光譜分析法-研究生課件

常見現(xiàn)代儀器分析技術(shù)：光譜分析技術(shù)：紫外-可見分光光度計(jì)、熒光分析儀器、原子光譜分析儀顯微鏡:光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡分離分析技術(shù)：離心機(jī)、色譜儀、電泳儀、毛細(xì)管電泳儀細(xì)胞及分子生物學(xué)技術(shù)：培養(yǎng)箱、PCR基因擴(kuò)增儀波譜分析技術(shù)：質(zhì)譜儀常規(guī)儀器分析技術(shù)：生物安全柜、免疫分析儀2常見現(xiàn)代儀器分析技術(shù)：光譜分析技術(shù)：紫外-可見分光光度計(jì)、熒第一章

光譜分析法（Spectrum

Analysis）2第一章

光譜分析法（SpectrumAnalysis本章提要第一節(jié)光譜分析法概論第二節(jié)紫外/可見光吸收光譜法光譜分析法及其特點(diǎn)電磁輻射的基本性質(zhì)電磁輻射的特性光譜分析法的分類分子光譜法基本原理紫外/可見分光光度計(jì)構(gòu)造紫外/可見分光光度計(jì)類型3本章提要第一節(jié)光譜分析法概論第二節(jié)紫外/可見光吸收光譜法第三節(jié)

分子發(fā)光光譜法

光致發(fā)光

分子熒光和磷光光譜基本原理影響熒光強(qiáng)度的因素

分子熒光光譜儀

分子熒光光譜法的應(yīng)用磷光光譜法

化學(xué)發(fā)光法4本章提要第三節(jié)分子發(fā)光光譜法光致發(fā)光4本章提要第一節(jié)

光譜分析法概論5第一節(jié)5是電磁輻射按照波長的有序排列。光譜(spectrum)：第一節(jié)光譜分析法概論6是電磁輻光譜第一節(jié)光譜分析法概論6一、光譜分析法及其特點(diǎn)

光譜分析(spectralanalysis)：

對物質(zhì)發(fā)射輻射能的能譜分析或?qū)椛淠芘c物質(zhì)相互作用引起的能譜改變的分析。

電磁輻射范圍：射線（10-10m）～無線電波（103m）所有范圍；

相互作用方式：發(fā)射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等；

應(yīng)用：光譜分析法在研究物質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)表征、表面分析等方面具有其他方法不可區(qū)代的地位；7一、光譜分析法及其特點(diǎn)光譜分析(spectr（1）能源提供能量；（2）能量與被測物之間的相互作用；（3）產(chǎn)生信號。

基本特點(diǎn)：（1）所有光分析法均包含三個(gè)基本過程；（2）選擇性測量，不涉及混合物分離（不同于色譜分析）；（3）涉及大量光學(xué)元器件。三個(gè)基本過程：一、光譜分析法及其特點(diǎn)8（1）能源提供能量；三個(gè)基本過程：一、光譜分析法及其特點(diǎn)8二、電磁輻射的基本性質(zhì)

電磁輻射（電磁波）：以接近光速（真空中為光速）傳播的能量；

c=λν=ν/σ

E=hν=hc/λc：光速；λ：波長；ν：頻率；σ：波數(shù)；E：能量；h：普朗克常數(shù)

電磁輻射具有波動(dòng)性和微粒性（波粒二象性）；9二、電磁輻射的基本性質(zhì)電磁輻射（電磁波）：以接近光速三、輻射能的特性：

(1)吸收

物質(zhì)選擇性吸收特定頻率的輻射能，并從低能級躍遷到高能級；(2)發(fā)射

將吸收的能量以光的形式釋放出；

(3)散射

由傳播介質(zhì)的不均勻性引起的光線向四周射去；

(4)折射

折射是光在兩種介質(zhì)中的傳播速度不同；

(5)反射光射到不同的介質(zhì)介面時(shí)，部分光自介面射回原介質(zhì)中；

(6)干涉

干涉現(xiàn)象；(7)衍射

光繞過物體而彎曲地向他后面?zhèn)鞑サ默F(xiàn)象；

(8)偏振

只在一個(gè)固定方向有振動(dòng)的光。10三、輻射能的特性：(1)吸收物質(zhì)選擇性吸收特定頻率常用三種光分析法測量過程示意圖

11常用三種光分析法測量過程示意圖11四、光譜分析分類光譜分析法原子發(fā)射原子吸收原子熒光X射線熒光原子吸收紫外可見紅外可見核磁共振紫外可見紅外可見分子熒光分子磷光核磁共振化學(xué)發(fā)光原子發(fā)射原子熒光分子熒光分子磷光X射線熒光化學(xué)發(fā)光吸收光譜法發(fā)射光譜法原子光譜法分子光譜法12四、光譜分析分類光譜分析法原原原X原紫紅核紫紅分分核化原原分五、分子光譜法物質(zhì)分子內(nèi)部運(yùn)動(dòng)形式及其對應(yīng)能級1.電子相對于原子核的運(yùn)動(dòng)--電子能級;

單重態(tài)：激發(fā)態(tài)與基態(tài)中的電子自旋方向相反.

三重態(tài)：激發(fā)態(tài)與基態(tài)中的電子自旋方向相同.2.原子核在其平衡位置附近的相對振動(dòng)--振動(dòng)能級;3.分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動(dòng)--轉(zhuǎn)動(dòng)能級.13五、分子光譜法物質(zhì)分子內(nèi)部運(yùn)動(dòng)形式及其對應(yīng)能級13分子的能級圖與躍遷Sn:

電子能級Vn:

振動(dòng)能級Jn:

轉(zhuǎn)動(dòng)能級分子的總能量

=E電子+E振動(dòng)+E轉(zhuǎn)動(dòng)14分子的能級圖與躍遷Sn:電子能級Vn:振動(dòng)能級Jn:轉(zhuǎn)

分子光譜分析法的分類分子光譜分子吸收分子發(fā)光光致發(fā)光其它發(fā)光形式UV-Vis（紫外-可見）IR（紅外）如：熒光和磷光如：化學(xué)發(fā)光等15分子光譜分析法的分類分子光譜分子吸收分子發(fā)光光致發(fā)光其它發(fā)第二節(jié)

紫外/可見光吸收光譜法16第二節(jié)16紫外/可見光吸收光譜分析法：

利用溶液中分子吸收紫外和可見光產(chǎn)生躍遷所記錄的吸收光譜圖，可進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)分析，根據(jù)最大吸收波長強(qiáng)度變化可進(jìn)行定量分析。屬于分子吸收光譜法，分析波長范圍一般為200~800nm。歷史悠久、應(yīng)用廣泛：分析化學(xué)藥物分析臨床檢驗(yàn)等第二節(jié)紫外/可見光吸收光譜法17紫外/可見光吸收光譜分析法：歷史悠久、應(yīng)用廣泛：分析化學(xué)第二即光吸收基本定律朗伯定律:(1760)

A=lg(I0/It)=k1b

當(dāng)入射光的λ、吸光物質(zhì)的c一定時(shí)，溶液的吸光度A與液層厚度b成正比。比爾定律(1852)

A=lg(I0/It)=k2c

當(dāng)入射光的λ、液層厚度b

一定時(shí)，溶液的吸光度A與吸光物質(zhì)的c成正比。一、基本原理I0It入射光透過光18即光吸收基本定律朗伯定律:(1760)A=lg(I0朗伯-比爾定律意義:

當(dāng)一束平行單色光通過均勻、透明的吸光介質(zhì)時(shí)，其吸光度與吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度和吸收層厚度的乘積成正比。A=lg(I0/It)=kbc一、基本原理19朗伯-比爾定律意義:A=lg(I0/It)=kbc一、基透光率（透射比）T（Transmittance）A

=lg(I0/It)=lg(1/T)=-lgT

=kbc吸光度A

（Absorbance）一、基本原理20透光率（透射比）T（Transmittance）A=l吸光度A、透射比T與濃度c

的關(guān)系A(chǔ)T(%)cA=kbc1.00.80.60.40.2100

80

60

40

20一、基本原理21吸光度A、透射比T與濃度c的關(guān)系A(chǔ)T(%)cA=kbck吸光系數(shù)（Absorptivity）

（1）當(dāng)c的單位用g·L-1表示時(shí)，用a

表示，

A＝abca的單位:L·g-1·cm-1的單位:L·mol-1·cm-1（2）當(dāng)c的單位用mol·L-1表示時(shí)，用ε表示，

A＝ε

bc

（3）當(dāng)c的單位用g·100mL-1表示時(shí)，用表示,A＝bc，叫做比吸光系數(shù)。一、基本原理22k吸光系數(shù)（Absorptivity）（溶液濃度的測定A＝bc工作曲線法(校準(zhǔn)曲線)朗伯-比爾定律的分析應(yīng)用

01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx一、基本原理26溶液濃度的測定A＝bc工作曲線法朗伯-比爾定律的分析應(yīng)朗伯-比爾定律的適用條件1.單色光

應(yīng)選用max處或肩峰處測定。3.稀溶液

濃度增大，分子之間作用增強(qiáng)。2.吸光質(zhì)點(diǎn)形式不變

離解、絡(luò)合、締合會破壞線性關(guān)系,

應(yīng)控制條件(酸度、濃度、介質(zhì)等)。一、基本原理27朗伯-比爾定律的適用條件1.單色光3.稀溶液2吸光度的加和性與吸光度的測量

A=A1+A2+…+An用參比溶液調(diào)T=100%（A=0），再測樣品溶液的吸光度，即消除了吸收池對光的吸收、反射，溶劑、試劑對光的吸收等。一、基本原理28吸光度的加和性與吸光度的測量A=A1+A2+二、紫外/可見分光光度計(jì)主要部件光源單色器吸收池檢測系統(tǒng)分光光度計(jì)的基本組成習(xí)慣上將工作波段在200nm~800nm的分光光度計(jì)稱為紫外-可見分光光度計(jì)。優(yōu)點(diǎn)：通過色散原件（棱鏡或光柵）得到一束近似的單色光。波長可調(diào),故選擇性好,準(zhǔn)確度高。29二、紫外/可見分光光度計(jì)主要部件光源單色器吸收池檢測系統(tǒng)分光/nm鎢燈（熱輻射光源）4006008001000氙燈氫燈強(qiáng)度光源（發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜）

可見光區(qū)：鎢燈，鹵鎢燈(320～2500nm)

紫外區(qū)：氫燈(180～375nm)

氙燈、汞燈：紫外、可見光區(qū)均可用作光源要求：有足夠的光強(qiáng)度，穩(wěn)定。二、紫外/可見分光光度計(jì)主要部件30/nm鎢燈（熱輻射光源）4006008001000氙燈氫燈氙燈氫燈鎢燈31氙燈氫燈鎢燈31單色器（將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置）棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時(shí)折射率不同。玻璃350～3200nm,石英185～4000nm入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ2800600500400二、紫外/可見分光光度計(jì)主要部件32單色器（將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置）棱鏡：依據(jù)不光柵：（利用光通過光柵時(shí)發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光的裝置）光柵衍射示意圖光屏透鏡平面透射光柵M1M2出射狹縫在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。優(yōu)點(diǎn)：波長范圍寬，色散均勻，分辨性能好，使用方便。二、紫外/可見分光光度計(jì)主要部件33光柵：（利用光通過光柵時(shí)發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光的裝置）光柵檢流計(jì)（指示器）：低檔儀器：刻度顯示中高檔儀器：數(shù)字顯示，自動(dòng)掃描記錄檢測器：利用光電效應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)換成電流訊號。如：光電池，光電管，光電倍增管吸收池（比色皿）：用于盛待測及參比溶液。二、紫外/可見分光光度計(jì)主要部件34檢流計(jì)（指示器）：檢測器：利用光電效應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)換成電流訊號1.單光束分光光度計(jì)可變波長單光束紫外-可見分光光度計(jì)示意圖三、紫外/可見分光光度計(jì)的基本類型351.單光束分光光度計(jì)可變波長單光束紫外-可見分光光度計(jì)示意2.雙光束分光光度計(jì)參比池檢測器濾光片或單色器放大器樣品池光源

hv光子檢測器反光鏡反光鏡透明部分扇形鏡正面圖扇形鏡反光鏡柵鏡雙光束型可以消除光源強(qiáng)度變化的影響。可變波長雙光束紫外-可見分光光度計(jì)示意圖362.雙光束分光光度計(jì)參比池檢測器濾光片或放大器樣品池光源第三節(jié)

分子發(fā)光光譜法37第三節(jié)37分子發(fā)光光致發(fā)光化學(xué)發(fā)光生物發(fā)光光致發(fā)光（Photoluminescence）:物質(zhì)當(dāng)受到光的照射吸收了某種波長的光后，會發(fā)射出波長相同或比吸收波長更長的光，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。PhotoluminescenceMolecularLuminescenceChemiluminescenceBioluminescence38分子發(fā)光光致發(fā)光化學(xué)發(fā)光生物發(fā)光光致發(fā)光（Photolumi1575年，西班牙醫(yī)生N.Monardes發(fā)現(xiàn)。1852年，GeorgeStokes對熒光產(chǎn)生的機(jī)理作了解釋，并提出了“熒光”。1867年，分子熒光首次用于分析測定。1928年，Jette和West提出第一臺光電熒光計(jì)。1952年，商品熒光分光光度計(jì)出現(xiàn)。

分子熒光技術(shù)的發(fā)展391575年，西班牙醫(yī)生N.Monardes發(fā)現(xiàn)。分子熒光技TheDiscoveryandDevelopmentoftheGreenFluorescentProtein,（GFP）綠色熒光蛋白2008諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)OsamuShimomura1960sMartinChalfie1990sRogerY.Tsien’s,today40TheDiscoveryandDevelopment一、分子熒光（磷光）發(fā)生的原理41一、分子熒光（磷光）發(fā)生的原理41

。物質(zhì)的基態(tài)分子受一激發(fā)光源的照射被激發(fā)至激發(fā)態(tài)后，電子由第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級，以光的形式放出末態(tài)兩個(gè)能級的能量差額稱為熒光。基于化合物的熒光測量而建立起來的分析方法稱為分子熒光光譜法。42。物質(zhì)的基態(tài)分子受1.分子的多重態(tài)：單線態(tài)、激發(fā)單線態(tài)、激發(fā)三線態(tài)單線態(tài)(S0)

一個(gè)所有電子自旋都配對的分子的電子狀態(tài)。多數(shù)有機(jī)物分子的基態(tài)是單線態(tài)。當(dāng)基態(tài)一對電子的一個(gè)被激發(fā)到較高能級時(shí)，激發(fā)單線態(tài)(S)

自旋方向不改變，分子仍處于單線態(tài)。激發(fā)三線態(tài)(T)

有兩個(gè)電子的自旋不配對而平行的狀態(tài)。分子的激發(fā)與失活43分子的激發(fā)與失活43S0ST分子的多重態(tài)ET1<ES1

S0→T

：禁阻躍遷，進(jìn)入的幾率小；

M=2S+1

S:為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；電子激發(fā)態(tài)的多重度：44S0ST分子的多重態(tài)ET1<ES1M=2S+1無輻射躍遷振動(dòng)弛豫：激發(fā)態(tài)分子由同一電子能級中的較高振動(dòng)能級轉(zhuǎn)至較低振動(dòng)能級的過程，其效率較高。內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重態(tài)的兩個(gè)電子能級間，電子由高能級回到低能級的分子內(nèi)過程。系間竄越：同一電子能級激發(fā)態(tài)分子的電子自旋發(fā)生倒轉(zhuǎn)而使分子的多重態(tài)發(fā)生變化的過程。外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他溶質(zhì)相互作用、能量轉(zhuǎn)換而使熒光（或磷光）減弱甚至消失的過程。熒光強(qiáng)度的減弱或消失，稱為熒光熄滅（或猝滅）。

激發(fā)態(tài)分子的失活45無輻射躍遷激發(fā)態(tài)分子的失活45輻射躍遷熒光：受光激發(fā)的分子從第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。

由于是相同多重態(tài)之間的躍遷，幾率較大，速度大，速率常數(shù)kf為106~109s-1

。

磷光：從第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。

產(chǎn)生伴隨自旋多重態(tài)的改變，輻射速度遠(yuǎn)小于熒光，壽命較長。激發(fā)態(tài)分子的失活46輻射躍遷激發(fā)態(tài)分子的失活46熒光與磷光的產(chǎn)生過程47熒光與磷光的產(chǎn)生過程47圖熒光與磷光產(chǎn)生示意圖激發(fā)單線態(tài)激發(fā)三線態(tài)~~~~~~~S1T1S2S0吸收（A）熒光（F）磷光（P）λ2λ1λ3λ448圖熒光與磷光產(chǎn)生示意圖激發(fā)單線態(tài)激發(fā)三線態(tài)~~~~~~~S熒光S1→S0躍遷波長短幾率大速度較大壽命短，10-9~10-7s磷光

T1→S0躍遷波長長幾率小速度較小壽命長，為10-4~10s熒光與磷光的比較49熒光S1→S0躍遷磷光T1→S0躍遷熒光與磷光的比較二、激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜（吸收光譜與發(fā)射光譜）50二、激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜50

1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜(excitationspectrum)

固定測量波長（選最大熒光/發(fā)射波長），化合物發(fā)射的熒光(或磷光)強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線。2.熒光光譜(或磷光光譜)（fluorescencespectrum）

固定激發(fā)光波長（選最大激發(fā)/吸收波長），

化合物發(fā)射的熒光(或磷光)強(qiáng)度與發(fā)射光波長關(guān)系曲線。3.最大激發(fā)波長(λex)和最大熒光波長(λem)激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜511.熒光(磷光)的激發(fā)光譜(excitationsp室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜λexλem菲200260320380440500560620熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜磷光光譜52室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜λexλem菲2002603激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系Stokes位移

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，無輻射躍遷消耗了能量。

發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖

2,

1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如

3)。

鏡像規(guī)則

通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜/激發(fā)光譜成鏡像對稱關(guān)系。

53激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系Stokes位移53鏡像規(guī)則的解釋吸收光譜熒光光譜54鏡像規(guī)則的解釋吸收光譜熒光光譜54鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動(dòng)能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級分布類似；

S1S055鏡像規(guī)則的解釋基態(tài)上的各振動(dòng)能級分布與第三、影響熒光強(qiáng)度的因素56三、影響熒光強(qiáng)度的因素56分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件：

熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)，如ki>>kf，不出現(xiàn)熒光發(fā)射；熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；

（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。

熒光量子產(chǎn)率（f）：57分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件：熒光量子產(chǎn)率與某些化合物的熒光效率化合物 熒光效率 溶劑熒光素 0.92（0.1MNaOH）曙紅 0.19 （0.1MNaOH）羅丹明B 0.97 （乙醇）蒽 0.31 （己烷）核黃素 0.26 （水，pH7.0）菲 0.10 （乙醇）萘 0.12 （乙醇）酚 0.22 （水）葉綠素 0.32 （苯）58某些化合物的熒光效率化合物 熒光效率 化合物的結(jié)構(gòu)與熒光具有共軛雙鍵體系的分子59化合物的結(jié)構(gòu)與熒光具有共軛雙鍵體系的分子59（a）萘：

熒光效率為0.29；熒光波長為310nm。（b）蒽：熒光效率為0.46；熒光波長為400nm。多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測定。

ex=386nmem=430nm3，4-苯并芘強(qiáng)致癌物!60（a）萘：（b）蒽：多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染具有剛性不飽和平面結(jié)構(gòu)的分子化合物的結(jié)構(gòu)與熒光例61具有剛性不飽和平面結(jié)構(gòu)的分子化合物的結(jié)構(gòu)與熒光例61反式：平面構(gòu)型

強(qiáng)熒光體順式：非平面構(gòu)型

非熒光體例1，2-二苯乙烯62反式：平面構(gòu)型順式：非平面構(gòu)型例金屬螯合物滂鉻BBR本身不發(fā)熒光Al3+滂鉻BBR發(fā)紅色熒光63例金屬螯合物滂鉻BBR本身不發(fā)熒光Al3+滂鉻BBR發(fā)苯環(huán)上取代基的類型：化合物的結(jié)構(gòu)與熒光給電子基團(tuán)常使熒光增強(qiáng)：-OH、-OR、-NH2、-CN等。吸電子基團(tuán)會使熒光減弱：-COOH、-NO2、-SH、-X等。

鹵素取代基:

隨著取代基中鹵原子系數(shù)的增加，使系間竄躍加強(qiáng)，物質(zhì)的熒光減弱，而磷光增強(qiáng)。64苯環(huán)上取代基的類型：化合物的結(jié)構(gòu)與熒光給電子基團(tuán)常使熒光增強(qiáng)溫度：溫度越高，熒光降低環(huán)境對熒光的影響溶劑：極性增加，熒光增強(qiáng)，熒光波長發(fā)生紅移pH值：電離平衡的改變導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的差異猝滅劑：動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅、自猝滅表面活性劑：保護(hù)處于激發(fā)單重態(tài)的熒光物質(zhì)分子，

提高熒光效率。65溫度：溫度越高，熒光降低環(huán)境對熒光的影響溶劑：極性增加，熒光pH對熒光強(qiáng)度的影響

共軛酸堿兩種體型具有不同的電子氛圍，往往表現(xiàn)為具有不同熒光性質(zhì)的兩種體型，各具有自己特殊的熒光效率和熒光波長。離子化后，熒光消失pH≈1有熒光pH≈13無熒光66pH對熒光強(qiáng)度的影響共軛酸堿兩種體型具有不同四、熒光光譜儀67四、熒光光譜儀67測量熒光的儀器主要由四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。

特殊點(diǎn)：1.有兩個(gè)單色器2.光源與檢測器通常成直角。儀器結(jié)構(gòu)69測量熒光的儀器主要由四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器熒光光度計(jì)光路圖電源光度計(jì)記錄儀光電倍增管試樣液池光源光柵光柵反射鏡反射鏡激發(fā)單色器發(fā)射單色器90°70熒光光度計(jì)光路圖電源光度計(jì)記錄儀光電倍增管試樣液池光源光柵光熒光分光光度計(jì)的的主要部件激發(fā)光源：穩(wěn)定、具有一定強(qiáng)度（300~400nm)樣品池：低熒光材料，常用石英池，方形檢測器：較高靈敏度單色器（激發(fā)單色器和發(fā)射單色器）：光柵儀器結(jié)構(gòu)71熒光分光光度計(jì)的的主要部件儀器結(jié)構(gòu)711個(gè)光子可產(chǎn)生106～107個(gè)電子光電倍增管(PhotomultiplierTube,PMT)721個(gè)光子可產(chǎn)生106～107個(gè)電子光電倍增管(Photomu儀器的使用維護(hù)注意事項(xiàng)電源：觸發(fā)電壓、工作電流、穩(wěn)定性光源：啟動(dòng)預(yù)熱、冷卻重啟、保持清潔單色器：防潮、防塵、防污和防機(jī)械損傷光電倍增管：避免高壓時(shí)受到外來光線直射樣品池：插放方向、避免摩擦、清洗個(gè)人防護(hù)

：

避免紫外線損傷

73儀器的使用維護(hù)注意事項(xiàng)73五、熒光分析方法與應(yīng)用74五、熒光分析方法與應(yīng)用74優(yōu)點(diǎn)：（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～3個(gè)數(shù)量級；（2）選擇性強(qiáng)既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少、方法簡便、提供比較多的物理參數(shù)缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。60余種元素，尤其適用于有機(jī)物和生物大分子的檢測。熒光分析法的特點(diǎn)75優(yōu)點(diǎn)：熒光分析法的特點(diǎn)75熒光信號熒光壽命熒光光譜熒光強(qiáng)度隨光譜變化成像（熒光物質(zhì)在樣本中分布的空間信息）強(qiáng)度壽命76熒光信號熒光壽命76可獲得的信息分子結(jié)構(gòu)信息：熒光發(fā)射波長，熒光壽命，大分子表面熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度隨溶劑極性的變化等等分子濃度信息：熒光強(qiáng)度增強(qiáng)或猝滅分子在溶劑中的狀態(tài)：熒光光譜的紅移或者藍(lán)移，靜態(tài)或動(dòng)態(tài)猝滅，熒光壽命的變化等等分子間的相互作用：熒光猝滅，熒光壽命，共振能量轉(zhuǎn)移、新的熒光峰的產(chǎn)生分子的大?。悍肿拥霓D(zhuǎn)動(dòng)速度對偏振光的消偏等77可獲得的信息分子結(jié)構(gòu)信息：熒光發(fā)射波長，熒光壽命，大分子表面熒光分析法對物質(zhì)的定性或定量分析定性分析：依據(jù)不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)所吸收波長和發(fā)射的熒光波長不同；定量分析：同種物質(zhì)的稀溶液，其產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與濃度呈線性關(guān)系。78熒光分析法對物質(zhì)的定性或定量分析定性分析：依據(jù)不同結(jié)構(gòu)的任何熒光化合物都具有兩種特征光譜：熒光激發(fā)光譜（吸收光譜）—固定某一發(fā)射波長，測定該波長下的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨激發(fā)波長變化所得的光譜。熒光發(fā)射光譜（熒光光譜）—固定某一激發(fā)波長，測定熒光發(fā)射強(qiáng)度隨發(fā)射波長變化得到的光譜。熒光分析法定性依據(jù)79任何熒光化合物都具有兩種特征光譜：熒光分析法定(1)定量依據(jù)

熒光強(qiáng)度F正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率f

：F=fIa

由朗-比耳定律：Ia=I0-I=I0(1-10-

lc

)F=fI0(1-10-

lc

)=fI0(1-e-2.3

l

c)

濃度很低（

lc<0.05）時(shí)，將括號項(xiàng)近似處理后：

F=2.3fI0

lc=Kc

熒光分析法定量依據(jù)和方法80(1)定量依據(jù)熒光分析法定量依據(jù)和方法80熒光的定量分析熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系：F=KcI0IFIa條件:溶液濃度較稀81熒光的定量分析熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系：F=KcI0IFIa一般當(dāng)εbc0.05時(shí),F與c呈線性關(guān)系濃度對熒光強(qiáng)度的影響Fc82一般當(dāng)εbc0.05時(shí),F與c呈線性關(guān)系濃度對熒單組分的熒光直接測定和間接測定熒光物質(zhì)大多數(shù)無機(jī)和有機(jī)化合物化學(xué)反應(yīng)熒光猝滅88單組分的熒光直接測定和間接測定熒光物質(zhì)大多數(shù)無機(jī)和有機(jī)化學(xué)反(1)無機(jī)化合物的分析

可測量約60多種元素：

鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光配合物分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定。

單組分的熒光測定89(1)無機(jī)化合物的分析單組分的熒光測定89(2)有機(jī)化合物的分析

芳香族化合物具有共軛不飽和體系，多能發(fā)生熒光。

脂肪族化合物往往與熒光試劑作用后才可產(chǎn)生熒光。

胺類、甾族化合物、蛋白質(zhì)、酶和輔酶、維生素等均可以用熒光法分析。90(2)有機(jī)化合物的分析

芳香族化合物具有共

蛋白質(zhì)熒光探針就是利用熒光探測劑（小分子熒光化合物），使其與熒光較弱或不發(fā)熒光的物質(zhì)共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合，以形成發(fā)強(qiáng)熒光的絡(luò)合物，然后測定絡(luò)合物的熒光。熒光探測劑必須滿足以下3個(gè)條件：1.與蛋白質(zhì)的某一微區(qū)專一而牢固地結(jié)合；2.熒光參數(shù)對于結(jié)合點(diǎn)的微環(huán)境變化很敏感；3.結(jié)合以后不改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象。93蛋白質(zhì)熒光探針就是利用熒光探測劑（小分子六、磷光光譜法92六、磷光光譜法92磷光光譜法

磷光分析法是以分子磷光光譜來鑒別有機(jī)化合物和進(jìn)行定量分析的一種方法。93磷光光譜法磷光分析法是以分子磷光磷光光譜法

磷光光譜分析法的分類

低溫磷光

室溫磷光1、固體表面室溫磷光法（SS-RTP）2、膠束增穩(wěn)室溫磷光法（MS-RTP）94樣品管鍍銀未鍍銀Io液氮磷光光譜法磷光光譜分析法的分類1.稠環(huán)芳烴分析2.農(nóng)藥、生物堿、植物生長激素的分析

3.藥物分析和臨床分析

磷光光譜法的應(yīng)用951.稠環(huán)芳烴分析磷光光譜法的應(yīng)用95七、化學(xué)發(fā)光光譜法96七、化學(xué)發(fā)光光譜法96基本原理在化學(xué)反應(yīng)過程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長的光，稱為化學(xué)發(fā)光。

A+B=C+D*D*→D+h97基本原理在化學(xué)反應(yīng)過程中，某些化化學(xué)發(fā)光的特點(diǎn)能夠發(fā)光的化合物大多為有機(jī)化合物，芳香族化合物；化學(xué)發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng)E=170～300kJ/mol；位于可見光區(qū)；發(fā)光持續(xù)時(shí)間較長，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行；

98化學(xué)發(fā)光的特點(diǎn)能夠發(fā)光的化合物大多為有機(jī)化合物，芳香族化合物化學(xué)發(fā)光的效率化學(xué)效率：發(fā)光效率：99化學(xué)發(fā)光的效率化學(xué)效率：發(fā)光效率：99時(shí)刻t的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(單位時(shí)間發(fā)射的光量子數(shù))：化學(xué)發(fā)光的效率100——

是與分析物有關(guān)的化學(xué)發(fā)光效率;dc/dt——分析物參加反應(yīng)的速率；φcl化學(xué)發(fā)光分析法定量分析依據(jù)：

從上式可以看出：發(fā)光總強(qiáng)度與分析物濃度成正比。時(shí)刻t的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(單位時(shí)間發(fā)射的光量子數(shù))：化學(xué)發(fā)直接發(fā)光A+BC*+DC*C+h化學(xué)發(fā)光反應(yīng)類型1.直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光間接發(fā)光A+BC*+DC*+FF*+EF*F+h2.氣相化學(xué)發(fā)光和液相化學(xué)發(fā)光101直接發(fā)光化學(xué)發(fā)光反應(yīng)類型1.直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光間接靈敏度極高儀器設(shè)備簡單發(fā)射光強(qiáng)度測量無干擾線性范圍寬分析速度快化學(xué)發(fā)光分析法的特點(diǎn)102靈敏度極高化學(xué)發(fā)光分析法的特點(diǎn)102內(nèi)容小結(jié)第一節(jié)光譜分析法概論光譜分析

(spectralanalysis)：

對物質(zhì)發(fā)射輻射能的能譜分析或?qū)椛淠芘c物質(zhì)相互作用引起的能譜改變的分析。（三個(gè)基本過程、三個(gè)特點(diǎn)）電磁輻射具有波粒二象性：波動(dòng)性和微粒性

c=λν=ν/σ

E=hν=hc/λ物質(zhì)分子內(nèi)部運(yùn)動(dòng)形式及其對應(yīng)能級光譜分析法分類（吸收光譜法/發(fā)射光譜法；原子光譜法/分子光譜法）內(nèi)容小結(jié)第一節(jié)光譜分析法概論光譜分析(spec內(nèi)容小結(jié)第二節(jié)紫外/可見光吸收光譜法定量分析的依據(jù)

——朗伯-比爾定律A=lg(I0/It)=kbc（朗伯-比爾定律的分析應(yīng)用/適用條件）分光光度計(jì)的基本組成光源單色器吸收池檢測系統(tǒng)紫外/可見分光光度計(jì)的類型內(nèi)容小結(jié)第二節(jié)紫外/可見光吸收光譜法定量分析的依據(jù)

——朗內(nèi)容小結(jié)第一激發(fā)單線態(tài)基態(tài)分子光輻射激發(fā)態(tài)振動(dòng)馳豫內(nèi)轉(zhuǎn)換熒光發(fā)射第一激發(fā)三線態(tài)體系間跨越磷光發(fā)射第三節(jié)

分子熒光和分子磷光光譜法分子熒光和磷光發(fā)生的機(jī)理內(nèi)容小結(jié)第一激發(fā)基態(tài)分子光輻射激發(fā)態(tài)振動(dòng)馳豫內(nèi)轉(zhuǎn)換熒光發(fā)射第內(nèi)容小結(jié)Stokes位移發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)鏡像規(guī)則激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜內(nèi)容小結(jié)Stokes位移激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系內(nèi)容小結(jié)分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件熒光量子產(chǎn)率f合適的結(jié)構(gòu)苯環(huán)上取代基的類型具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子環(huán)境對熒光的影響（溫度、溶劑、pH值、表面活性劑、猝滅劑）具有共軛雙鍵體系的分子熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系內(nèi)容小結(jié)分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件內(nèi)容小結(jié)熒光光譜儀檢測器光源激發(fā)單色器樣品池發(fā)射單色器分類主要部件使用和維護(hù)內(nèi)容小結(jié)熒光光譜儀檢測器光源激發(fā)單色器樣品池發(fā)射單色器分類熒光定量分析熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系：F=KC內(nèi)容小結(jié)熒光定性分析熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜標(biāo)準(zhǔn)曲線法比例法解線性方程法分析方法熒光定量分析熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系：F=KC內(nèi)容小結(jié)熒光定內(nèi)容小結(jié)磷光光譜法熒光分析法的應(yīng)用單組分的熒光直接測定和間接測定多組分的熒光測定分類、儀器特點(diǎn)及其應(yīng)用化學(xué)發(fā)光光譜法基本原理、特點(diǎn)、化學(xué)發(fā)光效率、反應(yīng)類型內(nèi)容小結(jié)磷光光譜法熒光分析法的應(yīng)用單組分的熒光直接測定多組分復(fù)習(xí)思考題什么叫做光譜分析？其主要過程和特點(diǎn)有哪些？紫外/可見分光光度法的基本原理是什么？紫外/可見分光光度計(jì)的主要構(gòu)造是怎樣的？分子的去活化過程有哪些？什么是物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜？二者之間有什么關(guān)系？影響熒光強(qiáng)弱的因素有哪些？分子磷光和化學(xué)發(fā)光法的特點(diǎn)有哪些？復(fù)習(xí)思考題什么叫做光譜分析？其主要過程和特點(diǎn)有哪些？Thanks!Thanks!常見現(xiàn)代儀器分析技術(shù)：光譜分析技術(shù)：紫外-可見分光光度計(jì)、熒光分析儀器、原子光譜分析儀顯微鏡:光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡分離分析技術(shù)：離心機(jī)、色譜儀、電泳儀、毛細(xì)管電泳儀細(xì)胞及分子生物學(xué)技術(shù)：培養(yǎng)箱、PCR基因擴(kuò)增儀波譜分析技術(shù)：質(zhì)譜儀常規(guī)儀器分析技術(shù)：生物安全柜、免疫分析儀2常見現(xiàn)代儀器分析技術(shù)：光譜分析技術(shù)：紫外-可見分光光度計(jì)、熒第一章

光譜分析法（Spectrum

Analysis）2第一章

光譜分析法（SpectrumAnalysis本章提要第一節(jié)光譜分析法概論第二節(jié)紫外/可見光吸收光譜法光譜分析法及其特點(diǎn)電磁輻射的基本性質(zhì)電磁輻射的特性光譜分析法的分類分子光譜法基本原理紫外/可見分光光度計(jì)構(gòu)造紫外/可見分光光度計(jì)類型3本章提要第一節(jié)光譜分析法概論第二節(jié)紫外/可見光吸收光譜法第三節(jié)

分子發(fā)光光譜法

光致發(fā)光

分子熒光和磷光光譜基本原理影響熒光強(qiáng)度的因素

分子熒光光譜儀

分子熒光光譜法的應(yīng)用磷光光譜法

化學(xué)發(fā)光法4本章提要第三節(jié)分子發(fā)光光譜法光致發(fā)光4本章提要第一節(jié)

光譜分析法概論5第一節(jié)5是電磁輻射按照波長的有序排列。光譜(spectrum)：第一節(jié)光譜分析法概論6是電磁輻光譜第一節(jié)光譜分析法概論6一、光譜分析法及其特點(diǎn)

光譜分析(spectralanalysis)：

對物質(zhì)發(fā)射輻射能的能譜分析或?qū)椛淠芘c物質(zhì)相互作用引起的能譜改變的分析。

電磁輻射范圍：射線（10-10m）～無線電波（103m）所有范圍；

相互作用方式：發(fā)射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等；

應(yīng)用：光譜分析法在研究物質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)表征、表面分析等方面具有其他方法不可區(qū)代的地位；7一、光譜分析法及其特點(diǎn)光譜分析(spectr（1）能源提供能量；（2）能量與被測物之間的相互作用；（3）產(chǎn)生信號。

基本特點(diǎn)：（1）所有光分析法均包含三個(gè)基本過程；（2）選擇性測量，不涉及混合物分離（不同于色譜分析）；（3）涉及大量光學(xué)元器件。三個(gè)基本過程：一、光譜分析法及其特點(diǎn)8（1）能源提供能量；三個(gè)基本過程：一、光譜分析法及其特點(diǎn)8二、電磁輻射的基本性質(zhì)

電磁輻射（電磁波）：以接近光速（真空中為光速）傳播的能量；

c=λν=ν/σ

E=hν=hc/λc：光速；λ：波長；ν：頻率；σ：波數(shù)；E：能量；h：普朗克常數(shù)

電磁輻射具有波動(dòng)性和微粒性（波粒二象性）；9二、電磁輻射的基本性質(zhì)電磁輻射（電磁波）：以接近光速三、輻射能的特性：

(1)吸收

物質(zhì)選擇性吸收特定頻率的輻射能，并從低能級躍遷到高能級；(2)發(fā)射

將吸收的能量以光的形式釋放出；

(3)散射

由傳播介質(zhì)的不均勻性引起的光線向四周射去；

(4)折射

折射是光在兩種介質(zhì)中的傳播速度不同；

(5)反射光射到不同的介質(zhì)介面時(shí)，部分光自介面射回原介質(zhì)中；

(6)干涉

干涉現(xiàn)象；(7)衍射

光繞過物體而彎曲地向他后面?zhèn)鞑サ默F(xiàn)象；

(8)偏振

只在一個(gè)固定方向有振動(dòng)的光。10三、輻射能的特性：(1)吸收物質(zhì)選擇性吸收特定頻率常用三種光分析法測量過程示意圖

11常用三種光分析法測量過程示意圖11四、光譜分析分類光譜分析法原子發(fā)射原子吸收原子熒光X射線熒光原子吸收紫外可見紅外可見核磁共振紫外可見紅外可見分子熒光分子磷光核磁共振化學(xué)發(fā)光原子發(fā)射原子熒光分子熒光分子磷光X射線熒光化學(xué)發(fā)光吸收光譜法發(fā)射光譜法原子光譜法分子光譜法12四、光譜分析分類光譜分析法原原原X原紫紅核紫紅分分核化原原分五、分子光譜法物質(zhì)分子內(nèi)部運(yùn)動(dòng)形式及其對應(yīng)能級1.電子相對于原子核的運(yùn)動(dòng)--電子能級;

單重態(tài)：激發(fā)態(tài)與基態(tài)中的電子自旋方向相反.

三重態(tài)：激發(fā)態(tài)與基態(tài)中的電子自旋方向相同.2.原子核在其平衡位置附近的相對振動(dòng)--振動(dòng)能級;3.分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動(dòng)--轉(zhuǎn)動(dòng)能級.13五、分子光譜法物質(zhì)分子內(nèi)部運(yùn)動(dòng)形式及其對應(yīng)能級13分子的能級圖與躍遷Sn:

電子能級Vn:

振動(dòng)能級Jn:

轉(zhuǎn)動(dòng)能級分子的總能量

=E電子+E振動(dòng)+E轉(zhuǎn)動(dòng)14分子的能級圖與躍遷Sn:電子能級Vn:振動(dòng)能級Jn:轉(zhuǎn)

分子光譜分析法的分類分子光譜分子吸收分子發(fā)光光致發(fā)光其它發(fā)光形式UV-Vis（紫外-可見）IR（紅外）如：熒光和磷光如：化學(xué)發(fā)光等15分子光譜分析法的分類分子光譜分子吸收分子發(fā)光光致發(fā)光其它發(fā)第二節(jié)

紫外/可見光吸收光譜法16第二節(jié)16紫外/可見光吸收光譜分析法：

利用溶液中分子吸收紫外和可見光產(chǎn)生躍遷所記錄的吸收光譜圖，可進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)分析，根據(jù)最大吸收波長強(qiáng)度變化可進(jìn)行定量分析。屬于分子吸收光譜法，分析波長范圍一般為200~800nm。歷史悠久、應(yīng)用廣泛：分析化學(xué)藥物分析臨床檢驗(yàn)等第二節(jié)紫外/可見光吸收光譜法17紫外/可見光吸收光譜分析法：歷史悠久、應(yīng)用廣泛：分析化學(xué)第二即光吸收基本定律朗伯定律:(1760)

A=lg(I0/It)=k1b

當(dāng)入射光的λ、吸光物質(zhì)的c一定時(shí)，溶液的吸光度A與液層厚度b成正比。比爾定律(1852)

A=lg(I0/It)=k2c

當(dāng)入射光的λ、液層厚度b

一定時(shí)，溶液的吸光度A與吸光物質(zhì)的c成正比。一、基本原理I0It入射光透過光18即光吸收基本定律朗伯定律:(1760)A=lg(I0朗伯-比爾定律意義:

當(dāng)一束平行單色光通過均勻、透明的吸光介質(zhì)時(shí)，其吸光度與吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度和吸收層厚度的乘積成正比。A=lg(I0/It)=kbc一、基本原理19朗伯-比爾定律意義:A=lg(I0/It)=kbc一、基透光率（透射比）T（Transmittance）A

=lg(I0/It)=lg(1/T)=-lgT

=kbc吸光度A

（Absorbance）一、基本原理20透光率（透射比）T（Transmittance）A=l吸光度A、透射比T與濃度c

的關(guān)系A(chǔ)T(%)cA=kbc1.00.80.60.40.2100

80

60

40

20一、基本原理21吸光度A、透射比T與濃度c的關(guān)系A(chǔ)T(%)cA=kbck吸光系數(shù)（Absorptivity）

（1）當(dāng)c的單位用g·L-1表示時(shí)，用a

表示，

A＝abca的單位:L·g-1·cm-1的單位:L·mol-1·cm-1（2）當(dāng)c的單位用mol·L-1表示時(shí)，用ε表示，

A＝ε

bc

（3）當(dāng)c的單位用g·100mL-1表示時(shí)，用表示,A＝bc，叫做比吸光系數(shù)。一、基本原理22k吸光系數(shù)（Absorptivity）（溶液濃度的測定A＝bc工作曲線法(校準(zhǔn)曲線)朗伯-比爾定律的分析應(yīng)用

01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx一、基本原理26溶液濃度的測定A＝bc工作曲線法朗伯-比爾定律的分析應(yīng)朗伯-比爾定律的適用條件1.單色光

應(yīng)選用max處或肩峰處測定。3.稀溶液

濃度增大，分子之間作用增強(qiáng)。2.吸光質(zhì)點(diǎn)形式不變

離解、絡(luò)合、締合會破壞線性關(guān)系,

應(yīng)控制條件(酸度、濃度、介質(zhì)等)。一、基本原理27朗伯-比爾定律的適用條件1.單色光3.稀溶液2吸光度的加和性與吸光度的測量

A=A1+A2+…+An用參比溶液調(diào)T=100%（A=0），再測樣品溶液的吸光度，即消除了吸收池對光的吸收、反射，溶劑、試劑對光的吸收等。一、基本原理28吸光度的加和性與吸光度的測量A=A1+A2+二、紫外/可見分光光度計(jì)主要部件光源單色器吸收池檢測系統(tǒng)分光光度計(jì)的基本組成習(xí)慣上將工作波段在200nm~800nm的分光光度計(jì)稱為紫外-可見分光光度計(jì)。優(yōu)點(diǎn)：通過色散原件（棱鏡或光柵）得到一束近似的單色光。波長可調(diào),故選擇性好,準(zhǔn)確度高。29二、紫外/可見分光光度計(jì)主要部件光源單色器吸收池檢測系統(tǒng)分光/nm鎢燈（熱輻射光源）4006008001000氙燈氫燈強(qiáng)度光源（發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜）

可見光區(qū)：鎢燈，鹵鎢燈(320～2500nm)

紫外區(qū)：氫燈(180～375nm)

氙燈、汞燈：紫外、可見光區(qū)均可用作光源要求：有足夠的光強(qiáng)度，穩(wěn)定。二、紫外/可見分光光度計(jì)主要部件30/nm鎢燈（熱輻射光源）4006008001000氙燈氫燈氙燈氫燈鎢燈31氙燈氫燈鎢燈31單色器（將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置）棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時(shí)折射率不同。玻璃350～3200nm,石英185～4000nm入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ2800600500400二、紫外/可見分光光度計(jì)主要部件32單色器（將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置）棱鏡：依據(jù)不光柵：（利用光通過光柵時(shí)發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光的裝置）光柵衍射示意圖光屏透鏡平面透射光柵M1M2出射狹縫在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。優(yōu)點(diǎn)：波長范圍寬，色散均勻，分辨性能好，使用方便。二、紫外/可見分光光度計(jì)主要部件33光柵：（利用光通過光柵時(shí)發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光的裝置）光柵檢流計(jì)（指示器）：低檔儀器：刻度顯示中高檔儀器：數(shù)字顯示，自動(dòng)掃描記錄檢測器：利用光電效應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)換成電流訊號。如：光電池，光電管，光電倍增管吸收池（比色皿）：用于盛待測及參比溶液。二、紫外/可見分光光度計(jì)主要部件34檢流計(jì)（指示器）：檢測器：利用光電效應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)換成電流訊號1.單光束分光光度計(jì)可變波長單光束紫外-可見分光光度計(jì)示意圖三、紫外/可見分光光度計(jì)的基本類型351.單光束分光光度計(jì)可變波長單光束紫外-可見分光光度計(jì)示意2.雙光束分光光度計(jì)參比池檢測器濾光片或單色器放大器樣品池光源

hv光子檢測器反光鏡反光鏡透明部分扇形鏡正面圖扇形鏡反光鏡柵鏡雙光束型可以消除光源強(qiáng)度變化的影響?？勺儾ㄩL雙光束紫外-可見分光光度計(jì)示意圖362.雙光束分光光度計(jì)參比池檢測器濾光片或放大器樣品池光源第三節(jié)

分子發(fā)光光譜法37第三節(jié)37分子發(fā)光光致發(fā)光化學(xué)發(fā)光生物發(fā)光光致發(fā)光（Photoluminescence）:物質(zhì)當(dāng)受到光的照射吸收了某種波長的光后，會發(fā)射出波長相同或比吸收波長更長的光，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。PhotoluminescenceMolecularLuminescenceChemiluminescenceBioluminescence38分子發(fā)光光致發(fā)光化學(xué)發(fā)光生物發(fā)光光致發(fā)光（Photolumi1575年，西班牙醫(yī)生N.Monardes發(fā)現(xiàn)。1852年，GeorgeStokes對熒光產(chǎn)生的機(jī)理作了解釋，并提出了“熒光”。1867年，分子熒光首次用于分析測定。1928年，Jette和West提出第一臺光電熒光計(jì)。1952年，商品熒光分光光度計(jì)出現(xiàn)。

分子熒光技術(shù)的發(fā)展391575年，西班牙醫(yī)生N.Monardes發(fā)現(xiàn)。分子熒光技TheDiscoveryandDevelopmentoftheGreenFluorescentProtein,（GFP）綠色熒光蛋白2008諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)OsamuShimomura1960sMartinChalfie1990sRogerY.Tsien’s,today40TheDiscoveryandDevelopment一、分子熒光（磷光）發(fā)生的原理41一、分子熒光（磷光）發(fā)生的原理41

。物質(zhì)的基態(tài)分子受一激發(fā)光源的照射被激發(fā)至激發(fā)態(tài)后，電子由第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級，以光的形式放出末態(tài)兩個(gè)能級的能量差額稱為熒光。基于化合物的熒光測量而建立起來的分析方法稱為分子熒光光譜法。42。物質(zhì)的基態(tài)分子受1.分子的多重態(tài)：單線態(tài)、激發(fā)單線態(tài)、激發(fā)三線態(tài)單線態(tài)(S0)

一個(gè)所有電子自旋都配對的分子的電子狀態(tài)。多數(shù)有機(jī)物分子的基態(tài)是單線態(tài)。當(dāng)基態(tài)一對電子的一個(gè)被激發(fā)到較高能級時(shí)，激發(fā)單線態(tài)(S)

自旋方向不改變，分子仍處于單線態(tài)。激發(fā)三線態(tài)(T)

有兩個(gè)電子的自旋不配對而平行的狀態(tài)。分子的激發(fā)與失活43分子的激發(fā)與失活43S0ST分子的多重態(tài)ET1<ES1

S0→T

：禁阻躍遷，進(jìn)入的幾率小；

M=2S+1

S:為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；電子激發(fā)態(tài)的多重度：44S0ST分子的多重態(tài)ET1<ES1M=2S+1無輻射躍遷振動(dòng)弛豫：激發(fā)態(tài)分子由同一電子能級中的較高振動(dòng)能級轉(zhuǎn)至較低振動(dòng)能級的過程，其效率較高。內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重態(tài)的兩個(gè)電子能級間，電子由高能級回到低能級的分子內(nèi)過程。系間竄越：同一電子能級激發(fā)態(tài)分子的電子自旋發(fā)生倒轉(zhuǎn)而使分子的多重態(tài)發(fā)生變化的過程。外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他溶質(zhì)相互作用、能量轉(zhuǎn)換而使熒光（或磷光）減弱甚至消失的過程。熒光強(qiáng)度的減弱或消失，稱為熒光熄滅（或猝滅）。

激發(fā)態(tài)分子的失活45無輻射躍遷激發(fā)態(tài)分子的失活45輻射躍遷熒光：受光激發(fā)的分子從第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。

由于是相同多重態(tài)之間的躍遷，幾率較大，速度大，速率常數(shù)kf為106~109s-1

。

磷光：從第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。

產(chǎn)生伴隨自旋多重態(tài)的改變，輻射速度遠(yuǎn)小于熒光，壽命較長。激發(fā)態(tài)分子的失活46輻射躍遷激發(fā)態(tài)分子的失活46熒光與磷光的產(chǎn)生過程47熒光與磷光的產(chǎn)生過程47圖熒光與磷光產(chǎn)生示意圖激發(fā)單線態(tài)激發(fā)三線態(tài)~~~~~~~S1T1S2S0吸收（A）熒光（F）磷光（P）λ2λ1λ3λ448圖熒光與磷光產(chǎn)生示意圖激發(fā)單線態(tài)激發(fā)三線態(tài)~~~~~~~S熒光S1→S0躍遷波長短幾率大速度較大壽命短，10-9~10-7s磷光

T1→S0躍遷波長長幾率小速度較小壽命長，為10-4~10s熒光與磷光的比較49熒光S1→S0躍遷磷光T1→S0躍遷熒光與磷光的比較二、激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜（吸收光譜與發(fā)射光譜）50二、激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜50

1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜(excitationspectrum)

固定測量波長（選最大熒光/發(fā)射波長），化合物發(fā)射的熒光(或磷光)強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線。2.熒光光譜(或磷光光譜)（fluorescencespectrum）

固定激發(fā)光波長（選最大激發(fā)/吸收波長），

化合物發(fā)射的熒光(或磷光)強(qiáng)度與發(fā)射光波長關(guān)系曲線。3.最大激發(fā)波長(λex)和最大熒光波長(λem)激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜511.熒光(磷光)的激發(fā)光譜(excitationsp室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜λexλem菲200260320380440500560620熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜磷光光譜52室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜λexλem菲2002603激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系Stokes位移

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，無輻射躍遷消耗了能量。

發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖

2,

1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如

3)。

鏡像規(guī)則

通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜/激發(fā)光譜成鏡像對稱關(guān)系。

53激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系Stokes位移53鏡像規(guī)則的解釋吸收光譜熒光光譜54鏡像規(guī)則的解釋吸收光譜熒光光譜54鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動(dòng)能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級分布類似；

S1S055鏡像規(guī)則的解釋基態(tài)上的各振動(dòng)能級分布與第三、影響熒光強(qiáng)度的因素56三、影響熒光強(qiáng)度的因素56分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件：

熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)，如ki>>kf，不出現(xiàn)熒光發(fā)射；熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；

（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。

熒光量子產(chǎn)率（f）：57分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件：熒光量子產(chǎn)率與某些化合物的熒光效率化合物 熒光效率 溶劑熒光素 0.92（0.1MNaOH）曙紅 0.19 （0.1MNaOH）羅丹明B 0.97 （乙醇）蒽 0.31 （己烷）核黃素 0.26 （水，pH7.0）菲 0.10 （乙醇）萘 0.12 （乙醇）酚 0.22 （水）葉綠素 0.32 （苯）58某些化合物的熒光效率化合物 熒光效率 化合物的結(jié)構(gòu)與熒光具有共軛雙鍵體系的分子59化合物的結(jié)構(gòu)與熒光具有共軛雙鍵體系的分子59（a）萘：

熒光效率為0.29；熒光波長為310nm。（b）蒽：熒光效率為0.46；熒光波長為400nm。多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測定。

ex=386nmem=430nm3，4-苯并芘強(qiáng)致癌物!60（a）萘：（b）蒽：多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染具有剛性不飽和平面結(jié)構(gòu)的分子化合物的結(jié)構(gòu)與熒光例61具有剛性不飽和平面結(jié)構(gòu)的分子化合物的結(jié)構(gòu)與熒光例61反式：平面構(gòu)型

強(qiáng)熒光體順式：非平面構(gòu)型

非熒光體例1，2-二苯乙烯62反式：平面構(gòu)型順式：非平面構(gòu)型例金屬螯合物滂鉻BBR本身不發(fā)熒光Al3+滂鉻BBR發(fā)紅色熒光63例金屬螯合物滂鉻BBR本身不發(fā)熒光Al3+滂鉻BBR發(fā)苯環(huán)上取代基的類型：化合物的結(jié)構(gòu)與熒光給電子基團(tuán)常使熒光增強(qiáng)：-OH、-OR、-NH2、-CN等。吸電子基團(tuán)會使熒光減弱：-COOH、-NO2、-SH、-X等。

鹵素取代基:

隨著取代基中鹵原子系數(shù)的增加，使系間竄躍加強(qiáng)，物質(zhì)的熒光減弱，而磷光增強(qiáng)。64苯環(huán)上取代基的類型：化合物的結(jié)構(gòu)與熒光給電子基團(tuán)常使熒光增強(qiáng)溫度：溫度越高，熒光降低環(huán)境對熒光的影響溶劑：極性增加，熒光增強(qiáng)，熒光波長發(fā)生紅移pH值：電離平衡的改變導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的差異猝滅劑：動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅、自猝滅表面活性劑：保護(hù)處于激發(fā)單重態(tài)的熒光物質(zhì)分子，

提高熒光效率。65溫度：溫度越高，熒光降低環(huán)境對熒光的影響溶劑：極性增加，熒光pH對熒光強(qiáng)度的影響

共軛酸堿兩種體型具有不同的電子氛圍，往往表現(xiàn)為具有不同熒光性質(zhì)的兩種體型，各具有自己特殊的熒光效率和熒光波長。離子化后，熒光消失pH≈1有熒光pH≈13無熒光66pH對熒光強(qiáng)度的影響共軛酸堿兩種體型具有不同四、熒光光譜儀67四、熒光光譜儀67測量熒光的儀器主要由四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。

特殊點(diǎn)：1.有兩個(gè)單色器2.光源與檢測器通常成直角。儀器結(jié)構(gòu)69測量熒光的儀器主要由四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器熒光光度計(jì)光路圖電源光度計(jì)記錄儀光電倍增管試樣液池光源光柵光柵反射鏡反射鏡激發(fā)單色器發(fā)射單色器90°70熒光光度計(jì)光路圖電源光度計(jì)記錄儀光電倍增管試樣液池光源光柵光熒光分光光度計(jì)的的主要部件激發(fā)光源：穩(wěn)定、具有一定強(qiáng)度（300~400nm)樣品池：低熒光材料，常用石英池，方形檢測器：較高靈敏度單色器（激發(fā)單色器和發(fā)射單色器）：光柵儀器結(jié)構(gòu)71熒光分光光度計(jì)的的主要部件儀器結(jié)構(gòu)711個(gè)光子可產(chǎn)生106～107個(gè)電子光電倍增管(PhotomultiplierTube,PMT)721個(gè)光子可產(chǎn)生106～107個(gè)電子光電倍增管(Photomu儀器的使用維護(hù)注意事項(xiàng)電源：觸發(fā)電壓、工作電流、穩(wěn)定性光源：啟動(dòng)預(yù)熱、冷卻重啟、保持清潔單色器：防潮、防塵、防污和防機(jī)械損傷光電倍增管：避免高壓時(shí)受到外來光線直射樣品池：插放方向、避免摩擦、清洗個(gè)人防護(hù)

：

避免紫外線損傷

73儀器的使用維護(hù)注意事項(xiàng)73五、熒光分析方法與應(yīng)用74五、熒光分析方法與應(yīng)用74優(yōu)點(diǎn)：（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～3個(gè)數(shù)量級；（2）選擇性強(qiáng)既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少、方法簡便、提供比較多的物理參數(shù)缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。60余種元素，尤其適用于有機(jī)物和生物大分子的檢測。熒光分析法的特點(diǎn)75優(yōu)點(diǎn)：熒光分析法的特點(diǎn)75熒光信號熒光壽命熒光光譜熒光強(qiáng)度隨光譜變化成像（熒光物質(zhì)在樣本中分布的空間信息）強(qiáng)度壽命76熒光信號熒光壽命76可獲得的信息分子結(jié)構(gòu)信息：熒光發(fā)射波長，熒光壽命，大分子表面熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度隨溶劑極性的變化等等分子濃度信息：熒光強(qiáng)度增強(qiáng)或猝滅分子在溶劑中的狀態(tài)：熒光光譜的紅移或者藍(lán)移，靜態(tài)或動(dòng)態(tài)猝滅，熒光壽命的變化等等分子間的相互作用：熒光猝滅，熒光壽命，共振能量轉(zhuǎn)移、新的熒光峰的產(chǎn)生分子的大?。悍肿拥霓D(zhuǎn)動(dòng)速度對偏振光的消偏等77可獲得的信息分子結(jié)構(gòu)信息：熒光發(fā)射波長，熒光壽命，大分子表面熒光分析法對物質(zhì)的定性或定量分析定性分析：依據(jù)不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)所吸收波長和發(fā)射的熒光波長不同；定量分析：同種物質(zhì)的稀溶液，其產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與濃度呈線性關(guān)系。78熒光分析法對物質(zhì)的定性或定量分析定性分析：依據(jù)不同結(jié)構(gòu)的任何熒光化合物都具有兩種特征光譜：熒光激發(fā)光譜（吸收光譜）—固定某一發(fā)射波長，測定該波長下的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨激發(fā)波長變化所得的光譜。熒光發(fā)射光譜（熒光光譜）—固定某一激發(fā)波長，測定熒光發(fā)射強(qiáng)度隨發(fā)射波長變化得到的光譜。熒光分析法定性依據(jù)79任何熒光化合物都具有兩種特征光譜：熒光分析法定(1)定量依據(jù)

熒光強(qiáng)度F正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率f

：F=fIa

由朗-比耳定律：Ia=I0-I=I0(1-10-

lc

)F=fI0(1-10-

lc

)=fI0(1-e-2.3

l

c)

濃度很低（

lc<0.05）時(shí)，將括號項(xiàng)近似處理后：

F=2.3fI0

lc=Kc

熒光分析法定量依據(jù)和方法80(1)定量依據(jù)熒光分析法定量依據(jù)和方法80熒光的定量分析熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系：F=KcI0IFIa條件:溶液濃度較稀81熒光的定量分析熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系：F=KcI0IFIa一般當(dāng)εbc0.05時(shí),F與c呈線性關(guān)系濃度對熒光強(qiáng)度的影響Fc82一般當(dāng)εbc0.05時(shí),F與c呈線性關(guān)系濃度對熒單組分的熒光直接測定和間接測定熒光物質(zhì)大多數(shù)無機(jī)和有機(jī)化合物化學(xué)反應(yīng)熒光猝滅88單組分的熒光直接測定和間接測定熒光物質(zhì)大多數(shù)無機(jī)和有機(jī)化學(xué)反(1)無機(jī)化合物的分析

可測