2022孤立性胼胝體發(fā)育異常胎兒的系列遺傳學(xué)診斷研究(全文)

2022孤立性胼胝體發(fā)育異常胎兒的系列遺傳學(xué)診斷研究（全文）摘要目的從細(xì)胞遺傳學(xué)、基因組及單基因水平探討染色體核型分析、染色體微陣列分析（CMA）及全外顯子測序（WES）技術(shù)在孤立性胼胝體發(fā)育異常（CCA）胎兒產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法選取2010年1月至2021年4月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心及清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診，超聲及MRI檢查診斷為孤立性CCA并行侵入性產(chǎn)前診斷的胎兒。對所有胎兒樣本行染色體核型分析和（或）CMA［或拷貝數(shù)變異測序（CNV?seq）］檢測，對染色體核型分析和（或）CMA（或CNV?seq）檢測結(jié)果未見異常的胎兒及其父母樣本進(jìn)一步行WES檢測。結(jié)果65例孤立性CCA胎兒中，行染色體核型分析38例，檢出異常染色體核型3例，檢出率為8%（3/38）。共計(jì)49例孤立性CCA胎兒行CMA（或CNV?seq）檢測，檢出致病性CNV6例，檢出率為12%（6/49），其中，染色體核型分析結(jié)果異常，進(jìn)一步行CMA檢測的檢出率為1/1；染色體核型結(jié)果正常，進(jìn)一步行CMA（或CNV?seq）檢測的檢出率為14%（3/21）；以CMA檢測為一線檢測技術(shù)的檢出率為7%（2/27）。共計(jì)25例染色體核型分析和（或）CMA檢測結(jié)果陰性的孤立性CCA胎兒行WES檢測，檢出致病基因9例，檢出率為36%（9/25）。染色體核型分析、CMA及WES三種檢測技術(shù)的梯度遺傳學(xué)診斷使26%（17/65）孤立性CCA胎兒得到明確的遺傳學(xué)診斷。結(jié)論對孤立性CCA胎兒進(jìn)行產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷具有重要的臨床意義，CMA檢測的檢出率高于傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)。CMA檢測可作為孤立性CCA胎兒的一線檢測技術(shù)，染色體核型分析和（或）CMA檢測結(jié)果陰性時(shí)，WES可額外提高孤立性CCA胎兒的致病性檢出率。討論CCA最早在1812年由Reil描述［8］，男性的發(fā)病率略高于女性，在總患病人群中，男性占比為52%~56%，略高于女性［9?10］。本研究中，男女胎兒的占比分別為66%（43/65）和34%（22/65），男性胎兒占比較文獻(xiàn)報(bào)道略高。有報(bào)道顯示，CCA是妊娠24周后胎兒因中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形引產(chǎn)的常見原因之一，但目前為止，胎兒CCA的病因仍不明確。隨著遺傳學(xué)檢測技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的研究提示，胎兒CCA與染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常、染色體微缺失或微重復(fù)以及單基因突變等相關(guān)。另外，根據(jù)是否合并其他器官或結(jié)構(gòu)畸形，CCA胎兒的預(yù)后也存在較大差異，復(fù)雜性CCA胎兒預(yù)后差，孤立性CCA胎兒的預(yù)后目前由于缺乏大樣本量研究，爭議較大。因此，對孤立性CCA胎兒進(jìn)行遺傳學(xué)病因的鑒定不僅有助于產(chǎn)前咨詢，而且對評估其預(yù)后有極大的幫助。一、染色體病與孤立性胎兒CCA染色體核型分析技術(shù)于20世紀(jì)60年代開始應(yīng)用于CCA胎兒的產(chǎn)前診斷，已報(bào)道的病例中與CCA相關(guān)的異常核型包括mos46，XY/47，XY，+r、46，XY，r（6）（p25q27）/45，XY，-6、46，XX，del（1）（p31.1p32.3）、46，XY，del（20）（q11.2q13.1）、45，X/46，XY、mos47，XY，+8/46，XY、47，XY，+21等。本研究中，共38例孤立性CCA胎兒行染色體核型分析，檢出異常核型3例（8%），與文獻(xiàn)報(bào)道的檢出率基本一致［11］。本研究中，編號GZFE02胎兒核型結(jié)果為46，XY，der（5）（t5；11）（p15.3；q23）pat，對其雙親進(jìn)行染色體核型分析發(fā)現(xiàn)，其父親在5號染色體p15.3及11號染色體q23有平衡易位，因此，該胎兒的異常核型考慮是其父親精子形成中減數(shù)分裂時(shí)發(fā)生不平衡重組導(dǎo)致。本研究中，通過染色體核型分析檢出的3例異常核型理論上均可通過CMA檢出，尤其是編號GZFE02的5號衍生染色體，僅通過染色體核型分析無法明確衍生染色體和未知來源染色體的來源及片段大小，以及片段內(nèi)所包含的在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（onlinemendelianinheritanceinman，OMIM）致病基因，需進(jìn)一步行CMA檢測。本研究結(jié)果提示，對于孤立CCA胎兒，可采用CMA檢測作為一線檢測技術(shù)。這與國際指南［12］中的推薦“當(dāng)產(chǎn)前超聲檢查提示胎兒結(jié)構(gòu)異常時(shí)，CMA技術(shù)可替代常規(guī)染色體核型分析技術(shù)作為孤立性CCA胎兒的一線檢測方法”是一致的。二、CMA檢測在CCA胎兒中的應(yīng)用價(jià)值由于CMA既能檢測出染色體非整倍體，又能檢測出微缺失或微重復(fù)，檢測樣本無需培養(yǎng)，極大地縮短了檢測時(shí)間，因此，ACOG和SMFM指南均建議CMA檢測取代傳統(tǒng)的染色體核型分析，應(yīng)用于超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒的產(chǎn)前診斷中。2007年，CMA檢測開始用于診斷胎兒CCA［3］。2010年，Koehler等［13］報(bào)道了1例復(fù)雜性CCA胎兒，基于微陣列的比較基因組雜交（array?basedcomparativegenomichybridization，aCGH）結(jié)果顯示，1p31.3p32.2出現(xiàn)4.9Mb的微缺失。2011年，Chen等［14］報(bào)道1例復(fù)雜性CCA胎兒，aCGH結(jié)果顯示1p32.3p31.1出現(xiàn)22.2Mb缺失。本研究中，21例孤立性CCA胎兒在染色體核型分析結(jié)果未見異常后進(jìn)一步行CMA或CNV?seq檢測，結(jié)果檢出了3例致病性CNV，可見，CMA檢測可額外檢出14%致病性CNV。此外，本研究通過CMA檢測還檢出了2例片段<6Mb的致病性CNV，進(jìn)一步提示，CMA技術(shù)可以在染色體核型分析結(jié)果陰性的基礎(chǔ)上提高微小致病性CNV的檢出率，可以作為一線檢測技術(shù)應(yīng)用于孤立性CCA胎兒的檢測中。但是，CMA技術(shù)也存在一定的局限性：（1）CMA檢測不能檢出平衡易位、倒位以及組織嵌合體；（2）部分CMA技術(shù)（如aCGH）不能檢測三倍體。因此，不能完全摒棄傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)。本研究還對1例染色體核型結(jié)構(gòu)異常的孤立性CCA胎兒進(jìn)行了CMA檢測，不僅進(jìn)一步明確了衍生染色體的來源、異常片段的大小、性質(zhì)以及片段內(nèi)所含的致病基因，而且通過對所發(fā)現(xiàn)的2個(gè)拷貝數(shù)變異片段進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)片段內(nèi)分別包含10個(gè)和62個(gè)致病基因，為進(jìn)一步評估胎兒的預(yù)后提供了依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，CMA技術(shù)在臨床中的應(yīng)用彌補(bǔ)了傳統(tǒng)染色體核型分析的不足，可進(jìn)一步明確異常片段的大小、性質(zhì)、來源以及片段內(nèi)所含的致病基因，為產(chǎn)前咨詢和胎兒預(yù)后評估提供更確切的遺傳學(xué)依據(jù)。三、WES在CCA胎兒中的應(yīng)用CCA是胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的畸形之一。目前已有研究對娩出后的CCA新生兒進(jìn)行WES檢測，鑒定出了部分與CCA相關(guān)的致病基因，但是，妊娠期對CCA胎兒進(jìn)行WES檢測的研究較少。由于產(chǎn)前無法評估胎兒的智力、是否有認(rèn)知功能障礙等表型，而WES的數(shù)據(jù)分析極度依賴表型，因此，在妊娠期對胎兒進(jìn)行WES檢測，建立并完善CCA胎兒的WES分析參考數(shù)據(jù)庫具有重要的意義。本研究對25個(gè)孤立性CCA胎兒核心家系進(jìn)行WES檢測，發(fā)現(xiàn)在CMA檢測結(jié)果未見明顯異常的胎兒中，WES可將孤立性CCA致病性總檢出率額外提高36%（9/25）。本研究中WES的額外檢出率較文獻(xiàn)報(bào)道［5］高，分析原因如下：（1）納入胎兒的例數(shù)及人種不同：本研究中25個(gè)CCA家系行WES檢測，均為孤立性CCA胎兒家系，且均為亞洲人群，而文獻(xiàn)納入的65個(gè)家系中，有11個(gè)為復(fù)雜性CCA，而且均為高加索人。（2）胎CCA類型占比不同：本研究行WES檢測的胎兒中，完全性胼胝體缺如占比92%（23/25），而文獻(xiàn)中納入的完全性胼胝體缺如占比僅為43%，遠(yuǎn)低于本研究；此外，文獻(xiàn)中還納入了29%的短小胼胝體胎兒，而本研究中未納入此類型。（3）納入胎兒的入選標(biāo)準(zhǔn)不同：本研究中所有納入的胎兒均通過胎兒頭顱MRI檢查進(jìn)一步確診，而文獻(xiàn)中僅部分胎兒行MRI檢查；僅靠超聲檢查診斷胎兒CCA存在一定的誤診率，而CCA胎兒的誤診可能會(huì)影響WES的檢出率。本研究中WES在部分性胼胝體缺如胎兒中的檢出率（2/2）明顯高于文獻(xiàn)報(bào)道［5］，考慮與本研究納入的部分性胼胝體缺如胎兒例數(shù)較少有關(guān)，在今后的研究中，需增加樣本量進(jìn)一步研究。本研究對25例CMA檢測陰性的胎兒進(jìn)一步行核心家系WES檢測，9例孤立性CCA胎兒中檢出7個(gè)致病或可能致病基因，其中，PTDSS1基因突變?yōu)楸狙芯渴状螆?bào)道和胎兒CCA相關(guān)。NFIA（c.1112C>A）、TUBB2Bc.538G>A）、ARID1B（c.316_317insTGTA）、ARID1B（c.1601_1605delACCCT）和ARX（c.975delA）基因突變位點(diǎn)均為本研究首次發(fā)現(xiàn)與胎兒CCA相關(guān)。L1CAM（c.2254G>A）及L1CAM（c.176C>T）基因突變位點(diǎn)為本研究首次在孤立性CCA胎兒中報(bào)道。另外，將CMA檢測所得致病性CNV片段中與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的基因與WES檢測發(fā)現(xiàn)的致病或可能致病基因結(jié)果結(jié)合，發(fā)現(xiàn)在2例及以上患兒中出現(xiàn)的基因有3個(gè)，分別為NFIA、L1CAM、ARID1B基因。四、隨訪本研究通過對活產(chǎn)的12例孤立性CCA新生兒進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)僅1例患兒出現(xiàn)精神、運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩，提示孤立性CCA胎兒在排除遺傳學(xué)病因后，大部分預(yù)后良好。五、本研究的局限性首先，本研究樣本量較小，各個(gè)技術(shù)的梯度產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷結(jié)果難免存在偏差。其次，仍有一部分孤立性CCA胎兒未能明確病因?qū)W診斷，后續(xù)可能需要進(jìn)一步開展全基因組測序（wholegenomesequencing，WGS）及表觀遺傳學(xué)研究。最后，本研究中僅12例孤立性CCA胎兒在行遺傳學(xué)檢查后活產(chǎn)，由于隨訪例數(shù)較少，可能對隨訪結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。本研究對孤立性CCA胎兒進(jìn)行了從細(xì)胞遺傳到分子遺傳層面系統(tǒng)、全面的遺