第十六章-基因診斷技術(shù)及其應(yīng)用課件

第十六章基因診斷技術(shù)及其應(yīng)用

基因診斷是利用DNA分子雜交等分子生物學(xué)技術(shù)，直接探查人體基因組DNA存在的缺陷或是基因表達(dá)產(chǎn)物的異常，從而對人體狀態(tài)和疾病作出診斷。基因診斷也稱DNA診斷或DNA探針技術(shù)或基因探針技術(shù)，是20世紀(jì)70年代末迅速發(fā)展起來的一項應(yīng)用技術(shù)。快速靈敏、準(zhǔn)確可靠的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)是基因診斷的先決條件。11第一節(jié)基因診斷的策略第二節(jié)基因診斷的常用技術(shù)方法第三節(jié)基因診斷的應(yīng)用

2第一節(jié)基因診斷的策略2

第一節(jié)基因診斷的策略一、基因突變的檢測當(dāng)致病基因已和分子機(jī)制均確知時，直接檢測和分析突變是分子診斷最有力和最準(zhǔn)確的方法?；蛲蛔儥z測法可檢測基因大片段缺失和插入、小片段缺失和插入、點突變(只有一種類型的點突變，或像N-ras突變那樣，突變類型很多但只有一兩種占優(yōu)勢，或發(fā)生在限制酶識別位點上使酶切位點消失，或發(fā)生在隱蔽位點上使酶切位點增加、異?；蛑嘏藕彤惓；蛉诤系鹊臋z測。較大片段用Southern印跡法或PCR法。單個外顯子突變采用雙3第一節(jié)基因診斷的策略3引物PCR法，多個外顯子突變采用multiplexPCR進(jìn)行電泳條帶分析，單個突變點采用PCR-SSCP法。測mRNA用RT-PCR法。二、基因連鎖分析由于同一染色體上相鄰近的基因一起被遺傳而相互存在連鎖關(guān)系，在只知致病基因在染色體上的大概位置而不知確切位置的情況下，只要鑒定與致病基因相連鎖的有關(guān)基因的存在與否，就可以判斷受檢者是否帶有致病基因。常采用限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）遺傳標(biāo)志進(jìn)行多態(tài)性分析。4引物PCR法，多個外顯子突變采用multiplexPCR進(jìn)行三、感染性疾病外源基因的檢測這類檢測一般根據(jù)已知病原生物基因組外源DNA或RNA順序，采用PCR或RT-PCR的方法就可以進(jìn)行快速、簡便而準(zhǔn)確的診斷。因此，這類疾病的基因診斷應(yīng)用性極強(qiáng)，在嚴(yán)格掌握質(zhì)控的前提下，可在臨床廣泛運用。四、基因異常表達(dá)的檢測用mRNA作標(biāo)本，采用RT-PCR法進(jìn)行半定量和定量分析判斷基因表達(dá)異常。5三、感染性疾病外源基因的檢測5第二節(jié)基因診斷的常用技術(shù)方法一、核酸分子雜交技術(shù)㈠限制性內(nèi)切酶酶譜分析法(圖16-1)

6第二節(jié)基因診斷的常用技術(shù)方法6此方法是利用限制性內(nèi)切酶和特異性DNA探針來檢測是否存在基因變異。當(dāng)待測DNA序列中發(fā)生突變時會導(dǎo)致某些限制性內(nèi)切酶位點的改變，其特異的限制性酶切片段的狀態(tài)(片段的大小或多少)在電泳遷移率上也會隨之改變，借此可作出分析診斷。㈡DNA限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragnentlengthpolymor-phism,RFLP)分析在人類基因組中，平均約200對堿基可發(fā)生一對變異(稱為中性突變)，中性突變導(dǎo)致個體間核苷酸序列的差異，稱為DNA多態(tài)性。不少DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別位點上，酶解該DNA片段就會產(chǎn)生長度不同的片段，稱為限制性片段長度多態(tài)性。7此方法是利用限制性內(nèi)切酶和特異性DNA探針來檢測是否㈢等位基因特異寡核苷酸探針(allelespecificoligonucleotide,ASO)雜交法根據(jù)已知基因突變位點的核苷酸序列，人工合成兩種寡核苷酸探針，一種是相應(yīng)于突變基因堿基序列的寡核苷酸(M)，一種是相應(yīng)于正常基因堿基序列的寡核苷酸(N)，用它們分別與受檢者DNA進(jìn)行分子雜交。8㈢等位基因特異寡核苷酸探針(allelespecific二、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(圖16-2)根據(jù)待測基因兩端的DNA順序設(shè)計出一對引物，經(jīng)PCR反應(yīng)將目的基因片段擴(kuò)增出來，即可進(jìn)一步分析判斷致病基因的存在與否，并了解其變異的形式。9二、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(圖16-2)9三、基因測序分離出患者的有關(guān)基因，測定出其堿基排列順序，找出其變異所在，這是最為確切的基因診斷方法。10三、基因測序10第四節(jié)基因診斷的應(yīng)用一、基因診斷在惡性腫瘤中的應(yīng)用㈠惡性腫瘤的特異性基因診斷在慢粒白血病中，具有t(9;22)染色體的易位及所產(chǎn)生的bcr-abl融合基因，因此可用檢測特殊融合基因的方法進(jìn)行某些白血病的診斷。在淋系白血病中存在大的Ig或TCR基因的V-(D)-J組合可作為B、T白血病的克隆標(biāo)志。應(yīng)用Southern雜交或PCR方法可檢測這些標(biāo)志。11第四節(jié)基因診斷的應(yīng)用11㈡惡性腫瘤相關(guān)基因分析因此，通過對腫瘤相關(guān)基因的分析如癌基因，抑癌基因，凋亡和抗凋亡基因缺失，插入，擴(kuò)增突變，表達(dá)過量。同樣可對臨床起到鑒別診斷、判斷預(yù)后的作用，如對兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)上皮瘤所進(jìn)行的鑒別診斷。

神經(jīng)母細(xì)胞瘤神經(jīng)上皮瘤N-myc-mRNA表達(dá)高極低C-myc-mRNA表達(dá)無高12㈡惡性腫瘤相關(guān)基因分析神經(jīng)母細(xì)胞瘤神經(jīng)上皮瘤N-myc-m㈢惡性腫瘤的分子病理學(xué)診斷原位雜交在腫瘤病理診斷中的應(yīng)用至少包括如下幾個方面：1.

腫瘤病毒的檢出：肝穿刺查乙肝病毒2.腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)改變的檢測:FISH查標(biāo)記染色體3.

細(xì)胞內(nèi)基因結(jié)構(gòu)和量的改變的檢測：4.

基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測RT-PCR原位雜交5.腫瘤分化程度的確定：RT-PCR定量分析查轉(zhuǎn)錄拷貝數(shù)6.

實體瘤中抗藥性腫瘤細(xì)胞的定位檢測多重耐藥基因（MDR1）基因擴(kuò)增與表達(dá)的檢測13㈢惡性腫瘤的分子病理學(xué)診斷13提問與解答環(huán)節(jié)QuestionsAndAnswers14提問與解答環(huán)節(jié)14謝謝聆聽·學(xué)習(xí)就是為了達(dá)到一定目的而努力去干,是為一個目標(biāo)去戰(zhàn)勝各種困難的過程,這個過程會充滿壓力、痛苦和挫折LearningIsToAchieveACertainGoalAndWorkHard,IsAProcessToOvercomeVariousDifficultiesForAGoal15謝謝聆聽LearningIsToAchieveAC第十六章基因診斷技術(shù)及其應(yīng)用

基因診斷是利用DNA分子雜交等分子生物學(xué)技術(shù)，直接探查人體基因組DNA存在的缺陷或是基因表達(dá)產(chǎn)物的異常，從而對人體狀態(tài)和疾病作出診斷。基因診斷也稱DNA診斷或DNA探針技術(shù)或基因探針技術(shù)，是20世紀(jì)70年代末迅速發(fā)展起來的一項應(yīng)用技術(shù)?？焖凫`敏、準(zhǔn)確可靠的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)是基因診斷的先決條件。161第一節(jié)基因診斷的策略第二節(jié)基因診斷的常用技術(shù)方法第三節(jié)基因診斷的應(yīng)用

17第一節(jié)基因診斷的策略2

第一節(jié)基因診斷的策略一、基因突變的檢測當(dāng)致病基因已和分子機(jī)制均確知時，直接檢測和分析突變是分子診斷最有力和最準(zhǔn)確的方法?；蛲蛔儥z測法可檢測基因大片段缺失和插入、小片段缺失和插入、點突變(只有一種類型的點突變，或像N-ras突變那樣，突變類型很多但只有一兩種占優(yōu)勢，或發(fā)生在限制酶識別位點上使酶切位點消失，或發(fā)生在隱蔽位點上使酶切位點增加、異常基因重排和異?；蛉诤系鹊臋z測。較大片段用Southern印跡法或PCR法。單個外顯子突變采用雙18第一節(jié)基因診斷的策略3引物PCR法，多個外顯子突變采用multiplexPCR進(jìn)行電泳條帶分析，單個突變點采用PCR-SSCP法。測mRNA用RT-PCR法。二、基因連鎖分析由于同一染色體上相鄰近的基因一起被遺傳而相互存在連鎖關(guān)系，在只知致病基因在染色體上的大概位置而不知確切位置的情況下，只要鑒定與致病基因相連鎖的有關(guān)基因的存在與否，就可以判斷受檢者是否帶有致病基因。常采用限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）遺傳標(biāo)志進(jìn)行多態(tài)性分析。19引物PCR法，多個外顯子突變采用multiplexPCR進(jìn)行三、感染性疾病外源基因的檢測這類檢測一般根據(jù)已知病原生物基因組外源DNA或RNA順序，采用PCR或RT-PCR的方法就可以進(jìn)行快速、簡便而準(zhǔn)確的診斷。因此，這類疾病的基因診斷應(yīng)用性極強(qiáng)，在嚴(yán)格掌握質(zhì)控的前提下，可在臨床廣泛運用。四、基因異常表達(dá)的檢測用mRNA作標(biāo)本，采用RT-PCR法進(jìn)行半定量和定量分析判斷基因表達(dá)異常。20三、感染性疾病外源基因的檢測5第二節(jié)基因診斷的常用技術(shù)方法一、核酸分子雜交技術(shù)㈠限制性內(nèi)切酶酶譜分析法(圖16-1)

21第二節(jié)基因診斷的常用技術(shù)方法6此方法是利用限制性內(nèi)切酶和特異性DNA探針來檢測是否存在基因變異。當(dāng)待測DNA序列中發(fā)生突變時會導(dǎo)致某些限制性內(nèi)切酶位點的改變，其特異的限制性酶切片段的狀態(tài)(片段的大小或多少)在電泳遷移率上也會隨之改變，借此可作出分析診斷。㈡DNA限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragnentlengthpolymor-phism,RFLP)分析在人類基因組中，平均約200對堿基可發(fā)生一對變異(稱為中性突變)，中性突變導(dǎo)致個體間核苷酸序列的差異，稱為DNA多態(tài)性。不少DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別位點上，酶解該DNA片段就會產(chǎn)生長度不同的片段，稱為限制性片段長度多態(tài)性。22此方法是利用限制性內(nèi)切酶和特異性DNA探針來檢測是否㈢等位基因特異寡核苷酸探針(allelespecificoligonucleotide,ASO)雜交法根據(jù)已知基因突變位點的核苷酸序列，人工合成兩種寡核苷酸探針，一種是相應(yīng)于突變基因堿基序列的寡核苷酸(M)，一種是相應(yīng)于正?；驂A基序列的寡核苷酸(N)，用它們分別與受檢者DNA進(jìn)行分子雜交。23㈢等位基因特異寡核苷酸探針(allelespecific二、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(圖16-2)根據(jù)待測基因兩端的DNA順序設(shè)計出一對引物，經(jīng)PCR反應(yīng)將目的基因片段擴(kuò)增出來，即可進(jìn)一步分析判斷致病基因的存在與否，并了解其變異的形式。24二、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(圖16-2)9三、基因測序分離出患者的有關(guān)基因，測定出其堿基排列順序，找出其變異所在，這是最為確切的基因診斷方法。25三、基因測序10第四節(jié)基因診斷的應(yīng)用一、基因診斷在惡性腫瘤中的應(yīng)用㈠惡性腫瘤的特異性基因診斷在慢粒白血病中，具有t(9;22)染色體的易位及所產(chǎn)生的bcr-abl融合基因，因此可用檢測特殊融合基因的方法進(jìn)行某些白血病的診斷。在淋系白血病中存在大的Ig或TCR基因的V-(D)-J組合可作為B、T白血病的克隆標(biāo)志。應(yīng)用Southern雜交或PCR方法可檢測這些標(biāo)志。26第四節(jié)基因診斷的應(yīng)用11㈡惡性腫瘤相關(guān)基因分析因此，通過對腫瘤相關(guān)基因的分析如癌基因，抑癌基因，凋亡和抗凋亡基因缺失，插入，擴(kuò)增突變，表達(dá)過量。同樣可對臨床起到鑒別診斷、判斷預(yù)后的作用，如對兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)上皮瘤所進(jìn)行的鑒別診斷。

神經(jīng)母細(xì)胞瘤神經(jīng)上皮瘤N-myc-mRNA表達(dá)高極低C-myc-mRNA表達(dá)無高27㈡惡性腫瘤相關(guān)基因分析神經(jīng)母細(xì)胞瘤神經(jīng)上皮瘤N-myc-m㈢惡性腫瘤的分子病理學(xué)診斷原位雜交在腫瘤病理診斷中的應(yīng)用至少包括如下幾個方面：1.

腫瘤病毒的檢出：肝穿刺查乙肝病毒2.腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)改變的檢測:FISH查標(biāo)記染色體3.

細(xì)胞內(nèi)基因結(jié)構(gòu)和量的改變的檢測：4.

基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測RT-PCR原位雜交5.腫瘤分化程度的確定：RT-PCR定量分析查轉(zhuǎn)錄拷貝數(shù)6.

實體瘤中抗藥性腫瘤細(xì)胞的定位檢測多重耐藥基因（MDR1）基因擴(kuò)增