發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌

第三節(jié)發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌發(fā)酵的一般流程種子擴大培養(yǎng)培養(yǎng)基配制空氣除菌培養(yǎng)基滅菌發(fā)酵生產(chǎn)下游處理發(fā)酵設(shè)備發(fā)酵設(shè)備——發(fā)酵罐發(fā)酵罐的特點軸封嚴密，泄漏少能承受一定壓力、溫度攪拌通風(fēng)裝置保證氣液充分混合具有足夠的冷卻面積死角少，滅菌徹底適宜的徑高比（高與直徑的比值為2.5—4）發(fā)酵罐的類型攪拌釜反應(yīng)器鼓泡式反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器發(fā)酵輔助設(shè)備無菌空氣系統(tǒng)無菌空氣的要求滅菌系統(tǒng)、管道、閥門培養(yǎng)基及其滅菌培養(yǎng)基（medium）培養(yǎng)基的成分碳源、氮源、無機鹽、前體物、促進劑、抑制劑培養(yǎng)基的類型按組成按狀態(tài)按用途培養(yǎng)基滅菌空罐滅菌實罐滅菌連續(xù)滅菌：高溫短時第四節(jié)發(fā)酵工程制藥的

過程與控制種子子的的擴擴大大培培養(yǎng)養(yǎng)微生生物物發(fā)發(fā)酵酵方方式式分批批發(fā)發(fā)酵酵補料料分分批批發(fā)發(fā)酵酵半連連續(xù)續(xù)發(fā)發(fā)酵酵連續(xù)續(xù)發(fā)發(fā)酵酵發(fā)酵酵過過程程中中的的中中間間分分析析項項目目產(chǎn)物物產(chǎn)產(chǎn)量量pH糖氨基基氮氮菌絲絲形形態(tài)態(tài)發(fā)酵酵過過程程的的影影響響因因素素及及控控制制菌體體濃濃度度營養(yǎng)養(yǎng)物物質(zhì)質(zhì)溫度度pH溶氧氧泡沫沫染菌菌發(fā)酵酵終終點點的的判判斷斷菌體體濃濃度度在適適合合的的生生長長速速率率下下，，發(fā)發(fā)酵酵產(chǎn)產(chǎn)物物的的產(chǎn)產(chǎn)率率與與菌菌體體濃濃度度成成正正比比關(guān)關(guān)系系。。特特別別是是初初級級代代謝謝產(chǎn)產(chǎn)物物。。菌體體濃濃度度過過低低，，產(chǎn)產(chǎn)物物產(chǎn)產(chǎn)率率下下降降。。菌體體濃濃度度過過高高，，產(chǎn)產(chǎn)生生其其他他影影響響。。措施施：：調(diào)調(diào)節(jié)節(jié)培培養(yǎng)養(yǎng)基基中中的的營營養(yǎng)養(yǎng)物物質(zhì)質(zhì)的的濃濃度度。。營養(yǎng)養(yǎng)物物質(zhì)質(zhì)碳源源氮源源磷酸酸鹽鹽：：生生長長亞亞適適量量濃濃度度補料料：：半半饑饑餓餓狀狀態(tài)態(tài)溫度度考慮慮菌菌種種及及生生長長階階段段綜合合考考慮慮其其他他培培養(yǎng)養(yǎng)條條件件考慮慮菌菌種種生生長長情情況況發(fā)酵酵熱熱pH補加加酸酸或或堿堿和和補補料料的的方方式式溶氧氧和和CO2溶氧氧異異常常下下降降溶氧氧異異常常上上升升措施施泡沫沫負面面影影響響措施施染菌菌發(fā)酵酵前前期期染染菌菌發(fā)酵酵后后期期染染菌菌發(fā)酵酵終終點點的的判判斷斷提高高產(chǎn)產(chǎn)物物的的產(chǎn)產(chǎn)量量和和經(jīng)經(jīng)濟濟效效益益降低低生生產(chǎn)產(chǎn)成成本本主要要指指標標與與中中間間分分析析項項目目雷雷同同第五五節(jié)節(jié)發(fā)發(fā)酵酵工工業(yè)業(yè)中中的的代代謝謝調(diào)調(diào)控控代謝謝調(diào)調(diào)控控運用用人人為為的的方方法法對對微微生生物物的的代代謝謝調(diào)調(diào)節(jié)節(jié)系系統(tǒng)統(tǒng)進進行行遺遺傳傳改改造造和和條條件件的的控控制制，，在在保保證證微微生生物物適適當當生生長長的的條條件件下下，，建建立立新新的的代代謝謝方方式式，，以以期期按按照照人人們們的的意意志志有有目目的的地地過過量量積積累累所所需需的的代代謝謝產(chǎn)產(chǎn)物物，，提提高高生生產(chǎn)產(chǎn)效效率率。。初級級代代謝謝能使使營營養(yǎng)養(yǎng)物物質(zhì)質(zhì)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變變成成機機體體的的結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)物物質(zhì)質(zhì)和和對對機機體體具具有有生生理理活活性性作作用用的的物物質(zhì)質(zhì)，，或或是是為為機機體體生生長長提提供供能能量量的的一一類類代代謝謝。。次級級代代謝謝存在在于于某某些些生生物物中中（（如如某某些些植植物物和和微微生生物物）），，并并在在一一定定的的生生長長期期內(nèi)內(nèi)出出現(xiàn)現(xiàn)的的一一類類代代謝謝。。在在抵抵御御惡惡劣劣環(huán)環(huán)境境、、偽偽裝裝躲躲避避、、清清除除自自身身毒毒素素和和排排泄泄物物時時很很重重要要。。微生生物物初初級級代代謝謝與與次次級級代代謝謝的的關(guān)關(guān)系系多糖、蛋白白質(zhì)、脂肪肪、無機鹽鹽初級代謝中中間產(chǎn)物（（單糖、氨氨基酸、核核苷酸、脂脂肪酸）蛋白質(zhì)、核核酸、粘多多糖、脂多多糖等生物物大分子分解合成成分解代謝生物合成生長抗生素、生生物堿、色色素、毒素素等次級代代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物合合成的調(diào)控控初級代謝對對次級代謝謝的調(diào)節(jié)碳代謝物的的調(diào)節(jié)氮代謝物的的調(diào)節(jié)磷酸鹽的調(diào)調(diào)節(jié)ATP的調(diào)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)物調(diào)節(jié)節(jié)末端產(chǎn)物的的反饋調(diào)節(jié)節(jié)細胞膜通透透性調(diào)節(jié)其他：金屬屬離子、溶溶解氧等的的調(diào)節(jié)初級代謝對對次級代謝謝的調(diào)節(jié)次級代謝產(chǎn)產(chǎn)物以初級級代謝產(chǎn)物物為母體衍衍生而來。。次級代謝產(chǎn)產(chǎn)物合成反反應(yīng)的酶由由初級代謝謝途徑的酶酶演化而來來。因此，初級級代謝終產(chǎn)產(chǎn)物的過量量往往會抑抑制次級代代謝產(chǎn)物的的合成。碳代謝物的的調(diào)節(jié)葡萄糖效應(yīng)應(yīng)解除方法變更速效碳碳源和遲效效碳源的配配比；流加葡萄糖糖。氮代謝物的的調(diào)節(jié)分解代謝物物阻遏效應(yīng)應(yīng)解除方法變更速效氮氮源和遲效效氮源的配配比；流加無機氮氮。磷酸鹽的調(diào)調(diào)節(jié)磷酸鹽效應(yīng)應(yīng)：類似于于葡萄糖效效應(yīng)機制：促進初級代代謝、抑制制次級代謝謝抑制次級代代謝產(chǎn)物前前體的形成成阻遏某些關(guān)關(guān)鍵酶的合合成抑制某些關(guān)關(guān)鍵酶的活活性增加菌體能能荷狀態(tài)ATP的調(diào)調(diào)節(jié)直接影響次次級代謝產(chǎn)產(chǎn)物合成和和糖代謝中中某些酶的的活性。如四環(huán)素的的合成。誘導(dǎo)物調(diào)節(jié)節(jié)某些參與次次級代謝產(chǎn)產(chǎn)物合成的的酶為誘導(dǎo)導(dǎo)酶。需有誘導(dǎo)物物存在，誘誘導(dǎo)酶才能能形成。如甲硫氨酸酸誘導(dǎo)頭孢孢菌素C。。末端產(chǎn)物的的反饋調(diào)節(jié)節(jié)末端產(chǎn)物抑抑制合成途途徑中的第第一個酶的的活性，從從而降低產(chǎn)產(chǎn)物合成代代謝的能力力。原位產(chǎn)物分分離偶聯(lián)技技術(shù)（insituproductremoval，ISPR）細胞膜通透透性調(diào)節(jié)利于代謝產(chǎn)產(chǎn)物分泌到到胞外，減減少胞內(nèi)濃濃度，從而而避免末端端產(chǎn)物的反反饋調(diào)節(jié)。。如：谷氨酸酸的生產(chǎn)，，采取控制制生物素濃濃度、添加加青霉素、、添加吐溫溫80等表表面活性劑劑、選育油油酸缺陷型型菌株等方方法?？股氐陌l(fā)發(fā)酵生產(chǎn)抗生素的定定義生物在其生生產(chǎn)活動過過程中所產(chǎn)產(chǎn)生，并能能在低微濃濃度下有選選擇性地抑抑制或殺滅滅其他微生生物或腫瘤瘤細胞的有有機物。發(fā)展歷史1929年年，英國弗弗萊明發(fā)現(xiàn)現(xiàn)青霉素。。二戰(zhàn)期間間，大規(guī)模模發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)，世界上上最早用于于臨床的抗抗生素。。20世紀60-70年代，利利用生物合合成和半合合成方法研研制抗生素素衍生物。。20世紀80年代至至今，根據(jù)據(jù)作用機理理理性篩選選階段，包包括耐藥篩篩選模型等等?？股氐姆址诸惛鶕?jù)抗生素素的生物來來源分根據(jù)抗生素素的作用對對象分根據(jù)抗生素素的作用機機制分根據(jù)抗生素素的化學(xué)結(jié)結(jié)構(gòu)分根據(jù)抗生素素的生物來來源分放線菌產(chǎn)生生的抗生素素：鏈霉素素、四環(huán)素素、紅霉素素真菌產(chǎn)生的的抗生素：：青霉素、、頭孢菌素素細菌菌產(chǎn)生生的抗生素素：多粘菌菌素、桿菌菌肽根據(jù)抗生素素的作用對對象分抗G+的抗抗生素：青青霉素、紅紅霉素抗G-的抗抗生素：鏈鏈霉素、多多粘菌素廣譜抗生素素：氨芐青青霉素抗真菌抗生生素：兩性性霉素抗病毒和噬噬菌體抗生生素：氯霉霉素、艾霉霉素抗原蟲抗生生素：滅滴滴蟲素抗癌抗生素素：阿霉素素、博萊霉霉素根據(jù)抗生素素的作用機機制分抑制細胞壁壁合成：青青霉素、頭頭孢菌素抑制細胞膜膜功能：多多粘菌素干擾蛋白質(zhì)質(zhì)合成：四四環(huán)素抑制核酸合合成：博博萊霉素、、利福霉素素抑制生物能能作用：抗抗霉素根據(jù)抗生素素的化學(xué)結(jié)結(jié)構(gòu)分β-內(nèi)酰胺胺類：青霉霉素類、頭頭孢菌素類類氨基糖苷類類：鏈霉素素、慶大霉霉素大環(huán)內(nèi)酯類類：紅霉素素、麥迪加加霉素四環(huán)類：四四環(huán)素、土土霉素多肽類：多多粘菌素HNONSCH3CH3HCOO-H-lactamringβ-內(nèi)酰胺環(huán)RnaturalpenicillinR=CH2-CO-β-內(nèi)酰胺胺類抗生素素的結(jié)構(gòu)特特征氨芐青霉素素甲氧苯青霉霉素羧芐青霉素素苯唑西林大環(huán)內(nèi)酯類類和四環(huán)類類抗生素的的結(jié)構(gòu)特征征β-內(nèi)酰胺胺類抗生素素的生物合合成L-α-氨基己己二酸+L-半半胱氨酸+L-纈氨酸ACV三肽肽ACV合成成酶異青霉素N(IPN)異青霉素合合成酶6-APA青霉素N，，…青霉素G頭孢菌素Cβ-內(nèi)酰胺胺類抗生素素的代謝調(diào)調(diào)控碳源分解代代謝物阻遏遏賴氨酸的反反饋調(diào)節(jié)：：共同中間間體L-甲硫氨氨酸對頭孢孢菌素C的的誘導(dǎo)作用用頭孢菌素C的擴環(huán)/羥化雙功功能酶需Fe2+，分子氧等等輔助因子子纈氨酸是青青霉素生物物合成的前前體青霉素的發(fā)發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程工藝控制要要點生產(chǎn)種子的的制備絲狀菌的生生產(chǎn)種子是是由保藏在在低溫的冷冷凍安瓿管管經(jīng)甘油、、葡萄糖、、蛋白胨斜斜面移植到到?。ù螅┟坠腆w培培養(yǎng)基上，，25℃培養(yǎng)7天天，真空干干燥并以這這種形式保保存?zhèn)溆?。。生產(chǎn)時按按10%接接種量移種種到含有葡葡萄糖、玉玉米漿、尿尿素為主的的種子罐內(nèi)內(nèi)，26℃℃培養(yǎng)至菌菌絲濃度度達6-8%，菌絲絲形態(tài)正常常，按10-15%的接種種量移入含含有花生餅餅粉、葡萄萄糖為主的的二級種子子罐內(nèi)，27℃培養(yǎng)養(yǎng)至菌絲絲濃度10-12%，形態(tài)正正常，即可可作為發(fā)酵酵種子。培養(yǎng)基成分分的控制碳源產(chǎn)黃青霉菌菌可利用的的碳源有乳乳糖、蔗糖糖、葡萄糖糖等。目前前生產(chǎn)上普普遍采用的的是淀粉水水解液、糖糖化液為碳碳源，進行行連續(xù)流加加的方式。。氮源氮源常選用用玉米漿、、精制棉籽籽餅粉、麩麩皮，并補補加無機氮氮源（硫酸酸氨、氨水水或尿素））。前體生物合成含含有芐基基基團的青霉霉素G，需需在發(fā)酵液液中加入前前體。前體體可用苯乙乙酸、苯乙乙酰胺，一一次加入量量不大于0.1%，，并采用多多次加入，，以防止前前體對青霉霉素的毒害害。無機鹽加入的無機機鹽包括硫硫、磷、鈣鈣、鎂、鉀鉀等,且且用量要適適度。另外外，由于鐵鐵離子對青青霉菌有毒毒害作用,必須嚴嚴格控制鐵鐵離子的濃濃度，一般般控制在30μg/ml。。發(fā)酵培養(yǎng)的的控制加糖控制加糖量的控控制是根據(jù)據(jù)殘?zhí)橇考凹鞍l(fā)酵過程程中的pH值確確定。最好好是根據(jù)排排氣中CO2量及O2量來控制，，一般在在殘?zhí)墙抵林?.6%左右右，pH值值上升時時開始加糖糖。加糖率：0.07-0.15%，每2h一次或或連續(xù)流加加。補氮及加前前體補氮是指加加硫酸銨、、氨水或尿尿素。發(fā)酵酵60-70開始補補加，使發(fā)發(fā)酵液氨基基氮控制在在0.01%-0.05%。。發(fā)酵8-12h后補補前體，以以使發(fā)酵液液中殘存苯苯乙酰胺濃濃度為0.05%-0.08%。pH值控控制一般為pH6.5-6.9，盡量避避免超過pH7.0。pH上升可可以補加葡葡萄糖或天天然油脂來來控制；pH下降則則提高通氣氣量，或補補加氨水和和碳酸鈣來來控制。目前生產(chǎn)上上趨于采用用直接加酸酸或加堿自自動控制pH。溫度控制前期25-26℃，后期23℃，，以減少后后期發(fā)酵液液中青霉素素的降解破破壞。溶解氧和攪攪拌速率的的控制一般要求發(fā)發(fā)酵中溶解解氧量不低低于飽和溶溶解氧的30%。通通風(fēng)比一般般為1:0.8vvm。攪拌轉(zhuǎn)速在在發(fā)酵各階階段應(yīng)根據(jù)據(jù)需要而調(diào)調(diào)整。泡沫的控制制在發(fā)酵過程程中產(chǎn)生大大量泡沫，，可以用天天然油脂，，如豆油、、玉米油等等或用化學(xué)學(xué)合成消泡泡劑“泡敵敵”來消泡泡，應(yīng)當控控制其用量量并要少量多次加入，尤其其在發(fā)酵前前期不宜多多用，否則則會影響菌菌體的呼吸吸代謝。發(fā)酵液質(zhì)量量控制生產(chǎn)上按規(guī)規(guī)定時間從從發(fā)酵罐中中取樣，用用顯微鏡觀觀察菌絲形形態(tài)變化來來控制發(fā)酵酵。生產(chǎn)上上慣稱“鏡鏡檢”，根根據(jù)“鏡檢檢”中菌絲絲形變化和和代謝變化化的其他指指標調(diào)節(jié)發(fā)發(fā)酵溫度，，通過追加加糖或補加加前體等各各種措施來來延長發(fā)酵酵時間，以以獲得最多多青霉素。。青霉素素的提提取純純化工工藝發(fā)酵液液的過過濾和和預(yù)處處理低溫過濾：：鼓式式過濾濾或板板框過過濾雜蛋白白去除除：硫硫酸調(diào)調(diào)pH4.5-5.0，，0.07%絮絮凝劑劑PPB和和0.07%硅硅藻土土二次次過濾濾。萃取乙酸丁丁酯（（BA）二二次萃萃取法法一次萃萃?。海簆H1.8-2.2，，濃縮縮倍數(shù)數(shù)1.5-2.0。。反萃取?。簆H6.8-7.2，濃濃縮倍倍數(shù)3-4。二次萃萃取：：pH1.8-2.2，濃濃縮倍倍數(shù)2-2.5。萃取方方式：：多級級逆流流萃取取結(jié)晶結(jié)晶方方法：：堿金金屬鹽鹽法和和普羅羅卡因因鹽法法堿金屬屬鹽法法：二二次BA萃萃取液液中加加入乙乙酸鉀鉀或乙乙酸鈉鈉的乙乙醇溶溶液，，青霉霉素鉀鉀鹽或或鈉鹽鹽結(jié)晶晶析出出。重結(jié)晶晶方法法：真真空共共沸蒸蒸餾結(jié)結(jié)晶法法普羅卡卡因鹽鹽法：：在青青霉素素鉀鹽鹽的水水溶液液中（（pH中性性）加加入鹽鹽酸普普羅卡卡因溶溶液，，普羅羅卡因因青霉霉素結(jié)結(jié)晶析析出。。其他微微生物物藥物物的發(fā)發(fā)酵生生產(chǎn)頭孢菌菌素C氨基酸酸：谷谷氨酸酸、賴賴氨酸酸維生素素：B1、B2、B12思考題題1.代代謝產(chǎn)產(chǎn)物合合成的的主要要受哪哪些方方面的的調(diào)控控？2.青青霉素素發(fā)酵酵生產(chǎn)產(chǎn)要點點有哪哪些？？9、靜夜四無無鄰，荒居居舊業(yè)貧。。。12月-2212月-22Thursday,December29,202210、雨雨中中黃黃葉葉樹樹，，燈燈下下白白頭頭人人。。。。04:48:3004:48:3004:4812/29/20224:48:30AM11、以以我我獨獨沈沈久久，，愧愧君君相相見見頻頻。。。。12月月-2204:48:3004:48Dec-2229-Dec-2212、故人人江海海別，，幾度度隔山山川。。。04:48:3004:48:3004:48Thursday,December29,202213、乍見翻疑疑夢，相悲悲各問年。。。12月-2212月-2204:48:3004:48:30December29,202214、他鄉(xiāng)生生白發(fā)，，舊國見見青山。。。29十十二月20224:48:30上午午04:48:3012月-2215、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。十二月224:48上上午12月-2204:48December29,202216、行動出成成果，工作作出財富。。。2022/12/294:48:3004:48:3029December202217、做做前前，，能能夠夠環(huán)環(huán)視視四四周周；；做做時時，，你你只只能能或或者者最最好好沿沿著著以以腳腳為為起起點點的的射射線線向向前前。。。。4:48:30上上午午4:48上上午午04:48:3012月月-229、沒有失失敗，只只有暫時時停止成成功！。。12月-2212月-22Thursday,December29,202210、很多事事情努力力了未必必有結(jié)果果，但是是不努力力卻什么么改變也也沒有。。。04:48:3004:48:3004:4812/29/20224:48:30AM11、成功就就是日復(fù)復(fù)一日那那一點點點小小努努力的積積累。。。12月-2204:48:3004:48Dec-2229-Dec-2212、世間成成事，不不求其絕絕對圓滿滿，留一一份不足足，可得得無限完完美。。。04:48:3004:48:3004:48Thursday,December29,202213、不不知知香香積積寺寺，，數(shù)數(shù)里里入入云云峰峰。。。。12月月-2212月月-2204:48:3004:48:30December29,202214、意志志堅強強的人人能把把世界界放在在手中中像泥泥塊一一樣任任意揉揉捏。。29十十二二月20224:48:30上上午04:48:3012月月-2215、楚塞塞三湘湘接，，荊門門九派派通。。。。十二月月224:48上上午午12月月-2204:48December29,202216、少少年年十十五五二二十十時時，，步步行行奪奪得得胡胡馬馬騎騎。。。。2022/12/294:48:3004:48:3029December202217、空山山新雨雨后，，天氣氣晚來來秋。。。4:48:30上上午4:48上上午午04:48:30