論用λ=250和350nm作激發(fā)光源，所得熒光光譜形狀和峰的位置都是相同；③吸收光譜與發(fā)射光譜大致成鏡像對稱。3.熒光光譜的特點：916.2.4熒光量子產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)1.產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件：

i）分子具有與輻射頻率相應(yīng)的熒光結(jié)構(gòu)（內(nèi)因）；

ii）吸收特征頻率的光后，應(yīng)可產(chǎn)生具一定量子效率的熒光。即量子效率F足夠大：6.2.4熒光量子產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)1.產(chǎn)生并可觀察到熒光的922.分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系1）躍遷類型：通常，具有—*及n—*躍遷結(jié)構(gòu)的分子才會產(chǎn)生熒光。而且具—*躍遷的熒光效率比n—*躍遷的要大得多。2）共軛效應(yīng)：共軛度越大，熒光越強。2.分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系1）躍遷類型：93共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系94分子結(jié)構(gòu)與熒光3）剛性結(jié)構(gòu)和共平面性：分子剛性（Rigidity）越強，分子振動少，與其它分子碰撞失活的機率下降，熒光量子效率提高。如熒光素（大）與酚酞（=0）分子結(jié)構(gòu)與熒光3）剛性結(jié)構(gòu)和共平面性：95（3）剛性平面結(jié)構(gòu)酚酞(無熒光)8－羥基喹啉(弱熒光)紅色熒光CO-OOCOO-COCOO--ONO-NOMgNO熒光素（3）剛性平面結(jié)構(gòu)酚酞(無熒光)8－羥基喹啉(弱熒光)紅色96聯(lián)二苯φ=0.2芴φ=1.03,4-苯并芘(強熒光物質(zhì))CH2聯(lián)二苯φ=0.2芴φ=1.03,4-苯并芘(強97剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系8—羥基喹啉8—羥基喹啉鎂剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系8—羥基喹啉8—羥基喹98剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系7-二甲胺萘–1-磺酸鹽F

=0.758-二甲胺萘–1-磺酸鹽F

=0.03空間位阻與熒光的關(guān)系剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系7-二甲胺萘–1-99分子結(jié)構(gòu)與熒光4）取代效應(yīng)：

給電子取代基增強熒光（p-共軛），如-OH、-OR、-NH2、-CN、-NR2等；吸電子基降低熒光，如-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-X等；

分子結(jié)構(gòu)與熒光4）取代效應(yīng)：100與體系作用小的取代基影響不明顯：－SO3R,－NH3＋,－SH,－F,－R。COOHNO2I無熒光NH2OH比熒光強50倍COOHNO2I無熒光NH2OH比熒光強50倍101

取代基之間若發(fā)生氫鍵，增強分子平面性和剛性會加強熒光:有熒光COOHOH無熒光OHCOOH水楊酸有熒光OHOHCO重原子降低熒光但增強磷光，如苯環(huán)被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐漸減弱到消失，該現(xiàn)象也稱重原子效應(yīng)。取代基之間若發(fā)生氫鍵，增強分子平面性和剛性會加強熒光102影響熒光的外界因素（一）溶劑效應(yīng)：

溶劑極性可增加或降低熒光強度（改變—*及n—*

躍遷的能量）；與溶劑作用從而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)來增加或降低熒光強度。影響熒光的外界因素（一）溶劑效應(yīng)：103影響熒光的外界因素（二）溫度：溫度增加，熒光強度下降（因為內(nèi)、外轉(zhuǎn)換增加、粘度或“剛性”降低）。因此體系降低溫度可增加熒光分析靈敏度。如熒光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，熒光效率增加3%，冷至-80℃時，熒光效率為100%。影響熒光的外界因素（二）溫度：如熒光素的乙醇溶液在0℃以下每104影響熒光的外界因素（三）pH值：具酸或堿性基團的有機物質(zhì)，在不同pH值時，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強度將發(fā)生改變；對無機熒光物質(zhì)，因pH值會影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強度發(fā)生改變。影響熒光的外界因素（三）pH值：105pH<2pH>13pH7~12苯胺苯胺在pH7-12溶液中會發(fā)生藍(lán)色熒光，在pH小于2或大于13的溶液中都不發(fā)生熒光。pH<2pH>13pH7~12苯胺苯胺在pH7-12溶106影響熒光的外界因素（四）內(nèi)濾光和自吸：體系內(nèi)存在可以吸收熒光的物質(zhì)，或熒光物質(zhì)的熒光短波長與激發(fā)光長波長有重疊，均可使熒光強度下降，稱為內(nèi)濾光；當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時，可吸收自身的熒光發(fā)射稱為熒光自吸。影響熒光的外界因素（四）內(nèi)濾光和自吸：107影響熒光的外界因素（五）熒光猝滅：碰撞猝滅；靜態(tài)猝滅；轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅；電子轉(zhuǎn)移猝滅；自猝滅。影響熒光的外界因素（五）熒光猝滅：108例：猝滅劑（quencher）的影響熒光猝滅：是指熒光物質(zhì)分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子相互作用，引起熒光強度降低、消失或熒光強度與濃度不呈現(xiàn)線性關(guān)系的現(xiàn)象。引起熒光猝滅的物質(zhì)，稱為猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等吸電子極性物質(zhì)。熒光猝滅法:

有些猝滅劑的加入，其熒光強度的減少與熒光猝滅劑的濃度呈線性關(guān)系，可用于測定猝滅劑的含量，這種方法稱為熒光猝滅法。例：猝滅劑（quencher）的影響熒光猝滅：是指熒光物質(zhì)分109溶液的熒光一．熒光分析的定量基礎(chǔ)熒光強度與溶液濃度的關(guān)系

F=FI0CbF—熒光效率—熒光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)

I0—激發(fā)光強度

b—液層厚度

F=KC（該式只有當(dāng)Cb≤0.05時才成立）6.3熒光分析法溶液的熒光一．熒光分析的定量基礎(chǔ)熒光強度與溶液濃度的關(guān)系6.1102.熒光分光光度計2.熒光分光光度計111單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器。光源：高壓汞燈、氙燈檢測器：光電倍增管2.熒光分光光度計單色器單色器光源。檢測器液槽放大和指示儀表熒光分光光度計的結(jié)構(gòu)示意圖I0I單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的112激發(fā)光源要求發(fā)射強度大,波長范圍寬,而且在整個波長范圍內(nèi)強度一致.常用高壓汞燈和氙弧燈.濾光片和分光器干涉濾光片;分光器多采用光柵樣品室樣品室由樣品池及樣品轉(zhuǎn)換器組成.其中樣品池用石英或低熒光的玻璃材料.激發(fā)光源113發(fā)射單色器用于選擇投射到檢測器的熒光波長。檢測器熒光或磷光的強度較弱，要求檢測器靈敏度高。精密的熒光光度計采用光電倍增管為檢測器，將轉(zhuǎn)入的光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺⑵浞糯?，由記錄器記錄熒光強度。發(fā)射單色器1146.3.2熒光分析方法特點及應(yīng)用(一)熒光分析方法及特點1．標(biāo)準(zhǔn)曲線法用已知的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過和試樣同樣的處理后，配成一系列標(biāo)液。測定標(biāo)液的熒光強度，用熒光強度對標(biāo)液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)試液的熒光強度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出試樣中熒光物質(zhì)的含量。6.3.2熒光分析方法特點及應(yīng)用(一)熒光分析方法及特點1152．熒光分析法的靈敏度比吸光法高得多，更適合于低濃度物質(zhì)的分子。這兩種方法在靈敏度方面的差別主要是由于同濃度相關(guān)的參數(shù)的測量方式不同。2．熒光分析法的靈敏度116

而熒光強度F（或磷光強度P）直接同熒光（磷光）物質(zhì)的濃度成正比。同濃度相關(guān)的參數(shù)是在很小噪聲背景上的熒光（磷光）發(fā)射訊號本身，可用增強入射光強度I0或增大熒光訊號的放大倍數(shù)來提高靈敏度。而在光度法中,若檢測器放大倍數(shù)↑，I0及I同時↑,A值不變。故熒光法靈敏度常比相應(yīng)光度法高2～4個數(shù)量級。而熒光強度F（或磷光強度P）直接同熒光（磷光）117

在光度法中,ε表示方法的靈敏度。ε↑，其測定靈敏度↑。在熒光法中，靈敏度與該物質(zhì)激發(fā)時的ε及發(fā)射時的量子效率φ有關(guān)。熒光法絕對靈敏度理論定義為φε的乘積（ε單位μg·cm-2）,φε↑，熒光強度↑，測定靈敏度↑。熒光法絕對靈敏度實際定義為φε/H（H發(fā)射光譜半峰寬度μm-1）

。在光度法中,ε表示方法的靈敏度。ε↑，其測定118

一般情況下，多采用相對靈敏度來表示。相對靈敏度是以喹啉硫酸氫鹽的0.05mol/L硫酸溶液為標(biāo)準(zhǔn)，并定為1，然后與相同濃度熒光物質(zhì)的熒光強度比較，可求該物質(zhì)的相對靈敏度。

一般情況下，多采用相對靈敏度來表示。相對靈敏度119幾種物質(zhì)的熒光絕對靈敏度熒光物質(zhì)最大吸收波長/nm最大熒光波長/nm熒光光譜半寬度（H）μm-1熒光靈敏度（最大吸收波長）喹啉硫酸氫鹽(0.05mol·L-1H2SO4)2504610.470.066羅丹明B（酒精）5445710.170.88熒光素（0.1mol·L-1NaOH4905150.201.0四溴熒光素（0.1mol·L-1NaOH5185400.180.19硫堇(0.05mol·L-1H2SO4)5986210.180.031

幾種物質(zhì)的熒光絕對靈敏度熒光物質(zhì)最大吸收波長最大熒光波長熒120

3.

熒光分析法的選擇性很多分子在紫外可見區(qū)有吸收，但其中只有一部分能再發(fā)射熒光或磷光，故熒光法固有干擾很少，選擇性較好。

3.

熒光分析法的選擇性1211.無機化合物很多金屬（除鈾鹽等）和非金屬可同有機化合物形成熒光配合物，測量發(fā)射的熒光可定量分析。熒光法可測元素：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Pb、Rh、Ru、S、Se、Sb、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn和Zr等。還有一些無機離子如氟和氰離子等能使其它物質(zhì)的熒光由于熄滅效應(yīng)而減弱。據(jù)此可測氟和氰等離子的濃度。(二)熒光分析法的應(yīng)用1.無機化合物(二)熒光分